immobilized enzyme and cells

1、知识点:1.酶和活细胞的固定方法(包括游离酶、微生物、动物细胞和植物细胞）。2.辅酶和辅基的固定 。3.固定化酶的性质4.固定化对酶反应系统的影响5.固定化酶和固定化细胞的应用1 酶和活细胞的固定方法1.1 固定化酶与固定化细胞的优缺点 1.1.1固定化酶: 固定化酶的研究已取得大量重要成果发挥着巨大作用，受到人们极大的关注。其重要原因是它和水溶性酶比较具有以下优点：(1)极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺残留，简化了提纯工艺.(2)可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道可以在较长时间内反复使用，

2、有利于工艺的连续化、管道化。化。(3)酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化。(4)在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。在绝大多数情况下提高了酶的稳定性。(5)较能适应于多酶反应。较能适应于多酶反应。(6)酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低。本低。 固定化酶也存在一些缺点：(1)酶固定化时酶的活力有所损失。同时也增加了固定化的成本，使工厂开始投资大。(2)比较适应水溶性底物和小分子底物。(3)与完整细胞比较，不适于多酶反应，特别是需要辅因子的反应，同时对胞内酶需经

3、分离后才能固定化。 1.1.2固定化细胞 固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的。它的优点如下:(1)省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。省去了酶的分离手续为多酶系统，无须辅因子再生。(2)细胞生长快、而且多、反应快。细胞生长快、而且多、反应快。(3)可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分可以连续发酵，节约了成本，而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物离去细胞，能一边徘出发酵液，一边进行培养，排除了产物抑制和消耗。抑制和消耗。(4)保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对保持酶在细胞内的原始状况，增加了酶的稳定、特别是对污

4、染因子的抵抗力增加。污染因子的抵抗力增加。固定化细胞同时也存在些缺点： (1)必须保持菌体的完整，防止菌体自溶，否则，将影响产品纯度。 (2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解，同时，需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成。 (3)细胞膜、壁会阻碍底物渗透和扩散。 1.2酶的固定化方法酶的固定化方法有：吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法吸附法；共价键结合法；交联法；包埋法.如下图:1.2.1 吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。(1) 物理吸附法: 通过氢键、疏水作用和通过氢键、疏水作用和电子亲和力等物电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上从而制成固定化酶理作用，将酶固定于水不溶

5、载体上从而制成固定化酶。常用的载体有： 有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维索作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的r淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。(2)离子交换吸附法: 这是将酶与含有离予交换基的水不溶载将酶与含有离予交换基的水不溶载体相结合而达到固定化的

6、一种方法。体相结合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)纤维素、DEAE葡聚糖凝胶、Amberlite IRA93、410、900等。阳离子交换剂基，如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。DEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-SephadexA25充分溶胀用05mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.07.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为2

7、5umol/m1h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE纤维素。 此外，DEAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。 通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能通过酶蛋白化学修饰来增加蛋白质分子上电荷能有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸有效的克服吸附法制备的固定化酶在使用过程的解吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用

8、DEAE纤维素和DEAEScphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋对蛋白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。白质吸附来说，随温度的升高吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都影响对酶的吸附。 吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使

9、用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。1.2.2 包埋法包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂剂(包括交联剂包括交联剂)的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化到固定化。包埋法操作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物

10、可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。(1)凝胶包埋法 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。聚丙烯酰胺凝胶包埋法聚丙烯酰胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(加速剂)，同时，加入1过硫酸钾(引发剂)，混合，于25T：保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状

11、固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。 聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量聚丙烯酰胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克蛋白质为甚，如果调整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。服。辐射包埋法辐射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中在常温或低温下，用x射线、Y射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X射线引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年HMaeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或稍微疏水性的玻璃化载

12、体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于般生物物质的固定化。这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，曾称这种方法为粘附法。这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的活性。可以使用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。其他凝胶包埋法。其他凝胶包埋法。 a.淀粉凝胶包埋法淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。，为增强机械强度和重新水合可加入定量的甘油。胶原有纤维性，易成膜，能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种次级键与酶分子相互作用

13、，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。或者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶胶原复合物便在电极上沉淀。 c.卡拉胶包埋法卡拉胶包埋法：卡拉胶(KCarrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将100gx酶在3750溶于水中，又将1.7g卡拉胶在40一60溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷全10，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。 d.天然血纤维包埋法天然血纤维包埋法：血纤维不会引起抗体形成，且无毒。在柠檬酸缓冲

