微生物的进化、系统发育和分类鉴定

1、微生物的系统发育微生物的系统发育和分类鉴定和分类鉴定第一节第一节 进化的测量指征进化的测量指征第二节第二节 细菌分类命名概述细菌分类命名概述第三节第三节 细菌分类鉴定技术细菌分类鉴定技术地球上开始出现生命，主要是些类似简单杆状地球上开始出现生命，主要是些类似简单杆状细菌的原始生物。细菌的原始生物。地球形成，大约地球形成，大约46亿年前亿年前；大约大约35亿年前，通过亿年前，通过“前生命的化学进化前生命的化学进化”过程；过程；漫长的进化历程漫长的进化历程千姿百态的生物种类千姿百态的生物种类形成于形成于35亿年前的微生物化石亿年前的微生物化石主要是些类似简单杆状细菌的原始生物主要是些类似简单杆状细

2、菌的原始生物形成于形成于8.5亿年前的微生物化石亿年前的微生物化石20亿年前以后的岩石中的微生物的化石形态多样性明显增多亿年前以后的岩石中的微生物的化石形态多样性明显增多形成于10亿年前的微生物化石形态上非常类似于形态上非常类似于现代的蓝细菌，现代的蓝细菌，进行不产氧光合作用的光能自养进行不产氧光合作用的光能自养菌，及菌，及化能无机营养的硫细菌。化能无机营养的硫细菌。形态上类似于形态上类似于现代的绿藻（真核生物）现代的绿藻（真核生物）进化进化(evolution)：生物与其生存环境相互作用过程中，生物与其生存环境相互作用过程中，其遗传系统随时间发生一系列不可逆的改变，在大多其遗传系统随时间发生

3、一系列不可逆的改变，在大多数情况下，导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。数情况下，导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。今天仍生存在地球上的生物种类，今天仍生存在地球上的生物种类，彼此之间都有或远或近的历史渊源。彼此之间都有或远或近的历史渊源。最原始的生命最原始的生命漫长的进化历程漫长的进化历程千姿百态的生物种类千姿百态的生物种类系统发育系统发育(phylogeny)：各类生物进化的历史。各类生物进化的历史。分类分类(classification)：根据生物特性根据生物特性的特征的相似程度的特征的相似程度 将其分群归类。将其分群归类。地球上的物种估计大约有地球上的物种估计大约有150万，

4、其中微生物超过万，其中微生物超过15万种，万种，而且其数目还在不断增加。而且其数目还在不断增加。从进化论诞生以来，已经成为生物学家普遍接受的分类原则。生物分类的二种基本原则生物分类的二种基本原则a）根据表型表型(phenetic)(phenetic)特征的相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关系为目标；b）按照生物系统发育相关性水平生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统。生物系统学生物系统学第一节第一节 进化的测量指征进化的测量指征70年代以前，生物类群间的亲缘关系判断的主要根据：年代以前

5、，生物类群间的亲缘关系判断的主要根据：形态特征、形态特征、生理生化、生理生化、行为习性，等等行为习性，等等少量的化石资料少量的化石资料一、进化指征的选择一、进化指征的选择表型特征表型特征原核生物的特点：原核生物的特点：形体微小、形体微小、结构简单、结构简单、缺少有性繁殖过程。缺少有性繁殖过程。b b）形态特征在不同类）形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅群中进化速度差异很大，仅 根据形态推断进化关系往往不准确；根据形态推断进化关系往往不准确；根据形态学特征推断微生物之间的亲缘关系的缺点：根据形态学特征推断微生物之间的亲缘关系的缺点：a a）由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有）由于微生

6、物可利用的形态特征少，很难把所有 生物放在同一水平上进行比较；生物放在同一水平上进行比较；六、七十年代以后：六、七十年代以后：分析和比较生物大分子（分析和比较生物大分子（蛋白质、蛋白质、RNARNA和和DNADNA）的结构特征。）的结构特征。进化钟进化钟分子计时器分子计时器判断各类微生物乃至所有生物的进化关系判断各类微生物乃至所有生物的进化关系利用利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家建立分子进化树的美国科学家 Carl Woese 进化速率恒定进化速率恒定分子序列进化的改变量分子序列进化的改变量(氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率) 与分子进化的时间成正比

