庄涛毕业论文

1、扬州大学本科生毕业论文扬 州 大 学本 科 生 毕 业 论 文毕 业 论 文 题 目：兔肺血管紧张素转换酶的分离提取 姓 名： 庄 涛 所 在 学 院： 食品科学与工程学院 专 业 及 班 级： 食品质量与安全0902班 指 导 教 师： 徐 鑫 副教授 26兔肺血管紧张素转换酶的分离提取姓名：庄 涛 班级：食安0902 指导教师：徐 鑫 副教授摘要：ACE常用于降压药物或高血压研究，但购买商品酶成本高，本实验采用硫酸铵分级沉淀方法分离提取ACE。取新鲜兔肺匀浆离心后，经35%55%饱和度的硫酸铵分级沉淀、透析、冷冻干燥后得到自制酶。聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条带，相对分子质量为165kD。通过

2、液相色谱法实验表明，自制ACE酶存在较强活性，自制的小黄鱼ACE抑制肽对分离得到的兔肺ACE与商品ACE酶的抑制效果相差不大，且活性较为稳定，因此，自制的ACE酶可以直接用于实验室的相关实验。关键词:兔肺 血管紧张素转换酶 分离纯化 活性检测Student: ZhuangTao Class: Food Quality and Safety 0902 Teacher: XU Xin Abstract: ACE is commonly used in the research of antihypertensive medications or high blood pressure. But i

3、t is expensive to buy commodity enzyme. The experiment adopted ammonium sulfate fractionation in the separation of ACE. 170g fresh rabbit lung was homogenated and centrifugated with 35%-55% saturation ammonium sulfate fractionation, dialyzed and freeze-dried. It would obtain 1.0548g homemade enzyme.

4、 Final enzyme preparation on analytical polyacrylamide gel electrophoresis showed one major protein band. The molecular weight estimated to be approximately 165000 dalton by sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis. HPLC experiment showed that the homemade enzyme had activity

5、and there was hardly different on the inhibitory effect by little yellow croaker ACE inhibitory peptide between homemade enzyme and commodity enzyme. And the activity was relatively stable. Consequently, the homemade enzyme could be directly used in laboratory experiments.Keywords: rabbit lung; angi

6、otensin-converting enzyme; separation and purification; activity detection目录1 前 言41.1 高血压及ACE41.2 ACE调节血压的作用机理61.3 ACE的来源及其选择71.4 ACE的分离纯化方法71.5 本研究的目的及内容82 材料与设备92.1 主要试剂和材料92.2 主要仪器设备103 实验方法与步骤113.1 小黄鱼ACE抑制肽的制备113.1.1 制备小黄鱼ACE抑制粗肽113.1.2 蛋白测定123.2 ACE粗提液的制备123.3 硫酸铵分级沉淀133.3.1 硫酸铵的第一次分级沉淀133.3.2

7、 硫酸铵的第二次分级沉淀133.4 透析133.5 冷冻干燥133.6 样品蛋白含量的测定133.7 SDS-PAGE检测ACE粗酶蛋白分布情况134 结果与讨论144.1 蛋白含量的测定结果144.1.1 标准曲线制作144.1.2 小黄鱼样品中的蛋白含量的测定154.1.3 兔肺样品中的蛋白含量的测定164.2 ACE分子量的测定164.2 粗酶浓度的优化174.3 ACE抑制活性的测定175 结论21参考文献21致谢26 1 前 言1.1 高血压及ACE高血压作为一种常见病和多发病，它不仅患病率高，而且常引起严重的心、脑、肾等其他疾病1。随着人们的健康意识的不断增强，研究生产高效安全的降

8、压药物已经成为国内外研究学者积极探索的一项重要课题。人体内血管紧张素转换酶（ACE）活性过高是引起高血压的关键因素。ACE抑制肽能竞争性地与ACE活性中心结合，从而抑制ACE的活性，起到降血压的作用。食物源ACE抑制肽因其安全性高，副作用小，易吸收，成为活性肽研究领域的热点，这些ACE抑制肽在开发具有降血压的功能食品中具有广阔的应用前景2。而要想研发出药效较好的ACE抑制肽药物，那么研发过程中少不了血管紧张素转换酶的参与，因此ACE的应用前景也非常明朗。血管紧张素转化酶（Angiotensin-Converting Enzyme，ACE，EC ）,系统命名为肽酰二肽水解酶3，是

