诊断分子生物学基本技术

1、诊断分子生物学基本技术诊断分子生物学基本技术诊断分子生物学基本技术诊断分子生物学基本技术基础知识实验基础诊断技术临床应用ampr半乳糖苷酶N端编码序列变性与复性变性与复性（denaturation and renaturation）变性 在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即变性l增色效应 解链过程中，DNA的A260增加，并与解链温度有一定的关系，这重关系称为DNA的增色效应 复性 变性DNA在适当的条件下，两条互补链可重新恢复天然的双螺旋构象即复性l退火 热变性的DNA经缓慢冷却即可复性，这一过程称为退火解链温度解链温度Tm(melt

2、ing temperature)解链曲线 在连续加热DNA过程中，以温度对A260的关系作图，所得曲线称为解链曲线 解链温度 Tm 在解链曲线中，紫外线吸收值达到达50%时的温度为Tm。在Tm时，核酸分子内50%的双链结构被打开Tm的影响因素l碱基组成 与G+C比例有关， G+C比例越高，Tm值越高l实验条件 例如三氯醋酸存在使Tm变小，氯化钠存在使Tm升高基因载体基因载体（gene vector）概念 把目的基因导入宿主细胞，使之传代、扩增、表达的工具。特点 自我复制 遗传标记 插入位点种类 质粒 噬菌体 病毒质粒质粒（plasmid）概念 存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。结构

3、l 起动区（复制原点Ori）l 标记位点 抗抗生素标记（抗氨苄青霉素ampr、抗四环素terr） 半乳糖苷酶 片段l 基因发动子（乳糖操纵子等）l转录终止位点l 限制性内切酶位点 限制性内切酶限制性内切酶（restriction endonuclease)概念 识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。分类 三类 重组技术中常用一类识别位点 回文结构即核苷酸结构呈二元旋转对称。切口类型 平端 AGCT- Alu - AG CT- -TGCA- -TC GA- 粘端 - GAATT C- EcoR1 -G AATTC- -C TTAAG- -CTTAA G-DNADN

4、A连结酶连结酶（DNA ligase）概念 连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链的5-P末端，生成磷酸二酯键而形成完整的DNA链种类 l T4噬菌体DNA连结酶lT4噬菌体RNA连结酶l大肠E.coliDNA连结酶作用l连接粘端l连接平端目的基因目的基因（target gene）概念 需要研究的基因叫目的基因。来源l基因文库 存在于转化菌内、由克隆载体所带的所有基因组DNA的集合。l化学合成法 用DNA合成仪利用化学原理合成该核苷酸序列。lcDNA 以mRNA为模板， 利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA。l聚合酶链反应 在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA。核酸的分离与纯化核酸的

5、分离与纯化（the separation and purification of nucleic acid）细胞的溶解 因标本而异 用SDS、Triton x-100 、 超声破碎等核酸的分离 苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，将核酸分离核酸的提取 冷乙醇或异丙醇沉淀核酸，离心回收核酸去除杂质 70%的乙醇洗涤沉淀，除去处多余的盐类核酸探针的标记核酸探针的标记（the labelling probe of nucleic acid）概念 对已知碱基序列的单链核酸用示踪物进行标记得到核酸探针示踪物分类 l放射性核素类 优点 ： 灵敏度高、特异性高、不影响酶促反应。缺点：污染环境、损

6、害人体。l非放射性核素类 抗原抗体免疫标记物地高辛、亲和配体标记物生物素、荧光标记物lFITC、电子密度标记物胶体金等。标记方法 缺口平移法 随机引物法 末端标记法缺口平移标记法缺口平移标记法（The label method of nick level moving）概念 由Dnase 在DNA双链上切出随机切口，DNA聚合酶沿缺口水解5端核苷酸和3端修复加入被标记核苷酸同时进行，切口平行推移，可均一标记DNA链，合成与模板互补的新链。优点 快速、简便、成本相对低、比活性较高、标记均一，大分子标记效果好（1000bp）。缺点 单链DNA、RNA、200bp不能用该法标记。随机引物标记法随机引