7、。与分子进化的时间成正比。1 生物大分子作为进化标尺依据生物大分子作为进化标尺依据a）在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，）在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，-进化距离远，进化过程中很早就分支了。进化距离远，进化过程中很早就分支了。b）如果两群生物同一来源的大分子的序列基本相同，）如果两群生物同一来源的大分子的序列基本相同，-处在同一进化水平上。处在同一进化水平上。为什么为什么蛋白质、蛋白质、RNA和和DNA序列序列可以作为进化的分子计时器？可以作为进化的分子计时器？2 作为进化标尺的生物大分子的选择原则作为进化标尺的生物大分子的选择原则大量的资料表明：功能重要的大分子、

8、或者大分子中功能重要大量的资料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。1）在所研究的种群范围内，它必须是）在所研究的种群范围内，它必须是普遍存在普遍存在的的2）在所有的物种中该分子的）在所有的物种中该分子的功能是相同功能是相同的的3）为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须）为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所选择的分子序列必须能能严格线性排列严格线性排列，以便进行进一步的分析比较，以便进行进一步的分析比较4）分子上序列的）分子上序列的改变（突变）频率应与进

9、化的测量尺度改变（突变）频率应与进化的测量尺度相适应相适应二、二、RNA作为进化的指征作为进化的指征16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺分子尺”1）rRNA具有具有重要且恒定的生理功能重要且恒定的生理功能；2）在）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它的序列区域，因而它适用于进化距离不同适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究；的各类生物亲缘关系的研究；3）16SrRNA分子量大小适中分子量大小适中，便于序列分析；，便于序列分析；4）

10、16S rRNA的基因（的基因（16S rDNA）在细胞中）在细胞中含量大含量大（约占细胞中（约占细胞中RNA 90%),也也易于提取易于提取;5）16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同源分子是真核生物中其同源分子是 18SrRNA)。因此它可以作为。因此它可以作为测量各类生物进化的工具测量各类生物进化的工具。三、三、rRNA和系统发育树和系统发育树1. rRNA的顺序和进化的顺序和进化培养微生物培养微生物提取总的提取总的DNA作为模板作为模板rDNA序列测定序列测定分析比较分析比较微生物之间的系统发育关系微生物之间的系统发育关系PCR反应扩

11、增反应扩增16SrDNA片段片段特征序列或序列印记（特征序列或序列印记（signature sequence）通过对通过对r RNA全序列资料的分析比较（特别是采用计算全序列资料的分析比较（特别是采用计算机）发现的在机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序不同种群水平上的特异特征性寡核苷酸序列，或列，或在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。在某些特定的序列位点上出现的单碱基印记。特征序列特征序列有助于有助于迅速确定某种微生物的迅速确定某种微生物的分类归属，或建立新的分类单位。分类归属，或建立新的分类单位。2. 系统发育树系统发育树(phylogenetic tree)通过比较通过比较

12、生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为系统发育树，生物大分子序列差异的数值构建的系统树称为系统发育树，其特点是其特点是用一种树状分枝的图型来概括各种用一种树状分枝的图型来概括各种( (类类) )生物之间的亲缘关生物之间的亲缘关系。系。分枝的末端和分枝的连接点称为分枝的末端和分枝的连接点称为结，结，代表生物类群，分枝末端的代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系统树可能有结代表仍生存的种类。系统树可能有时间比时间比例例，或者用两个结之，或者用两个结之间的分枝间的分枝长度变化长度变化来表示分子序列的差异数值。来表示分子序列的差异数值。16 S r RNA系统发育树生命的第三种形式生命的第三

13、种形式-古生菌古生菌动物界和植物界动物界和植物界原核生物和真核生物（原核生物和真核生物（20世纪世纪60年代）年代）古细菌古细菌真细菌真细菌真核生物真核生物（1977.Carl Woese）古生菌古生菌细菌细菌真核生物真核生物（1990.Carl Woese）原核生物原核生物界界域域(domain)随着越来越多的微生物的全基因组序列的测定，人们发现随着越来越多的微生物的全基因组序列的测定，人们发现生物在进化中存在着生物在进化中存在着非常广泛的水平基因转移现象非常广泛的水平基因转移现象，很多，很多科学家都认为科学家都认为不能仅靠对不能仅靠对16SrRNA的序列的序列比较来确定生物比较来确定生物之

14、间的亲缘关系，还必须借助各种信息对这个进化树进行之间的亲缘关系，还必须借助各种信息对这个进化树进行改进。改进。Carl Woose的的rRNA进化树完美无缺？进化树完美无缺？水平基因转移水平基因转移也有的称为也有的称为侧向基因转移侧向基因转移，区别于一般的亲本，区别于一般的亲本和其后代之间遗传信息的垂直传递形式。和其后代之间遗传信息的垂直传递形式。分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。分类(classification)：根据一定的原则根据一定的原则

