流式细胞仪操作规程sop

1、流式细胞仪操作规程目录1：淋巴细胞亚群测定2：HLA-B27测定3：CD55CD59测定4：血小板抗体测定5：红细胞抗体测定6：粒细胞抗体测定 7：白血病免疫分型测定8：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4测定9：XL操作步骤淋巴细胞亚群测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 淋巴细胞亚群测定(CD系列)方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼

2、库尔特)原理： 双/三色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD5+，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数。标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉

3、采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温

4、5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管

5、关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）报告结果 报告百分数（和绝对值）操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03临床意义1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，

6、在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。临床常用ThTs比值来判断病人的免疫状况。ThTs比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。ThTs比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合

7、征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。方案（Protocol） HLA-B27测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： HLA-B27测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，

8、与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格

9、贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型

10、对照(IgG2a-FITCIgG1-PE)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）报告结果 报告阴阳性操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 阳性：HL

11、A-B27阳性而HLA-B7阴性细胞的平均荧光强度在8.0以上。 临床意义HLA复合体位于第6号染色体的短臂上，该区DNA片段长度约3000-4000KB，占人体整个基因的1/3000，HLA-B27是HLA-I类基因中B位点上的一个等位基因，与多种疾病具有相关性，尤其是强直性脊柱炎。方案（Protocol） CD55/CD59测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室：

12、CD55/CD59测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 双色直接免疫荧光法。近年的研究表明，红细胞和白细胞膜上CD55和CD59分子的表达量和缺乏表达细胞的数量对PNH诊断和鉴别有重要意义。血细胞(红细胞和白细胞)通过膜上的抗原分子与荧光素标记的CD55或CD59的多克隆抗体结合。用流式细胞仪检测CD55或CD59表达阳性细胞百分数。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3溶血样本不能用。 试剂 品

13、牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备:(一)白细胞CD55CD59检测1准备2支流式细胞仪

14、专用管，分别标记。分别向二管中加入样品100ul。2溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）3离心后分别加入CD55/CD59 10ul和相应的同型对照10ul。避光20-30分钟。4洗涤离心 5上机测样(二)红细胞CD55CD59检测 1准备2支流式细胞仪专用管，分别标记 2分别加入CD55CD59 10ul和相应的同型对照10ul。 3向二管中加入1：

15、200稀释的样品100ul（可根据红细胞的数量调整），避光20-30分钟。 4洗涤离心。5混匀、上机测样。 报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 CD55>97% CD59>97% PNH的临界值：RBC CD59>95% WBC CD59>90% PNH的诊断值：RBC CD59>91% 大部分>80% 中性粒细胞CD59>84% 临床意义用于AA和PNH的诊断和分型诊断。PNH时CD55和CD59明显减低和缺如。方案（Protocol） 血小板膜表面抗体测定(流式细胞仪) 医院

16、检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共2页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 血小板膜表面抗体测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经离心富集的血小板中，与血小板膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂

17、 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内完成，冷冻的标本或已固定的标本不能用。 3样本血小板计数应在150-450×109/L之间。若>450×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<150×109/L，应多采集进行富集达到流式检测的细胞数。 4溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体

18、5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 富集血小板法：1）800r/min*15min,取上清，2）加45ml鞘液，2000r/min*3min,弃上清，重复一次。3)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)4)分别向试管中加入准备好的10u1含血小板的PBS（血小板的量约为106）（血小板若在正常范围，稀释

19、到原量直接取10u1。）。5)混匀，避光，室温孵育20-30分钟6)洗或不洗，上机测样全血法：1）加45ml鞘液，1500r/min*15min,弃上清，后同上3）6）报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 IgA<2.98% IgG<3.04% IgM<3.0% IgD<2.91% 临床意义为免疫性血小板减少性紫癜(ITP)诊断、治疗、预后估计的重要指标，在ITP、胶原性疾病时升高。方案（Protocol） 红细胞抗体测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共2

20、页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 红细胞膜蛋白结构测定（红细胞抗体）方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到全血中，与红细胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤(和固定)等步骤后，在流式细胞仪上进行分析。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本

21、应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra

22、操作： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血（1：200稀释后）。3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟4)上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 IgA<2.78% IgG<2.98% IgM<2.52% IgD<2.88% 临床意义自身溶血性贫血的分型诊断方案（Protocol） 粒细胞抗体测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共2页) 本规程每2年复审一

23、次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： 粒细胞抗体测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。FITC标记的各型多克隆抗体，加到经溶血处理后的样本中，与粒系胞膜上的相应的IgG-Fc片段结合，经过洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本

24、不能用。 3 样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 4溶血样本不能用。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 联科成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在