9、一种哺乳动物组织中普遍存在的含锌离子的膜结合外肽酶（羧基端二肽）。它是内皮细胞浆膜的一个组分，由单一肽链组成，含有维持其活性所必需的Zn2+和Cl-4。1954年，Leonard T.Skggs5-6博士从马血浆中首次发现ACE，并发现此酶能催化血管紧张素水解去掉羧基端二肽（His-Leu）生成具有血管收缩作用的血管紧张素。ACE可分为体细胞ACE（sACE）和睾丸ACE（tACE），sACE根据存在状态又可分为组织ACE和血浆ACE。sACE广泛分布于肺动脉内皮细胞上，参与体内的血压调节、电解质及体液平衡7-9。如图1，血浆ACE来源于组织ACE，其含量取决于组织ACE被ACE分泌酶断裂的速

10、率与可溶性ACE的分解速率之间的稳态水平10，人体血浆ACE含量比较低，仅0.4g/mL11。sACE含两个结构域（C端和N端）12，其氨基酸序列相似度近60%，而发挥催化作用的那部分序列相似度达89%，但是他们在底物特异性，抑制剂和氯离子影响作用上存在明显差别13-14。 它在血管紧张素(1-7)15的产生和缓激肽的降解中起关键作用,而后两种多肽在血管张力的调节和血管平滑肌细胞的增生中起作用。图1.血浆ACE调节的原理Fig. 1 The principle of blood plasma ACE adjustment ACE是一种单链多肽酸性糖蛋白16, 它的分子量为110-170kD,

11、活性中心含有锌离子, 属肽酰二肽水解酶,主要分布在肺、肾近曲小管、小肠绒毛和毛细血管上皮细胞17。ACE在血管内皮细胞及不同种类的上皮细胞均有分布，用放射自显影和免疫组化方法标记后发现体内含ACE最高的组织为脑脉络丛以及黑质纹状体通路和基底节区18。血液中也有循环形式的ACE，它可催化血管紧张素水解为血管紧张素(1-7)及二肽（组氨酸、亮氨酸），血管紧张素(1-7)有强烈缩血管的作用并能使缓激肽失活，缓激肽对血管具有和血管紧张素相反的生理学作用，它们共同调节血管张力及血管平滑肌增殖，因而对心血管系统的内环境稳定及对维持血压、水和电解质平衡起重要作用。若这个对立系统的平衡遭到破坏，就会导致心脑血

12、管发生病变19。1.2 ACE调节血压的作用机理 血管紧张素转化酶是肾素-血管紧张素系统（RAS）及激肽释放酶-激肽系统（KKS）中的关键调节剂之一。 肾素-血管紧张素系统20(renin-angiotensin system,RAS)：肾小球旁细胞分泌肾素，肾素是一种蛋白分解酶，它可将血管紧张素原水解释放出血管紧张素（Ang I），再经肺循环中转化酶的作用，水解生成血管紧张素（Ang II）21。血管紧张素作用于中枢，增加交感神经冲动发放或直接收缩血管。也刺激肾上腺分泌醛固酮，引起水钠残留。肾素-血管紧张素-醛固酮系统，可调节细胞外液及血管阻力，血管紧张素及醛固酮是决定血压的重要因素。肾缺血

13、是肾小球旁细胞血流灌注压低，肾素分泌增多，使血压升高22，所以抑制ACE的活性对于降血压具有着积极的影响。 激肽释放-酶激肽系统(Kallikrein-Kinin System,KKS)主要包含激肽释放酶，激肽原和激肽三个组分，参与多种病理生理过程23。激肽释放酶水解高分子量激肽原，得到具有血管舒张作用的缓激肽，而ACE水解缓激肽，使其失活，血压上升。ACE抑制剂通过抑制ACE的活性，可以起到降血压的作用。 其作用机制如图1所示24： 图2血管紧张素酶(ACE)调节血压作用机制Fig. 2 The mechanism of angiotensin-converting enzyme (ACE)

14、 in the adjust of blood pressure 1.3 ACE的来源及其选择 ACE在组织及血浆中广泛存在, 肺毛细血管细胞和血管内皮细胞含量丰富, 其中肺的含量和活性最高25。由于兔肺ACE的各方面特性与人的ACE最为接近，故本实验将从兔肺中提取ACE，用于功能性因子降血压肽的分析检测26-28。1.4 ACE的分离纯化方法 现今，提取纯化ACE的工艺方法主要有硫酸铵分级盐析法、DEAE - Sepharose FF新型离子交换树脂法29 以及亲和层析法30。硫酸铵分级盐析法相比于DEAE - Sepharose FF新型离子交换树脂法省去了DEAE-阴离子交换色谱、CM-