7、物标记法(The label method of random primer)概念 采用6个核苷酸的随机引物 与模板DNA结合的原理将标记物掺入到新合成的DNA片段中去，完成探针标记反应。l随机引物 是指有各种可能排列组合顺序的混合物，能与任何核酸序列退火杂交，并为DNA聚合酶的反应起到引物作用。方法 将双链DNA变性为单链，与随机引物退火杂交，在含有dNTP底物的示踪物的存在下，由Klenow片段催化下，从引物3末端开始按5-3方向合成新的互补DNA链，即标记的DNA探针。优点 具有缺口平移标记法的优点，而且能标记任何长度的DNA及RNA。末端标记法末端标记法（The end- labell

8、ing method ）概念 用核酸修饰酶对核酸片段的5或3末端进行部分标记，不对全长标记。分类 lKlenow片段末端标记法 在有标记的dNTP存在下， Klenow片段可以填充双链DNA凹陷的3末端，获得标记的DNA探针。lT4DNA聚合酶置换合成标记法 利用T4DNA聚合酶的3-5核酸外切酶和5-3核酸内切酶的作用，使3末端凹陷，加入有标记的dNTP，获得标记的DNA探针，用于末端为3突出粘端和平端的情况。lT4多聚核苷酸激酶标记法 T4多聚核苷酸激酶可将-32PATP的- 32P转移到DNA游离的5-OH上，还可催化- 32P与5末端的磷酸基团交换，因此无论是否5末端去磷酸均可用此法标

9、记。分子生物学实验诊断技术分子生物学实验诊断技术核酸扩增技术核酸杂交技术多态性的分析核酸序列分析DNA重组技术杂交核酸技术杂交核酸技术（The hybridization technique of nucleic acid） 核酸分子杂交 在DNA复性过程中，如果把不同的DNA单链分子或者把DNA与RNA放在一起，只要存在碱基配对关系，就可以在不同分子间形成杂化双链，这种分子现象为核酸分子杂交 核酸杂交技术 利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。分类l斑点杂交 用于基因组 DNA或RNA的分析lSouthern blot 用于基因组 DNA的分析lN

10、orthern blot 用于以知mRNA表达水平的分析l原位杂交 细胞内杂交，用于DNA或RNA的分析Southern blotSouthern blot（1 1）概念 用转膜法进行DNA杂交分析步骤l提取消化 提取基因组DNA并将其经限制性内切酶消化成片段l电泳 将DNA片段在琼脂糖凝胶中电泳变性使其成为单链l转膜 将硝酸纤维素（nitrocellulose,NC）膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中DNA片段转移到NC膜上l杂交 此杂交膜在杂交 液中与探针杂交l显影 用放射自显影显示出杂交分子带Southern blot （2） 重物重物吸水纸吸水纸滤纸凝胶缓冲液Northern

11、 blotNorthern blot概念 用转膜法进行RNA杂交分析步骤l提取 总RNA的提取l电泳 将RNA片段在琼脂糖凝胶中电泳变性，防止发夹状结构形成l转膜 NC膜放在胶上，上面放吸水纸，利用毛细作用使胶中RNA片段转移到NC膜上l杂交 此杂交膜在杂交 液中与DNA探针杂交l显影 用放射自显影显示出杂交分子带l注意 所用试剂均用0.1% DEPC水配制l注意 所有器具均需高温处理斑点杂交斑点杂交（dot hybridization technique ）概念 核酸与探针直接在NC膜上杂交的方法步骤l提取 提取DNA或RNA样品l点样 样品点在NC膜上， 烘烤使其固定在膜上l杂交 将膜、探

12、针、杂交液封入杂交袋中，杂交l显影 用放射自显影显示出杂交分子点原位杂交原位杂交（in situ hybridization）概念 保持细胞形态，在细胞内进行核酸杂交步骤l固定标本 涂片或组织切片置微波炉中照射，固定标本 l杂交 将探针（常用生物素标记法）复盖在标本上，加入杂交液，杂交l显色 载玻片放入缓冲液中，加入底物，显色。l摄影 显微镜下观察结果，摄影核酸杂交技术与基因诊断核酸杂交技术与基因诊断（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）限制性内切酶酶谱分析法l概念 利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否