15、(表型特征相似性或系统发育表型特征相似性或系统发育相关性相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的微生物进行鉴定；微生物进行鉴定；(根据现有数据建立系统的过程根据现有数据建立系统的过程)分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：鉴定鉴定分类、分类、命名、命名、第二节第二节 细菌分类细菌分类命名命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有：是根据命

16、名法规，给每一个分类群一个专有的名称；的名称；(分类系统建立过程中的步骤之一分类系统建立过程中的步骤之一)鉴定鉴定(identification或或determination)：借助于现有的微生物分类：借助于现有的微生物分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类地位的微生物所应归属分类群的过程。地位的微生物所应归属分类群的过程。(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程)主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识一、分类单元

17、及其等级界门纲目科属种根据根据Carl Woese的的理论，现在还在界理论，现在还在界之上使用域之上使用域(domain) （把全部生物先分为（把全部生物先分为古生菌域、细菌域和古生菌域、细菌域和真核生物域，真核生物域，域下面再分界。）域下面再分界。）常用的细菌分类学术语：常用的细菌分类学术语：1）培养物）培养物(culture)：一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微一定时间一定空间内微生物的细胞群或生长物。如微 生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。2）菌株）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养物都可以从自然界中分离得到的任何一

18、种微生物的纯培养物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变如通过诱变)所获得的某一菌株的变异型，所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。也可以称为一个新的菌株，以便与原来的菌株相区别。菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体Bacillus subtilisASI.398Bacillus subtilisBF7658生产蛋白酶生产蛋白酶生产生产淀粉酶淀粉酶2）菌株）菌株(strain)：3）型）型(form或或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌常指亚种以

19、下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的不同分为不同的噬菌型等不同分为不同的噬菌型等高等生物中，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准菌株与型的区别：菌株与型的区别：菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据，依据，不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名或鉴定不同的型不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命

20、名或鉴定不同的型必需有分类学依据。必需有分类学依据。4）种（）种（species）：）： 物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。物种，生物分类中基本的分类单元和分类等级。高等生物中，高等生物中，“生殖隔离生殖隔离”被看作是区分物种的标准被看作是区分物种的标准微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有明显的区别。他类群的菌株有明显的区别。二、微生物的命名二、微生物的命名命名：给予菌种一个科学名称。菌种的学名是命名：给予菌种一个科学名称。菌种的学名是按照按照国际细菌命名法规国际细菌命名法规命名的国际学术命名的国际

21、学术界公认，并通用的名称。界公认，并通用的名称。双名法双名法，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成，一般用组成，一般用斜体斜体表示表示属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写例如：例如： Bacillus subtilis 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准，为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱，为了减少因采用不同标准界定

22、分类单元所造成的混乱，细菌系统分类也像其他生物分类一样采用细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念模式概念”种和亚种指定模式菌株（种和亚种指定模式菌株（type strain）；）；亚属和属指定模式种（亚属和属指定模式种（type species）；）；属以上至目级分类单元指定模式属（属以上至目级分类单元指定模式属（type genus）；）；模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。模式菌株应送交菌种保藏机构保藏，以便备查考和索取。伯杰氏手册伯杰氏手册伯杰氏鉴定细菌学手册伯杰氏鉴定细菌学手册(Bergeys Manual of Determinative Bacteriolog

23、y)美国宾夕法尼亚大学的细菌学教美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰授伯杰(D.Bergey)(1860-1937)1957年第七版后，由于越来越广泛地年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌分类学家参加编写吸收了国际上细菌分类学家参加编写(如如1974年第八版，撰稿人多达年第八版，撰稿人多达130多多位，涉及位，涉及15个国家；现行版本撰稿人个国家；现行版本撰稿人多达多达300多人，涉及近多人，涉及近20个国家个国家)，所，所以它以它的近代版本反映了出版年代细菌的近代版本反映了出版年代细菌分类学的最新成果，因而逐渐确立了分类学的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分在国际上对细菌

24、进行全面分类的权威地位。类的权威地位。伯杰氏系统细菌学手册(Bergeys Manual of Systematic Bacteriology)伯杰氏手册伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重是目前进行细菌分类、鉴定的最重要依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各要依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方个属种的特征及进行鉴定所需做的实验的具体方法。法。（20世纪80年代末期）第三节第三节 细菌分类鉴定的特征和技术细菌分类鉴定的特征和技术1、获得微生物的纯培养物；、获得微生物的纯培养物；细菌鉴定的主要步骤：细菌鉴定的主要步骤：2、测定一系列必要的指标

