实验2土壤病原菌的分离分离

1、实验二实验二 土壤病原菌的分离分离培养土壤病原菌的分离分离培养实验目的实验目的 掌握土壤微生物的分离方法掌握土壤微生物的分离方法土壤中的微生物1. 土壤是微生物的大本营，是人类最丰富的菌种资源库；2. 土壤中尤以细菌最多，约占土壤微生物总量的70-90%；3. 除细菌外，土壤中数量较多的其它微生物是放线菌（抗生素的主要产生菌）和真菌。土传病害 土传病害是指病原菌如真菌、细菌、线虫和病毒随病残体生活在土壤中，条件适宜时从作物根部或茎部侵害作物而引起的病害。Fungi in the soilFungi are an important component of the soil microbes

2、typically constituting more of the soil biomass than bacteria, depending on soil depth and nutrient conditions;The saprobic fungi represent the largest proportion of fungal species in soil and they perform a crucial role in the decomposition of plant structural polymers, such as, cellulose, hemicell

3、ulose, and lignin, thus contributing to themaintenance of the global carbon cycleFungi in the soilThe number of cultured fungi (100,000) is believed to be a small fraction of the total number of extant species;Utilize direct culture and molecular methods to estimate fungal diversity and the percenta

4、ge of culturable fungi in various soil and compost environments.Identify novel species and facilitate the isolation of additional fastidious fungi from the original samples.分离土壤真菌的目的：分离土壤真菌的目的：分析土壤中有哪些真菌分析土壤中有哪些真菌( (土壤真菌的定性土壤真菌的定性) )；分析土壤中各种真菌的数量分析土壤中各种真菌的数量( (土壤真菌的土壤真菌的定量定量) )；分析土壤中的病原真菌。分析土壤中的病原真菌

5、。Why cant cultivate all the fungiThe limitations of the culture techniques employed;complex interdependencies between microorganisms in soil that cannot be replicated in the laboratory;the presence of fungi in dormant or “viable but non-culturable” states.分离的方法分离的方法1. 稀释平板法稀释平板法 制备土壤稀释液：制备土壤稀释液：称取称取

6、1g干燥的土样，倒入盛有干燥的土样，倒入盛有10 ml无菌无菌水的三角瓶中，充分振荡，即成水的三角瓶中，充分振荡，即成1/10浓度浓度的悬液。静止后，制备成的悬液。静止后，制备成1/100、1/1000、1/10000不同浓度不同浓度 的稀释液备用。的稀释液备用。倒平板倒平板（也可以先倒琼胶培养基制成平板，二三天后（也可以先倒琼胶培养基制成平板，二三天后用）用）涂皿涂皿 每皿加每皿加0.5ml0.5ml土壤悬浮液，用无菌三角玻璃刮土壤悬浮液，用无菌三角玻璃刮铲涂铲涂 均匀，每浓度两个重复。标记、置均匀，每浓度两个重复。标记、置2828恒温箱培养。恒温箱培养。纯化纯化 2. 2. 弹土分离法弹土

7、分离法 倒平板倒平板（也可以先倒琼胶培养基制成平板，二三天后用）（也可以先倒琼胶培养基制成平板，二三天后用）称取一定量研碎的细土于光滑纸版上，再将多余的土称取一定量研碎的细土于光滑纸版上，再将多余的土倾去，见纸片上黏附有一层细土。倾去，见纸片上黏附有一层细土。将土样纸版带土一面向下轻轻插入无菌培养皿内。将土样纸版带土一面向下轻轻插入无菌培养皿内。轻动皿盖，并立即取出纸，皿上做好标记。置轻动皿盖，并立即取出纸，皿上做好标记。置2828恒恒温箱中培养。温箱中培养。纯化纯化镜检镜检3. 3. 土壤平板分离法土壤平板分离法 无须配制土壤悬浮液，无须配制土壤悬浮液，将土样直接与琼胶培养基混将土样直接与琼