15、羟甲基纤维素阳离子交换色谱和过羟基磷灰石柱等分离纯化步骤；相比于亲和层析法省去了亲和凝胶的制备；同时仪器设备也为实验室的条件所允许，因此本文尝试用刘淑集、王茵等31的硫酸铵分级盐析法分离和提取ACE，并测定其蛋白含量和活性。对于ACE的活力检测，采用液相色谱的测定方法。蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定32。 硫酸铵分级沉淀方法的原理：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利

16、用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 测量蛋白浓度我们选择考马斯蓝亮蓝方法而不是凯氏定氮法是因为前者用于微量蛋白的测定，凯氏定氮相对来说需要的蛋白量比较多。原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。通过绘制标准曲线，再测样品吸光值即可通过标准曲线求的

17、样品中的蛋白含量。如今，检测方法主要有体内和体外检测两种。体外ACE抑制活性的检测主要是测定有/无抑制剂存在条件下ACE催化相应底物，得到产物的量。一般使用IC50值表示ACE抑制剂的抑制活性，抑制物IC50值越小，其活性越高33。大多数采用的是Cushman34的分光光度法35-37以及HPLC法38-40，常用底物为HHL和FAPGG。经典的Cushman法用ACE水解底物HHL，生成产物HA用溶剂乙酸乙酯提取，蒸干溶剂，再溶解，然后在228nm下测定吸光度。其中，底物及残留的提取溶剂会使分析结果偏高。Wu等人41用Cushman法制得HA提取物，然后用液相法分析，结果显示乙酸乙酯提取物中

18、仍含有相当一部分没有反应的底物HHL，且其吸收值占总提取物吸收值的12%。HPLC法可以将底物和产物分离开，精确度高，不需预处理，操作简便，分析时间大大缩短。此外，还有用o-aminobenzoylglycyl-p-nitrophenylalanyl- proline为底物进行荧光法测定42；Guan-Hong Li43提出一种直接分光光度法，原理为：ACE催化HHL产生的HA在喹啉存在条件下与苯磺酰氯（BSC）会产生特异性比色反应，用此法测得卡托普利的IC50值为0.019M，而用HPLC法38测得卡托普利的IC50值为0.0015 g/mL(即0.0069M)，差异较大。近些年还出现了HP

19、LC与生化检测方法及MS分析结合的方法44，可以用以检测复杂的食物样品，这种方法中，分离鉴定和活性测定能一步完成。但是设备投资大，不便普及使用。本实验ACE的活性采用液相色谱方法进行检测，三肽HHL在ACE的催化下快速地分解产生马尿酸(Hippuric Acid)和二肽(His-Leu)。通常通过测定马尿酸的生成量来评价ACE的酶活力。由林琳、周存山等人45的报导知：ACE的最适pH为7.5，对于三肽底物如Phe-His-Leu的最适温度为37，最适pH为8.3，所以在测酶活的时候，将条件控制在水浴温度为37，pH控制在8.3。酶活力单位定义为：1个酶活力单位(U)是指在37的条件下, 催化形

20、成1mol马尿酸所需的酶量；比活力定义：每毫克蛋白质所具有的酶活力(U/mg)。1.5 本研究的目的及内容本文以兔肺ACE的活性和标准ACE活性的比较为主要评价指标，从而给兔肺ACE以定性的评价。鉴于分离纯化的样品ACE是用于研究ACE抑制肽，所以最终得到的样品中ACE的纯度要足够纯，否则对研究造成一定的影响，以致于研发出的ACE抑制药物的药效不能达到预期效果。 研究内容主要有：（1）以小黄鱼鱼肉为原料酶解法制取ACE抑制肽；（2）兔肺血管紧张素转换酶的提取分离纯化；（3）用高效液相色谱检测样品中ACE活性。 2 材料与设备2.1 主要试剂和材料马尿酸（HA）Sigma公司产品，美国马尿酰组氨