25、；、测定一系列必要的指标；3、查找权威性鉴定手册，确定细菌分类地位。、查找权威性鉴定手册，确定细菌分类地位。在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，在现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。从不同层次从不同层次(细胞的、分子的细胞的、分子的)，用不同学科，用不同学科(化学、物理化学、物理学、遗传学、免疫学、分子生物学学、遗传学、免疫学、分子生物学等等)的技术方法来研的技术方法来研究和比较不同微生物的究和比较不同微生物的细胞、细胞组分或代谢产物细胞、细胞组分或代谢产物，从中，从中

26、发现的反映发现的反映微生物类群特征微生物类群特征的资料。的资料。一、形态学特征一、形态学特征培养特征、培养特征、运动性、运动性、特殊的细胞结构、特殊的细胞结构、细胞形态及其染色特性、细胞形态及其染色特性、等等等等微生物分类和鉴定的重要依据之一：微生物分类和鉴定的重要依据之一：a）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊）易于观察和比较，尤其是真核微生物和具有特殊 形态结构的细菌；形态结构的细菌；b）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对）许多形态学特征依赖于多基因的表达，具有相对 的稳定性；的稳定性；各种微生物形成的菌落特征各种微生物形成的菌落特征 菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重

27、要依据。菌落或菌苔是对微生物进行分类和鉴定的重要依据。电镜下的大肠杆菌（示鞭毛）二、生理生化特征二、生理生化特征与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；与微生物的酶和调节蛋白质的本质和活性直接相关；酶及蛋白质都是基因产物；酶及蛋白质都是基因产物；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较；测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多；代谢产物和代谢途径等代谢产物和代谢途径等营养类型；营养类型；与氧的关系；与氧的关系；对温度的适应性；对温度的适应性；对对pH的适应性；的适应性；对渗

28、透压的适应性；对渗透压的适应性；与盐的关系；与盐的关系；代谢产物和代谢途径等：代谢产物和代谢途径等：碳源利用实验；碳源利用实验；糖发酵实验；糖发酵实验；抗生素敏感性实验；抗生素敏感性实验；由此产生的生化试验还有：甲基红试验由此产生的生化试验还有：甲基红试验(methyl red test,简称简称MR试验）、乙酰甲基甲醇试验试验）、乙酰甲基甲醇试验(VP试验）、试验）、靛基质试验（吲哚试验）、硫化氢试验、硝酸盐还原靛基质试验（吲哚试验）、硫化氢试验、硝酸盐还原试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试试验、过氧化氢酶试验、氧化酶试验、过氧化氢酶试验等。验等。形态和生理生化特征是最常用形态和

29、生理生化特征是最常用的细菌分类、鉴定指标的细菌分类、鉴定指标在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴在以实用为主要目的表型分类中，生理生化特征往往是细菌分类鉴定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。定的主要特征。肠道菌科细菌属和种的分类鉴定就是如此。不同微生物的不同重点鉴定指标不同微生物的不同重点鉴定指标霉菌等形体较大的真菌霉菌等形体较大的真菌以形态特征为主以形态特征为主放线菌和酵母菌放线菌和酵母菌形态和生理特征并用形态和生理特征并用细菌细菌形态、生理、生化遗传等指标形态、生理、生化遗传等指标病毒病毒电子显微镜、生化、免疫、致病性电子显微镜、生化、免疫、致病性三、

30、核酸的碱基组成三、核酸的碱基组成特点：特点：直接比较微生物之间的基因组差异直接比较微生物之间的基因组差异结果更加可信结果更加可信（与形态及生理生化特性的比较相比）（与形态及生理生化特性的比较相比）DNA的碱基组成( G+C mol%)各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，各种生物一个稳定的特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。碱基组成也不会发生明显变化。分类学上，用分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数占全部碱基的克分子百分数(G+Cmol%)来表示各类生物的来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。碱基因组成特征。1）更适合于细菌的分类鉴定。）更适合于细菌的分类鉴定。 细菌的细菌的GC%变化范围最大为变化范围最大为25-75% 2）主要用途）主要用途 鉴定对表型特征难区分的细菌鉴定对表型特征难区分的细菌 检验表型特征分类的合理性检验表型特征分类的合理性 从分子水平上判断物种的亲缘关系从分子水平上判断物种的亲缘关系3）使用原则：主要用于分类鉴定中的主要用于分类鉴定中的否定否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，