14、液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白的谷氨酰胺残基之间发生交联而将酶固定化。e.大豆蛋白包埋法大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60用碳酸镁处理使其凝结，过滤制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化从而制得固定化葡萄糖异构酶。 (2)微囊化法微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触从而增加了酶的稳定性同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微囊一般直径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体

15、积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞. 因此，此法在医疗上极为有用。例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。界面沉淀法界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，

16、从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造细胞”制备：25ml 10%血红蛋白水溶液(内含适当酶、界面聚合法界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇)用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶剂疏水单体(如多异氰酸)溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化 这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜内。例如用含酶的10血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1Span85的氯

17、仿-环已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(有机相)后，便在油-水界面发生聚合反应，弃除上清液，加入Tween-20去乳化,洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固定化酶。液体干燥法液体干燥法。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。它是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中加入酶液后，加入油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有保护性胶质如明胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化.在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。红血球包埋法红血球包埋法。在高渗溶液中红细胞膨

18、胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出来.脂质休包埋法。脂质休包埋法。上述微囊法是一种半透性膜将酶包埋，近年来采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。例如将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于氯仿中再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中，在氮气下32转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气气流中4用音波处理10s，在室温下保持2h，过Sepharose 6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处理，并过Sepharose 6B柱，可得含酶的微囊。这种微囊液膜当底物产物穿过时、与膜的径无关

19、但与产物或底物对膜成分的溶解度有关。1.2.3 共价键结合法共价键结合法 共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的共价键结合法是酶蛋白的侧链基团和载休表面上的功能基团之间形成共价键而固定的方法功能基团之间形成共价键而固定的方法。其优点是：酶与载体结合牢固，酶不易脱落，但反应条件较激烈，酶易失活，同时，制作手续亦较繁琐。(1) 酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：酶蛋白N端的M氨基或赖氨酸残基的-氨基。酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。Cys残基的巯基。Ser、Tyr、Thr残基的羟基。Phe和Tyr残基的苯环。His残

20、基的咪唑基。Trp残基的吲哚基。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。(2)载体的选择载体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定一般亲水载体在蛋白质结合量和固定化酶活力及其稳定 性上都优于疏水载体。性上都优于疏水载体。载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。载体结构疏松，表面积大，有一定的机械强度。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载体必须有在温和条件与酶共价结合的功能基团。载休没有或很少有非专一性吸附。载休没有或很少有非专一性吸附。载体

21、来源容易便便并能反复使用。载体来源容易便便并能反复使用。 (3)偶联反应 酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定性作用，必须考虑到酶的偶联效率固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。现介绍如下：重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH89)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。 可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与

22、酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：a.多糖类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-硫酸脂乙砜基胺(ABSE)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼脂及淀粉)属于此类载体。在碱性条件下用对硫酸脂乙砜基胺话化多糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：b.氮基酸共聚体。如LLeu和对氨基DL苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的LLeu和对氨基DLPhe的N羧基酐的苯溶液在少量水存在及室温下进行反应制成。共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为bioGe

23、l或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经重氮化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶。d.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍生物:此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合产生固定化酶。 芳香烃化反应 具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，可以通过烷基化、芳香基化，

24、在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应，如： a.将纤维素在二恶烷(Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：常用载休有卤乙酰、卤异丁烯衍生物，如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。b.纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反应，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶。 与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4，6-二硝基苯。控制pH7，使它勺酶分子的氨基反应，产生固定化酶。c.四元缩合反应 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反应，形成N取代的酰胺。在反应中，羧酸(R

25、1)和胺化合物(R2)形成酰胺键，醛(R3)和异氰酸(R4)结合形成酰胺氮的侧链： 当选择适当条件，适当的载体及控制反应液中的添加物，可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基，将酶固定并免除有害反应。例如：在乙醛和小分子的3(二甲氨基)丙基异氰酸存在下，用0.5mol/L HCl维持pH6.5，搅拌反应6h，用带氨基的聚合物，可以与酶分子的羧基偶联。而带COOH的高聚物在醛和异氰酸存在下，可与酶分子的NH2偶联。 d.巯基二硫基交换反应 带有SH或二硫基的载体，通过巯基二硫基的交换反应，和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为SH时，可先用2，2二吡啶二硫化物处理，生成的二硫基中间产物在酸性条