21、酰亮氨酸(HHL)Sigma公司产品，美国盐酸国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠国药集团化学试剂有限公司甲醛国药集团化学试剂有限公司新鲜兔肺扬大兽医学院硼酸国药集团化学试剂有限公司氯化钠国药集团化学试剂有限公司硫酸铵国药集团化学试剂有限公司氯化钡国药集团化学试剂有限公司甲醇（色谱纯）J&K SCIENTIFIC LTD.次高分子量(43-200kD)标准蛋白质上海生物化学研究所聚丙烯酰胺道氏化学公司，美国甲叉丙烯酰胺道氏化学公司，美国TEMEDSigma公司产品，美国过硫酸铵(AP)国药集团化学试剂有限公司2.2 主要仪器设备高速冷冻离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司高速组织捣碎机上海人和

22、科学仪器有限公司UV-2100型分光光度计尤尼科（上海）仪器有限公司数显恒温搅拌循环水箱HH-60国华仪器有限公司微型漩涡混合仪上海沪西分析仪器厂有限公司移液枪10-1000LDargon公司超声波清洗器昆山超声仪器有限公司反相高效液相色谱仪日本岛津公司Mini-PROTEAN Tetra Cell小型垂直电泳槽Bio-Rad Laboratoies托盘天平上海医用激光仪器厂分析天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司FlveEosy pH计METTLER TOLEDO公司冷冻干燥机，Alphal-2 LD Plus德国Christ公司电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验设备有限公司3 实验方法与步骤3

23、.1 小黄鱼ACE抑制肽的制备3.1.1 制备小黄鱼ACE抑制粗肽称取15g鱼肉加85g双蒸水，用底物浓度为3g蛋白/100mL，E/S=2，6mg胰蛋白酶，分别酶解至2、4、6、8、10h。将各样品放入沸水浴中灭酶15min。将沸水浴灭酶后的溶液加入离心管中，在10000r/min，4下离心30min，即可得2、4、6、8、10h的粗肽溶液。3.1.2 蛋白测定 试剂配制1.考马斯亮蓝试剂：配制成含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G-250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2.标注蛋白质溶液：纯的牛血清蛋白和0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋

24、白溶液。稀释成不同的倍数。测吸光值，制作标准曲线。 标准曲线制作表1 标准曲线数据表Table 1 Data sheet of the standard curve试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.15mol/L NaCl （ml）考马斯亮蓝试剂 （ml）5555555摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm以吸光值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10g、20g、30g、40g、50g、60g），在坐标轴上绘制标准曲线。 样品蛋白含

25、量的测定 用0.15mol/L NaCl将各样品稀释40倍，加入5mL的考马斯亮蓝，在595nm条件下测定各样品的吸光值。根据标准曲线计算得出样品中的蛋白含量。3.2 ACE粗提液的制备 将新鲜的兔肺洗净，去除大的血管、脂肪，切成小块，得到170g兔肺组织。为了使兔肺组织能够被更好地捣碎，将样品分批进行处理，每批20g，将处理好的兔肺组织放入烧杯中，并加入预冷的200mL的pH 8.3的硼酸缓冲液（含0.3mol/L NaCl），用组织粉碎机绞碎摇匀，重复九次，最后再用缓冲液将烧杯杯壁上的残留物洗入处理液中，放入冰箱中冷藏静置5h使浸提物充分溶解。在4、10000r/min离心20min，得上

26、清液1800mL。取1mL上清液于1.5mL的离心管中，放入冰箱中冻藏，以备测蛋白质含量和酶活。3.3 硫酸铵分级沉淀3.3.1 硫酸铵的第一次分级沉淀冰浴条件下向上清液中缓慢加入35%饱和度的硫酸铵，边加边缓慢搅拌，防止大量泡沫产生使蛋白质变性。将混合液放入冰箱中静置5h左右后，于4、10000r/min下离心20min，取上清液。3.3.2 硫酸铵的第二次分级沉淀冰浴条件下在离心后的上清液中缓慢加入55%饱和度的硫酸铵，边加边缓慢搅拌，防止大量泡沫产生使蛋白质变性。冰箱中静置12h左右，在4、7000r/min下离心10min，收集沉淀，用适量的预冷的pH 8.3的硼酸缓冲液（含0.3mo