8、胶培养基混合后培养合后培养。每个培养皿加土壤的量要经过初步测定，。每个培养皿加土壤的量要经过初步测定，一般是加一般是加515g。将移植针的头打扁，制成微量。将移植针的头打扁，制成微量刮勺，用来加土样到培养皿中和压碎结块的土粒。刮勺，用来加土样到培养皿中和压碎结块的土粒。每一个培养皿加琼胶培养基约每一个培养皿加琼胶培养基约l0ml，与土样充分混，与土样充分混合，制成平板培养。砂质土壤容易和培养基混合均合，制成平板培养。砂质土壤容易和培养基混合均匀，如土样过于干燥或粘重，可以将土样与匀，如土样过于干燥或粘重，可以将土样与1滴灭滴灭菌水在培养皿中混和然后加琼胶培养基。土样中真菌水在培养皿中混和然后加

9、琼胶培养基。土样中真菌的量过大，可以将土壤与适量的灭菌砂土混合稀菌的量过大，可以将土壤与适量的灭菌砂土混合稀释。释。金霉素和链霉素要在倒平板前加，其余成金霉素和链霉素要在倒平板前加，其余成分则在配制培养基时加。应该指出，分离分则在配制培养基时加。应该指出，分离土壤真菌并没有标准的培养基，所加抑制土壤真菌并没有标准的培养基，所加抑制性物质的种类和量，是根据各人的实践经性物质的种类和量，是根据各人的实践经验。因此，以上介绍的配方，只能作为工验。因此，以上介绍的配方，只能作为工作的参考。作的参考。4. 4. 土壤中菌丝体的分离法土壤中菌丝体的分离法 对于不容易产生孢子或菌丝体不容易分对于不容易产生孢

10、子或菌丝体不容易分段的真菌，或者由于其他原因，不容易用上段的真菌，或者由于其他原因，不容易用上述稀释法分离到的真菌，可以采用菌丝分离述稀释法分离到的真菌，可以采用菌丝分离法。菌丝分离法还能用来分离土壤中特定的法。菌丝分离法还能用来分离土壤中特定的菌丝而得到这种真菌的纯培养。菌丝而得到这种真菌的纯培养。土壤中菌丝体的分离法土壤中菌丝体的分离法分离的方法是将土块分离的方法是将土块1.01.01.5g1.5g，放在烧杯中加水，放在烧杯中加水浸透浸透，4 45min5min后用自来水将土块冲碎，经过后用自来水将土块冲碎，经过1.01.01.5min1.5min倒去上层液，倒去上层液，反复冲洗几次，到上

11、面的液体沉降反复冲洗几次，到上面的液体沉降1.01.01.5min1.5min后达到澄清后达到澄清为止，将下面剩下的土粒，放在加有少量灭菌水的培养皿中。为止，将下面剩下的土粒，放在加有少量灭菌水的培养皿中。在解剖镜下观察，用细小的铗子将菌丝从土粒上分离取出，在解剖镜下观察，用细小的铗子将菌丝从土粒上分离取出，放在盛有少量灭菌水的灭菌培养皿中。当培养皿中已有足够放在盛有少量灭菌水的灭菌培养皿中。当培养皿中已有足够的菌丝时，加的菌丝时，加101015ml15ml的琼胶培养基，以后每天用解剖镜观的琼胶培养基，以后每天用解剖镜观察菌丝的生长，将未受杂菌污染的菌丝尖端，切下移到新鲜察菌丝的生长，将未受杂

12、菌污染的菌丝尖端，切下移到新鲜的琼胶培养基平板上培养。菌丝分离用的培养基，有人建议的琼胶培养基平板上培养。菌丝分离用的培养基，有人建议用稀释的用稀释的查氏组合培养基查氏组合培养基( (浓度为正常查氏培养基的浓度为正常查氏培养基的1 16)6)，另外加另外加0.50.5的酵母浸膏，酸度是的酵母浸膏，酸度是pH 5.0pH 5.06.86.8。洗 土 分 离 法另一种洗土分离法是将孢子尽量除去，使分离到的另一种洗土分离法是将孢子尽量除去，使分离到的真菌再从菌丝生长出来的。最简单的方法是将土壤真菌再从菌丝生长出来的。最简单的方法是将土壤约约1g，放在，放在500ml的三角瓶中，加的三角瓶中，加200ml灭菌水振灭菌水振1-2min，倾去水洗后，加灭菌水重复洗，倾去水洗后，加灭菌水重