13、存在基因突变l原理 当待测DNA序列发生突变时会导致某些限制性内切酶位点的改变，其片段的长度与数量在电泳迁移率上会随之改变。借此做出诊断l应用 检测基因突变的位点与数量核酸杂交技术与基因诊断核酸杂交技术与基因诊断（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）DNA限制性片段多态性分析（RELP）l概念 DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶解该片段会产生长度不同的片段，此片段为遗传标志，检测致病基因的带者l原理 在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对突变（称为中性突变），中性突变导致个体间的差异，叫DNA多

14、态性。在某家族中，致病基因与特异多态性紧密连锁，此多态性为遗传标志l应用 遗传病的基因诊断核酸杂交技术与基因诊断核酸杂交技术与基因诊断（ The hybridization technique of nucleic acid and diagnosis ）等位基因特异寡核苷酸探针杂交l概念 根据已知遗传病基因突变的核苷酸序列，人工合成寡核苷酸探针（突变与正常），分别与受检者杂交，判断其为突变的纯合子、杂合子、新的突变类型或正常l原理 若受检者只与突变探针杂交，则为突变纯合子；若与两种探针杂交，则为突变杂合子；若与正常探针杂交，则不存在该突变基因；若与两者均不杂交，提示新的突变。聚合酶链反应聚合

15、酶链反应PCRPCR（polymerase chain reaction，PCR）概念 用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段原理 以待扩增的DNA为模板，以一对与模板5和3末端互补的寡核苷酸片段为引屋，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，合成新链，反复重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。基本步骤 l变性 95 使模板DNA完全变性为单链l应退火 较Tm低5，使引物与模板DNA退火结合l延伸 72 DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应PCRPCR与基因诊断与基因诊断（PCR and gene diagnosis）目的基因的克隆（模板为cDNA或基因组）l利用特异性

16、引物获得已知的目的基因l利用简并引物获得同源性的基因片段l利用随机引物随机克隆基因基因的体外突变l可以随机设计引物在体外进行基因的嵌合、缺失、点突变等改造DNA的微量分析l病原微生物的微量检测l突变基因的筛选l法医学的鉴定lDNA序列分析PCRPCR引物的设计引物的设计（ The design of PCR primer）长度 以扩增片段而定，一般1530个碱基，引物越长，特异性越强碱基 GC含量以45%55%为佳，GC应随机分布Tm值 Tm值应底于延长温度引物内和引物间不宜形成二级结构特异性 特异性强，不扩增目的基因以外的DNAPCRPCR扩增条件的设计扩增条件的设计（The design

17、of PCR extension condition）退火 一般Tm5，与目的基因长度有关，目的基因短，退火温度 可底，时间可短。退火温度 太高，有时会得不扩增产物，退火温度 太低，容易得不到产物延伸 与目的基因长度有关，一般认为DNA聚合酶的聚合速度1000bp/min.时间太短，会得不到产物，时间太长，会出现Smear.扩增次数 扩增次数太少，扩增量不足，扩增次数太多，提高灵敏度，易造成非特异性扩增，会出现Smear.引物 引物过多，易出现双引物聚合，电泳出现小于100bp的带，引物过少，扩增量少。PCRPCR技术探讨技术探讨（The investigation of PCR techni

18、que） Smear 现象l原因原因酶量过多变性时间过短变性温度过低dNTP量过少延伸时间过长循环次数过多模板量过多l建议建议0.5U递减变性时间5秒递增变性温度0.5递增50um递增10秒递减2个循环递减模板量20%递减PCRPCR技术探讨技术探讨（The investigation of PCR technique 非特异性扩增l原因原因引物浓度过高引物设计不合理酶量过多循环次数过多变性温度过低延伸时间过短模板量过多l建议建议0.1um递减改变引物位置与长度0.5U递减2个循环递减2递增10秒递增酶量20%递减单链构象多态分析技术单链构象多态分析技术（The analysis techni