27、l/L NaCl）溶解。3.4 透析将沉淀溶解液装入干净的截留分子量为14000±2000的透析袋，并用透析袋夹夹好，放入硼酸缓冲液(含0.3mol/L NaCl)在4透析，间隔更换透析液，以10%（W/W）的BaCl2为检测液，直至透析液中无SO42+存在。3.5 冷冻干燥 将透析得到的酶液分装与4个小坩埚中，放入0冰箱中冷冻，冻结后再放入-20冷冻箱中冷冻1h，再转移入-70超低温冰箱中冷冻1h，最后进行冷冻干燥，即可得粉末状的样品。称得质量为1.0548g。3.6 样品蛋白含量的测定 将待测样品进行一定的稀释，其中粗提液、一次沉淀清液和二次沉淀清液稀释200倍，透析液稀释40倍

28、。根据标准曲线计算得出样品中的蛋白含量。3.7 SDS-PAGE检测ACE粗酶蛋白分布情况 用12%的分离胶和3%的浓缩胶制胶，待胶凝固后，将透析液和粗提液进样，接通电源，在78V、53mA下，使进样全部通过浓缩胶，再在150V、96mA下，通电1h。待样品跑好后进行染色和脱色。3.8 ACE抑制活性的测定称取3.4mg粗酶，按商业酶5.35U/mL固体计算，即含18.19U。加入87.2LHEPES缓冲液（50mmol/L,含300mmol/LNaCl），溶解得39mg/mL自制ACE酶液。用HEPES缓冲液（50mmol/L,含300mmol/LNaCl）稀释自制酶液得13mg/mL自制A

29、CE酶液，其酶活力为6.06U。取上述自制ACE酶液10L，同时取0.1U/mL的商业酶10L做空白试验，和80L HEPES缓冲液（50mmol/L,300mmol/LNaCl）混合置于37下水浴5min，然后于同一温度下加入80L的HHL溶液水浴反应30min，最后在混合体系中加入200L HCl（1mol/L）终止反应，样品经0.22m的滤膜过滤后进样。分别用10L的商业酶和自制酶与80L的2、4、6、8、10h的粗肽混合置于37下水浴5min，然后于同一温度下加入80L的HHL溶液水浴反应30min，同时用10L和80L的HEPES缓冲液（50mmol/L,300mmol/LNaCl）

30、代替酶液和HHL溶液做对照试验，最后在混合体系中加入200L HCl（1mol/L）终止反应，样品经0.22m的滤膜过滤后进样。色谱条件：Intertsil ODS-SP柱（4.6×250mm，5m）；流动相：50%甲醇（甲醇/超纯水，1:1）,其中包含0.1%三氟乙酸（TFA）；流速：1mL/min；检测波长：228nm；柱温：25；检测时间：20min；进样量：10L；定量方法：外标法。抑制率计算公式如下：抑制率I（%）=（A-（B-C）/A ×100% A为抑制剂不存在的条件下ACE与HHL反应的混合物中马尿酸的峰面积； B为抑制剂存在的条件下ACE与HHL反应的混合

31、物中马尿酸的峰面积； C为抑制剂存在且不添加ACE条件下在马尿酸出峰位置相关肽的峰面积。4 结果与讨论4.1 蛋白含量的测定结果4.1.1 标准曲线制作根据考马斯亮蓝法进行标准曲线的绘制，所得结果如下：表2小牛血清白蛋白吸光度Table 2 Calf serum albumin spectrophotometry编号蛋白浓度ug/ml吸光度（595nm）1100.1032200.1883300.2834400.3605500.4616600.524根据上述数值绘制标准曲线如图2:图3小牛血清白蛋白标准曲线Fig.3 Standard curve of calf serum albumin co

32、ncentration 回归方程为y=116.34x-2.284，R2=0.9975，表明蛋白浓度在0-60ug/ml范围内，其浓度与吸收度线性关系良好。4.1.2 小黄鱼样品中的蛋白含量的测定各组分样品进行稀释按照考马斯亮蓝法进行吸光度的测定，再根据公式y=116.34x-2.284进行计算，最终蛋白质含量（%）=n×y，其中n为稀释的倍数，所得结果如下：表3 各组分的蛋白含量Table 3 Protein content of the various components样品吸光值平均值蛋白浓度（mg/ml）2h0.3860.3840.3860.3850.8524h0.3230.