25、有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 1) 溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）2)分别向已编好号的试管中加入10 ul单克隆抗体和同型对照(IgG-FITC)2)分别向试管中加入经溶血处理得样本100u1。3)混匀，避

26、光，室温孵育20-30分钟，洗涤离心4)上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 IgA<2.68% IgG<2.66% IgM<2.49% IgD<3.4% 临床意义白细胞减少症的分型诊断，大多数白细胞减少症患者抗体为阳性方案（Protocol） 白血病免疫分型测定(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者：

27、检验科 主任： 检验科 实验室： 白血病免疫分型测定方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)原理： 三色直接免疫荧光法。正常血细胞的分化成熟过程中，细胞膜、细胞浆有抗原的表达与血细胞的分化发育阶段密切相关，因此这些抗原的表达与否可作为鉴别细胞和其分化阶段的基础。利用荧光素标记的单克隆抗体对血液或骨髓进行染色，通过FCM对白血病细胞细胞膜和细胞浆抗原进行分析，由此了解所测白血病细胞的系列属性及其分化程度。三色染色在白血病免疫分型中较为常用。根据分型需要，选择相应抗原的标记抗体，一般FITC标记抗体和PE标记抗体搭配为一组，再加PC5标记抗原CD45单克隆抗体，共三种抗体加入

28、一管标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。 采集部位 腰穿采骨髓抗凝剂 肝素抗凝 要求 1样本量至少3ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。4溶血样本不能用。试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 28 2：全血溶血试剂 液体 A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C

29、：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：IntraPrep Permeabilization Reagent 成分1（固定剂） 液体 5ml 室温 成分2（透膜剂） 液体 5ml 室温4：鞘液 液体 20L 室温 5：清洗液 液体 5L 室温 6：荧光微球 液体 10ML 2-8 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作-样本制备： 细胞膜表面抗原1首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。2首

30、先每管中加入5ul CD45-PC5抗体。3然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)4各管中加入标本(骨髓或外周血)30100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光2030分钟。5溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER QPREP制备系统开机-显示READY灯亮-选择35SEC灯亮-开门-放入试管关门-自动进行溶血-显示READY灯亮-开门-取出试管-再进行下一个样品测定。（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）细胞浆和核抗原1准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。2首先

31、每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。3每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。4各管中加入PBS4ml。5300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。(1500r/min*5min)6各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。 7加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。8各管中加入4mlPBS，振荡混匀。9300g离心5分钟后，弃去上清液。10各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11上机测样报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV

32、<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 参考值 CD34+<5% MPO+<5% 粒系<20% 淋系<30%临床意义用于血液病的诊断和分型诊断方案（Protocol）T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4检测(流式细胞仪) 医院检验科操作规程文件号：200 年 月 日起实施第1版(共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： T细胞亚群细胞内因子IFN-/IL-4检测方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克

33、曼库尔特)原理： 直接免疫荧光法。肝素钠抗凝全血在PMA，Ionomycin和Monensin存在下短期培养(辅助性T细胞通过细胞因子IFN-、IL-4的产生分为Thl、Th2两个亚群。淋巴细胞活化以后才分泌细胞因子，且迅速分泌到细胞外。因此，利用刺激剂PMA+Ionomycin体外激活淋巴细胞，然后用蛋白转运抑制剂Monensin阻止细胞因子分泌到细胞外，使细胞因子在细胞内滞留到一定的量)，然后进行细胞膜表面抗原和细胞内细胞因子染色，使用流式细胞仪对CD4+细胞内的IFN-和IL-4进行测定。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血抗凝剂

34、EDTA或肝素抗凝血 要求 1样本量至少1ml。 2样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。 3样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4溶血样本不能用。试剂 淋巴细胞培养体系(自配) 成分：刺激素PMA、离子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 选白美国SIGMA公司。 单克隆抗体 CD4PC5、IL-4-PE、IFN-FITC选自美国BeckmanCoulter公司。 质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-

35、8保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 操作： 细胞培养与染色 取200ul抗凝血加入lOul CD4-PC5单抗，室温避光孵育30分钟，RPMIl640洗涤一次，将细胞加入培养体系中，5C02 37孵育18小时，取出后以PBS洗一次。用专用细胞内因子试剂进行细胞固定、透膜。将细胞分成两管，其一为测定管加入抗人IL-4-PE和IFN-FITC，另一管加入同型对照，室温避光20分钟，PBS洗涤一次，待测。流式细胞仪测定 打开流式细胞仪及氩激光光源(488nm)预