26、件下能与酶分子的巯基发生交换反应，从而产生固定化酶。此法通过小分子巯基化合物的运转，使载体可以再生：e.金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h，洗除末反应的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可将酶固定化。如： f.缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化酶。般在弱酸条件下(pH4.755)将酶、羰二亚胺、载体同时混合，羰二亚胺与载体的羧基反应生成活泼的O乙酰异脲衍生物，与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。 例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物为载体用缩合法制备固定化胰蛋白酶。

27、0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH调pH6.5，加入1.95g丙烯酰胺和0.1g N，N甲叉双丙烯酰胺，再加入0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液，使体积为10m1，加入25mg过硫酸铵和22ulN，N，N，N，N四甲基乙二胺，抽真空除气泡，4聚合30min，压挤成粒，搅拌下水洗丙酮干燥备用。 70g干胶在20m10.5mol/L HCl中搅拌30min，用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗涤后转至小烧杯，加入3.5ml 0.1mol/L pH65磷酸缓冲液的8.75mg胶原蛋白酶后，搅拌5min，接着加1环己基3(2吗啉乙基)羰二亚胺甲基对甲苯磺酸，连续搅拌18h，洗涤

28、后即为固定化酶。g.叠氮反应 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。 此法常用载体有羧甲基纤维素、CMSephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM100、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下： 以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCl气体，使

29、之饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气干燥。将产物悬于甲醇中，加入80水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2HCl在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml %3 NaNa2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5搅拌反应23h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。j.异硫氰酸反应 含有芳香氨基的载体，在碱性PH条

30、件下，与光气或硫芥子气反应生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物，可在温和条件下与酶分子的氨基连接，产生固定化酶。 用含有酰基叠氮的载体在加热下与HClI反应，亦得到异硫氰酸衍生物亦可用于固定化酶。k.溴化氰亚胺碳酸基反应 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将Sepharose 4B用蒸馏水洗净，含0.1g干物质的湿胶加5ml水和4ml现配溴化氰水溶液(25mg/m1)，搅拌下用2mol/LNaOH调pHll.0，2325反应6min，抽干立

31、即用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净, (58min内完成)。活化的载体用0.025mol/L pH10.2（含0.02mol/L CaCl2）硼酸缓冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧杯内加16mg结晶胰蛋白酶，搅拌4h，用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液(内含1mol/L NaCl)洗涤后，复用pH4.1的醋酸缓冲液洗涤，便制成了固定化胰蛋白酶。 酰氯化反应 含羧基载体如羧基树脂(Amberlite IRC50等)，可用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 m酸酐反应 乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐与酶

32、蛋白的氨基起偶联反应，产生固定化酶。活化酯法 含羧基的共聚物载体在二环己基碳二亚胺(DDC)存在下用N羟基琥珀酰亚胺活化，产生活化酯，再在温和条件下连接酶。n.含醛基高聚物 多糖类如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶。例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶。载体制备：60g甘蔗渣纤维素浸于500ml 0.6NaOH溶液中85处理30min，水洗至中性，抽干。悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。置于IL脲溶液中，搅拌。产物用水反复洗涤，抽干后，置于12甲醛溶液中搅拌处理

33、12h，用水洗涤，除去过量甲醛，反应过程如下：加酶固定:上述载体1g加入1mg/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下48固定18h后，用PH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即为固定化酶。1.2.4 交联法 这是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2二磺酸、1，5二氟2，4二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下： 交联法有下列方法： (1) 交联酶法 在一定条件下，

34、加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。这种反应与酶和试剂浓度、溶液PH和离子强度、温度、反应时间均有一定的关系。如木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH5.27.2、0下交联24h，可形成固定化酶。其中，FH的影响L分明显，随pH升高，闭定化速度增加5pH低于4不能形成固定化酶。其中，pH的影响十分显著，随pH升高，固定化速度增加；pH低于4不能形成固定化酶。有人认为pH应控制在酶的等电点附近有利于固定化。在交联时，加入一定量中性盐如Na2SO4、（NH4)2SO4等和丙酮等有机溶剂有助于形成固定化酶。温度也有一定影响如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0长时间反应，只