19、que of single strand conformational polymorphism ）概念 由DNA单链构象所决定迁移率的电泳技术原理 在中性聚丙烯凝胶电泳时，DNA单链的迁移率除与长短有关，更取决于DNA自身折叠形成的由碱基顺序决定的构象，甚至单个碱基不同，迁移率就不同，因此检测出含有基因突变的DNA或RNA片段 特点 这项技术具有简便、快速、敏感、和经济等特点，适用于大样本基因变异的筛查SSCPSSCP技术的应用技术的应用（The application of SSCP technique）适用于大样本基因变异的筛查用于癌基因和抗癌基因突变的检测DNA多态性分析复等位基因的分

20、析遗传病的致病基因分析基因制图SSCPSSCP技术流程技术流程（The procedure of SSCP technique）总RNA的提取逆转录合成cDNAPCR特异扩增目的基因目的基因变性在中性聚丙烯凝胶电泳凝胶的处理l同位素标记的样品放射自显影l银染法或溴化乙锭（EB）染色参考条件参考条件（reference condition）长度 目的基因小于400bp分离单链效果好，突变检出率高温度 温度高，不利于分离突变DNA，最好采用恒温4或2026交联度 低交联度、大孔径的聚丙烯酰胺凝胶有利于DNA互补链的分离，对DNA构型变化敏感，建议用12%C甘油 是核酸的弱变性剂，能部分打开DNA单

21、链的折叠结构，但浓度过大，降低迁移率，建议用510%的甘油电压 影响分析结果，建议先用低电压，后加大电压的条件，分辨率高，电泳时间短SSCPSSCP正常结果分析正常结果分析（The analysis of SSCP normal result）位置 DNA单链在电泳中的位置无法预先确定，应设立未变性样品对照条带数 由于单链构象的多样性，中间状态的存在，可以出现多条单链突变条带 不一定在两条单链都表现出，有时可见于一条单链上假阴性 用该法不能证明无突变发生，若无突变发生可以改变电泳条件假阳性 筛选出泳动变位，不能完全排除假阳性核酸序列分析核酸序列分析(The sequence analysis

22、of nucleic acid)DNA末断合成终止法l原理 在待测DNA的3末端人工合成引物，在DNA聚合酶的作用下，复制链延长，在ddNTP(2,3双脱氧核糖核苷三磷酸)存在下，复制延长随机受阻，形成分子量大小不等的片段。电泳分离，自显影，读分析碱基片段l步骤 l 标记 将单链模板DNA分成4份，每一管加入32PdATP、dNTP、引物和酶，每管还加入4种ddNTP中的一种，进行反应l电泳 聚丙烯酰胺凝胶高压（1600V）电泳，复制延长随机受阻，可形成一个核苷酸的差异的大小不等的片段l显影 电泳后干燥，对X光片进行放射自显影 l图谱 自下往上读，得到5-3的碱基序列，其互补链是待测的DNA的

23、3-5碱基序列核酸序列分析核酸序列分析(The sequence analysis of nucleic acid)复制模板l基因工程 M13是单链噬菌体，转染宿主菌复制为双链增殖，又以单链透出菌体。把待测DNA重组插入双链M13复制型DNA中，经培养扩增，可分离得到单链M13DNA，即复制模板lcDNA 提取样品总RNA，逆转录为DNA，特异扩增目的基因，纯化，即复制模板基因工程基因工程（gene engineering）概述 基因工程又称重组体DNA技术，是指在体外将不同来源的DNA分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作主要步骤l目的基因的获取l载体的选择与构建l复制子的形成l转化l筛选复制子l表达外源基因复制子复制子（replicon）概念 即重组DNA，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA结合成具有自我复制能力的DNA分子构建方式 l粘性末端连接 l平端连接l同聚物加尾连接 同聚物加尾连接同聚物加尾连接（The ligation of adding- tail polymer）概念 利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。步骤 l粘性末端 在末端转移酶的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造粘性末端l连接 在连接酶作用下