36、热20min，同时仪器自动初始化；用标准荧光微球校正光路和流路，然后依次检测标本，每份标本检测50000以上细胞，在前向散射光(FS)和测向散射光(SSC)散点图中圈定淋巴细胞群，然后分析CD4阳性细胞中IL-4-PE和IFN-FITC的表达。 淋巴细胞在FSSSC散点图中位置，即A门内细胞； A门内CD4阳性细胞，即B门内细胞； B门内TH细胞亚群分布： 1区数值-Th 1细胞 (%) 4区数值-Th 2细胞 (%) 2区数值-Th 0细胞 (%)报告结果 报告百分数操作性能 精密度 批内五次重复CV<2 灵敏度 5001000个荧光素分子 正常参考值 Thl(IFN-)：17.39&

37、#177;5.52% Th2(IL-4)：1.50±0.44% ThO ：0.51±0.26% 临床意义淋巴细胞均分泌多种细胞因子：Thl细胞主要分泌IL-2，IL-12，IFN-和TNF-ba等，Th2细胞主要分泌IL-4IL-5IL-6，IFN-为Thl最特异分泌的细胞因子，IL-4为Th2最特异分泌的细胞因子，所以可根据分泌的细胞因子来区分Thl与Th2。Thl为IFN-+，Th2为IL-4+。静息状态(人的正常生理状态、即未受到任何刺激下Th0分化为Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中仅含有极少量的Thl和Th2细胞，这时我们所能检测的胞内的IFN-和IL-4也微

38、乎其微。当Th细胞受到外界因素，如刺激素、病原体等刺激，其中Th0即会向Thl或Th2大量分化，此时我们检测到的IFN-和IL-4也较多。本实验的检测实际上是检测Th细胞对刺激素刺激的反应能力。方案（Protocol） 细胞周期检测1. 细胞制备和染色: -收获细胞并PBS洗涤,10*4-6个,染色过程之前要经过100-300目滤网过滤,离心弃上清待用;-使用BECKMAN COULTER DNA-PREP 试剂盒(LPR:打孔固定溶血; DNA STAIN: PI,RNAase):上述细胞内加入LPR 100 ul,室温避光20 MIN,再加入DNA STAIN 1000 ul,室温避光20

39、 MIN,上机检测.-使用酒精固定和PI: 上述细胞内加入70%预冷酒精,4 C过夜; 离心弃上清后加入PI工作液室温避光30MIN. 2. 从PROTOCOL中找出DNA CONTENTS第十三单元 兽医外科学与手术学新增试题A1型题：每一道考题下面有A、B、C、D、E五个备选答案，请从中选择一个最佳答案。1可用于黏膜消毒的消毒剂是【 】 A碘酊 B酒精 C新洁尔灭 D来苏儿 E碘伏2黏膜等特殊部位使用液体冲洗去除各种污垢，可选用的消毒药物是【 】 A2煤酚皂 BO5新洁尔灭 C01雷佛奴耳 D碘酊 E双氧水3消毒指的是【 】 A抑菌 B灭菌 C抗菌 D杀菌 E灭菌和抗菌4在原发性病原微生物

40、感染后，经过若干时间又并发它种病原菌的感染，称为【 】 A单一感染 B混合感染 C继发感染 D再感染 E隐性感染5高压蒸汽灭菌时，常用的蒸汽压力为【 】 A05kgcm2 B115kgcm2 C5kgcm2 D15kgcm2 E10kgcm26在治疗外科感染中使用的过氧化氢的浓度是【 】 A3 B6 C10 D15 E207处理感染创口使用的高锰酸钾的浓度是【 】 A02 B05 C1 D2 E38在外科感染中，原发性病原微生物感染后，经过若干时间又并发同种病原菌感染， 称【 】 A单一感染 B继发性感染 C再感染 D混合感染 E隐性感染9下面不是外科感染中常见的化脓性致病菌的是【 】 A破伤

41、风杆菌 B葡萄球菌 C链球菌 D大肠杆菌 E绿脓杆菌10适宜大肠杆生长的pH范围是【 】 A3040 B4050 C506O D6O7O E7O8011在任何组织或器官内形成外有脓肿膜包囊，内有浓汁滞留的局限性脓腔称为【 】 A血肿 B脓肿 C淋巴渗出 D蜂窝织炎 E痈12脓肿治疗中，当脓肿出现明显波动时，应给予的治疗是【 】， A抗生素治疗 B超短波治疗 C手术切开 D温热疗法 E封闭疗法13下面不是全身化脓性感染的是【 】 A败血症 B脓血症 C毒血症 D脓毒败血症 E蜂窝织炎14下面属于良性肿瘤的是【 】 A骨肉瘤 B淋巴肉瘤 C肾母细胞瘤 D皮肤乳头状瘤 E神经细胞瘤15良性肿瘤的特征是【 】 A以浸润