35、得可溶性固定化酶，若在室温下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。这种情况对不同酶可能有不同结果。 这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力。 例如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L pH6醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温下放置1030min，会有沉淀析出，13h内反应结柬。形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶。(2)酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联从而制备固定化酶由于酶在交联反应过程中因化学修饰而引起失活，或因可得到的酶量有限时，因此，通常以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联

36、。 例如：10mg脲酶与2.5ml含6白蛋自、0.2戊二醛的0.02mol/L pH8磷酸缓冲液混合，冷到30后，冉升温至4 下,放置4h将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。(3)载体交联法 是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含18.6CaC12和18.6水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干，于3.65mol/LHCl中45水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制)，于20搅拌交联20min，用PH7.8 0.1mol

37、/L磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。2g处理载体(尼龙)加入4ml酶溶液(1mg/ml）于45下固定3h后，用0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液(内含0.5mol/LNaCl)洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋白酶。 单用戊二醛等试剂文联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。 壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。壳聚糖微球制备：4g壳聚糖洛于100m12醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴人烧杯中的透平油(酸性胶与透平油的比例为1：3)中，技4：35：1比例加入25戊二醛溶液，再用1mol/L NaOH溶液调pH910，置水浴(60一7

38、0)中3h，冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤真空干燥备用。 酶的固定化：0.5g载休于0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液浸泡24h，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，48下吸附12h，滴入0.6戊二醛溶液3m1于48交联3h后弃去上层溶液，用0.1mol/L pH72磷酸缓冲液(含NaCl 0.5mol/L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活力回收约60，在填充休反应器内连续水解酪蛋白(05)时半衰期为16d.另一种方法是酶交联后再用凝胶包埋。 1mg/m1(601U/m1)脲酶的0.02mol/LpH68磷酸缓冲液与等体积2.5戊二醛的上述缓

39、冲液混合，4反应10h加G1y至0.1mol/L，终止交联，得交联酶。 lml60丙烯酰胺和16N，N甲叉双丙烯酰胺与5mL上述交联酶液混合，37保温(为溶液A)。另取96mg琼脂糖在6mL水中煮沸5min，在搅拌下冷却至40(溶液B)。在溶液B中加入0.5mlN，N，N，N四甲基乙二胺36mg过硫酸铵，立即加入溶液A，4聚合30min，凝胶水洗，干燥，即为固定化酶。1.2.3 微生物细胞的固定化方法 菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法和不用载体法等。(1) 包埋法 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法。将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、

40、卡拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。1977年我国投入生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆茵而成。美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺。包埋法制备固定化细胞与其制备固定化酶大体相似，兹举例介绍如下。聚丙烯酰胺凝胶包埋法 3m1细胞悬浮液，加入12m1生理盐水和丙烯酰胺2.25g、甲叉双丙烯酰胺O.25g、5二甲氨基丙氰1.5ml及2.5过硫酸铵1.5ml，在10min内聚合，得到终浓度为15的聚丙烯酰胺凝胶切成3mmX3mmX3mm小块，用蒸馏水、生理盐水各洗二次，抽干即可。又如用聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌(

41、Ecoli ATCCll303)固定天冬氨酸酶：将大肠杆菌细胞悬浮液和单体溶液(750g丙烯酰胺和40gNN中叉双丙烯酰胺溶于2.4L水)在8混合后，加入100m125(体积比)P二甲氨丙氰和500ml1过硫酸钾，混匀后于2025放置约5min开始聚合并升温，当升至30即用冷水冷却，放置1520min完成聚合。凝胶切成直径34mm颗粒。再用水洗涤。约10ml凝胶相当于1g湿细胞，酶活力约为13001800umol/h。若用1mmol/LMg2+和1mol/L反丁烯二酸(pH8.5)将胶在37保温2448h酶活力可提高910倍。琼脂凝胶包理 3m1细胞悬浮液加入到20ml4琼脂液(45)中，搅拌

42、均匀，凝固后，切成3mm3mm3mm小方块，用100m1生理盐水洗二次。海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到20ml 2CaCl2溶液中，置冰箱10h，用100ml生理盐水洗二次。 卡拉胶包埋法 8g湿菌、8m1生理盐水在45混匀；再将1.5g卡拉胶溶于3m1生理盐水中，两者于50混合后、冷至10，30min后将凝胶浸于0.3mol/L KCl溶液中4h，切块或制粒。 明胶包埋法 将3m1细胞悬浮液加入到200ml 10明胶液，34混匀冷凝后，切块，加入20m15戊二醛溶液，室温下文联1.5h，用蒸馏水、生理盐水各洗二次。 其他包埋方法还有胶原膜、四氯化钠在水中形成的聚合的金属氧化物沉淀及液体膜