33、3260.3250.3250.7116h0.2820.2840.2850.2840.6168h0.2870.2850.2830.2850.61910h0.2560.2560.2540.2510.5394.1.3 兔肺样品中的蛋白含量的测定表4 各组分的蛋白含量Table 4 Protein content of the various components样品吸光值平均值蛋白浓度（mg/ml）粗提液0.5210.5200.5210.52111.673一次沉淀清液0.3490.3560.3570.3547.795二次沉淀清液0.2200.2220.2230.2224.716透析液0.1400.1

34、440.1420.1420.5724.2 ACE分子量的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示一条带，可见经硫酸铵分级沉淀方法分离提纯达到了电泳纯，如图4，第3组条带中圈内条带即为目标带，且ACE分子量约为165kD。图 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳测定ACE粗酶Fig. 4 SDS-PAGE identification of ACE4.2 粗酶浓度的优化 通过做0.06mg/mL、0.12mg/mL、1.2mg/mL、13mg/mL和39mg/mL的粗酶做空白试验，发现只有13mg/mL和39mg/mL的粗酶下的峰和商品酶活性相一致，且39mg/mL的粗酶的峰效果更好，从而用39mg/mL的粗酶做小黄鱼A

35、CE抑制肽的体外活性测定。4.3 ACE抑制活性的测定本论文采用高效液相色谱法来检测自制酶ACE的活性。根据实验设计对我们所得的5个抑制肽组分对商品酶和自制酶抑制活性进行测定，得到抑制率较好的实验结果相应的色谱图如下：图5 商品酶与HHL反应的空白对照组Fig. 5 commodity enzyme reaction with HHL blank control group 图6 商品酶与抑制肽反应组Fig. 6 commodity enzyme and inhibitory peptides reaction group图7 自制酶与HHL反应的空白对照组Fig. 7 homemade en

36、zyme reaction with HHL blank control group图8 自制酶与抑制肽反应组Fig. 8 homemade enzyme and inhibitory peptides reaction group图9 抑制肽对照组Fig. 9 inhibitory peptides reaction group三肽HHL在ACE的催化下快速地分解产生马尿酸和二肽His-Leu(简称HL)。当加入ACE抑制肽的样品时，ACE的活性受到抑制，马尿酸和二肽的生成量减少，因此可通过HPLC测定马尿酸的生成量来评价ACE抑制肽对ACE活性的抑制率。对比图5和图6、图7和图8，我们可以

37、看出来加入ACE后，图6和图8中产生了大量马尿酸，而图9未加ACE，马尿酸产生很少，所以自制ACE酶具有活性。通过图7与图5对比，说明自制ACE没有杂峰，也说明提取的ACE所含杂质较少，再与空白组比较则可求出各组分对ACE的抑制作用。各组分经反应体系后，过反相高效液相色谱测出各组反应的峰面积，按照公式计算抑制肽对商品酶和自制酶的抑制率，通过数据绘得抑制肽对商品酶和自制酶抑制率的柱形对比图，如图10：图10 抑制肽对商品酶和自制酶的抑制率Fig. 10 inhibitory peptides enzyme inhibition rate on commodity enzyme and homem

38、ade enzyme如图10，第1组为2h抑制肽对商品酶和自制酶的抑制率，依次往下：2、3、4、5分别为4h、6h、8h和10h抑制肽对商品酶和自制酶的抑制率。随着酶解时间的延长，小黄鱼ACE抑制肽抑制率越高，这一结果与Mullally等46报道的结果相一致。从图10上可看出，自制抑制肽对商品酶和自制酶同时有抑制作用，说明自制粗酶具有一定的活性，可以用于实验室的其它关于体外活性测定等实验。同一组实验中商品酶的活性抑制率稍低于自制酶的活性抑制率，而在同一浓度的抑制肽的作用下，抑制率越高表明酶的活性越低，故自制酶的质量与商品酶的质量存在一定的差距。5 结论经过上述分析可知，兔肺ACE经硫酸铵分级沉

39、淀分离，13mg/mL自制ACE酶液，可以发挥6.06U/mL商品酶的活性。且提取的ACE性质与商品ACE相同，仅纯度和活力稍低，但是不影响其对于降血压肽ACE抑制活性的检测。因此可以将自制的ACE用于体外ACE抑制肽的活性检测。参考文献1夏镇波. 酪蛋白源血管紧张素转换酶抑制肽制备及分离纯化研究D.南京农业大学.2008.2黎观红. 食物蛋白源血管紧张素转化酶抑制肽的研究D.江南大学，2005.3Christos G.Papadimitriou, Anna Vafopoulou-Mastrojiannaki, Sofia Vieira, et al. Identification of pe

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