43、等。(2)吸附法吸附法也分物理吸附法和离子交换吸附法 物理吸附法 物理吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。载体常用的多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。如将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。在环境保护中用木片、石砾等固定微生物细胞作为污水处理的过滤器。物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大.但细胞极容易脱落而流失.有待于进一步改善.离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离于交换树脂，例如利用阴离子交换树脂吸附放线菌含葡萄糖异构酶含酶菌株；用Dow

44、ea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用离子交换纤维素吸附无色杆菌(含头孢霉素酰化酶菌株)以及用离子交换纤维素吸附米曲霉含转化酶菌株等获得成功.这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞. 不用载体法这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细胞内，所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚干燥即成固定化细胞。2 辅基与辅酶的固定方法2.1辅基的固定方法 对于与酶结合牢固的辅基，可以考虑在固定化酶时一般可以将辅基同时固定，但是在一些条件

45、下如酶蛋白与辅基结合弱而辅基容易泄露时，或者用于亲和层析来分离纯化相应酶等，必须将辅基固定。辅基固定化过程是，将载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。裁体应符合以下条件： 没有非专一件吸附，具有多孔性和定的机械强度；具有适合与臂或辅基结合的功能基团；具有化学和生物学稳定性等.载体大多采用琼脂糖，也使用纤维素、多孔玻璃珠或合成高分子材料等。连接臂，尚需考虑其疏水性、亲水性、离子性和体积、长度等因素。选择偶联反应有两种情况： 是在不影响辅基活性条件下，引入适当的功能基团，如羧基或氨基等容易与载体连接；二是如果辅基分子本身具备有参与催化活性的功能基团，无须再引入功能团。如磷酸吡哆醛(胺)、FAD

46、、FMA、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等，大都利用分子本身原有的功能基团。接着，将具有某种功能团的辅基与连接臂结合，再与活化载体结合.用琼脂糖为载体时有如下反应：2.1.1溴化氰法活化载体可直接与辅基偶联。2.1.2带羧基载体2.1.3带氨基载体2.1.4带巯基或二硫基裁体2.1.5带芳香氨基线体2.2辅酶的固定方法辅酶的固定方法主要有两种：载体结合法和包埋法。载体结合法与捕基固定方法相似，主要用于制备亲和吸附利。包埋法中，由于辅酶相对分子质量小，先将辅酶与水溶性高分子结合，然后再来包埋。这种包埋和酶的包埋法相似。因此，辅酶固定化包括：引入一个功能基团，生成辅酶衍生物，再与水溶性高分子聚合物结

47、合。2.2.1引入功能基团 对于一些腺苷酸的辅酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反应分别如下：2.2.2高分子化 选择高分子化合物时，首先要考虑的是其溶解度大、分子大小适当，既能保持在半适膜内，又不会过大地增加粘度而影响活性；其次是，高分子大小、结构、亲水性、解离基团、结合量等都影响高分子化辅酶的活性。一般引入羧基的辅酶，用碳二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合，形成水溶性高分子化合物；引入氨基的辅酶， 一般用BrCN活化后，再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合，而高分子化。 酶反应器中，使用高分子辅酶衍生物还有捕酶的再生问题。一般采

48、用与主反应共组合和独立进行二种方式来解决。如下页图： 在实践中，许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成中，尚需辅酶参加酶反应，所以，辅酶的固定化和固定化辅酶的再生是酶工程的一项重要任务。目前尚未见用于工业生产的报道。3 动植物细胞固定化3.1植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用吸附法和包埋法(下表 )。3.1.1吸附法 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢

49、产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。3.1.2包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。 Brodelius等(1979)首次用海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。3.2 动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。3.2.1吸附法 由于大多数动物细胞

50、属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有：(1)转瓶法。转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐射等表而处理，可使动物细胞附着于表面，转瓶以一定旋转速度进行培养.若在转瓶内增大表面积，可提高生产能力。(2)微载体法。微载体是指直径为100200um，相对密度接近于1.0的颗粒固定化载体。它是由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微载体具有较大的表面，对细胞生长和物质传递特别有利，但强度不够易破碎，使用时间较短，已用于固定多种细胞。如

51、用于生产p干扰素、人纤溶酶原活化剂白细胞介素及各种疫苗的细胞固定化。(3)中空纤维法 中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。将细胞胞置于管外壁扣容器外壳之间，则细胞附着于外壁上，培养液从管内流动，能透过管壁进行质热传递，中空纤维起着体内微血管的作用，有利细胞生长及其新陈代谢。已有多种中空纤维固定化细胞用于生产各种单克降抗体和疫苗等。3.2.2包埋法 包埋法根据载体与方法不同，亦有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种.(1)凝胶包埋法。用于动物细胞固定化的凝胶主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤蛋白等。琼脂糖包埋法是，将1一2.5的琼脂糖加热溶解后冷至3738,与一定量动物

52、细胞混合后分布于石蜡油中.使温度湖37降至10左右，可得到直径为0.10.3mm的微球状固定化细胞，用于单克隆抗体、白细胞介素等的生产。海藻酸钙凝胶包埋法是，将动物细胞与一定浓度的海藻酸凝胶溶液混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定CaCl2溶液中即成。 血纤蛋白包埋法是将动物细胞与血纤蛋白混合后加入凝血酶而固定化。 (2)半透膜包埋法。利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋形成微囊形固定化动物细胞。例如：先用海藻酸钙包埋动物细胞制成胶粒后，再在外面包一层聚Lys膜，然后放入柠檬酸钠溶液中去除海藻酸钙，便可获得由多聚Lys包埋的动物细胞。3.3原生质体固定化 原生质体固定化，首先要制备较稳定

53、的原生质体，然后用凝胶进行包埋。（1）琼脂多孔醋酸纤维固定法 用生理盐水配制3一4的琼脂，加热，溶解，灭菌后冷至50左右，勺等体积一定浓度的原生质体混合，将混合液滴加于多孔醋酸纤维上，置冰箱冷却凝固。（2）海藻酸钙凝胶固定法 以3一6海藻酸钙溶液与等体积 定浓度的原生质体混合，混合液滴入CaCl2溶液中，并浸泡12h。即成。（3）角叉莱胶固定法 配制1一8角叉菜胶加热溶解，灭菌后，冷却至50左右，与等体积原生质体混合，混合液滴入一定浓度的预冷KCl中，即得球状固定化原生质体。（4）光交联树脂固定法 配制30一60浓度的光交联树脂预聚体加热溶解后，在50左右加人1光敏刘与等体积的原生质体混合后，

54、摊成薄层经紫外光照射，聚合后形成小块，制成片状的固定化原生质体。 固定化原生质体用于生产各种氨基酸、酶和生物碱等物质以及甾体转化等。4 固定化酶的性质4.1固定化酶活力 与其溶液酶相比，大多数固定化酶活性下降。固定化酶活力下降的原因主要有：酶与不溶性载体相结合引起结构发生了变化；酶活性中心的重要氨基酸残基与裁体相结合。这两者造成的酶活力下降可以适当条件加以克服。载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降。这个影响难以克服。另外，在包埋法中，酶活性的下降可能是在酶的固定过程中有变性所致。4.1.1酶固定化效果的测定 固定化酶活力测定基本上与溶液酶相似，也以反应

55、初速度表示即每毫克干重固定化酶每分钟转化1umol底物量或形成1umol产物的酶量为一个单位(umol/mgmin)，对于酶管、酶膜、酶板等，则以单位面积（cm2）的初速度来表示。4.1.2偶联效率 偶联效率以载体结合酶量(或酶活力)的百分数表示： 由于在偶联反应中酶往往会有些失活，因此，测定残留活力还不能正确反映与载体结合的酶活力，所以，仍以测定蛋白量较为难确。在酶固定化操作中，当酶与载体结合后，用适量适当的缓冲液淋洗固定化酶，以洗除未固定的酶，收集洗脱液，并测定其中蛋白量(或酶活力)，即为残留的蛋白量(或酶活力)。4.1.3活力回收和相对活力 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收。4.2 固定化酶的稳定性 大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性延长了有效寿命。这是由于：第一，固定化增加了酶构象的牢固程度。第二、挡住了不利因素对酶的侵袭。第三，限制了酶分子间的相互作用。但是，如果固定化触及到酶活性