微生物与环境监测

1、Microbiology Department.College of Resource & Environment SWU. Li Yongl指示微生物（indicator microorganism）或称指示菌（indicator bacteria）l是在常规环境监测中，用以指示环境样品污染性质与程度，并评价环境卫生状况的具有代表性的微生物。l主要生物性污染：细菌、真菌、病毒等各类微生物均有。l细菌总数（total bacteria count）：指环境中被测样品，在一定条件下（培养基成分、培养温度和时间、pH、通气状况等）培养后所得的1m1或lg检样中所含的细菌菌落总数。l它反映环

2、境中异养型细菌的污染度，也间接反映一般营养性有机物的污染程度。1液态与固态对象中的细菌总数l天然水体、饮水、饮料等液体物l土壤、污泥、堆肥、食品、化妆品、药品等固态物，l常用倾注平板培养法或平板表面涂布培养法。国家卫生标准中规定：l营养肉汤琼脂培养基，l将经过一定倍数稀释的样品悬液，定量接种于琼脂培养基平板，或倾注混匀，或表面均匀涂布；l在有氧条件下，37培养48h观察平板上菌落生长结果。2空气中的细菌总数l平板暴露沉降法l仪器法 平板暴露沉降法：l采用直径9cm平皿，将营养琼脂平板在1.2 m高处暴露5 min，37培养48h，计数生长菌落数。l测定的结果不是十分准确。l经济方便，有实用价值

3、。l仪器法中以固体撞击式采样器多用。结果：l采用个m1为单位来表示 lcfu（colony forming unit）表示 ：指单位体积、单位表面积或单位质量检样中的菌落形成单位。 对象样品细菌总数/（cfu/ml或g） 霉菌数/（cfu/ml或g）饮用水*1100水矿泉水*2水源水5灌装水50体游泳池水*31 000消毒牛乳30 000全脂奶粉特级20 000食*一级30 000二级50 000肉灌肠类出厂20 000销售50 000糕点、面包冷加工出厂5 000100品销售10 000150糕点、面包冷加工出厂1 00050销售1 500500化*5眼部、口唇、口腔黏膜500100妆儿童化

4、妆品500100品其他化妆品1 000100药*6中药片剂10 000500丸 剂50 000500品散剂100 000500我国公共场所空气细菌总数标准*撞击法/（cfu/m3）沉降法/（个/皿） 适用范围1 0001035星级以下宾馆，饭店1 500102星级以下宾馆和非星级带空调宾馆，饭店2 500300普通饭店，招待所，酒吧，茶座，咖啡厅，图书馆，博物馆，美术馆，飞机客舱4 00040影剧院，音乐厅，录像厅，医院候诊室，候机室旅客列车车厢，轮船客舱，饭馆（餐厅）7 00075展览馆，商场（店），候车室，候船室4 00040游泳馆l霉菌和酵母菌数（fungi and yeast coun

5、t）是指环境中被测样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或lm1检样中所含的霉菌和酵母菌菌落数。l霉菌和酵母菌是异养型微生物，能致病或产毒素。 检测方法l用倾注培养平板法。多采用孟加拉红（虎红）培养基、高渗察氏培养基或加有抗菌素的马铃薯葡萄糖培养基。l环境样本作一定倍数稀释后，定量注入灭菌平皿。l倾入培养基混匀，凝固后置入2528 温箱培养35天观察平板上菌落生长情况并计数。结果：l以每毫升或每克检样中菌落形成单位（cfum1或g）来表示。l病原菌一般在环境中存在的数量不大，而且检测方法较复杂，难以直接测定。l其他微生物作为代表，间接指示肠道病原菌存在。l粪便污染指示菌。理想条件：（1）是

6、人畜粪便中的正常菌，且数量比粪便是人畜粪便中的正常菌，且数量比粪便中其他菌为多；中其他菌为多；（2 2）受人畜粪便污染的环境中可检出，而未）受人畜粪便污染的环境中可检出，而未受污染环境无该菌存在；受污染环境无该菌存在；（3 3）排出至环境后，该菌存活时间与肠道致）排出至环境后，该菌存活时间与肠道致病菌相当或略长；病菌相当或略长；（4 4）对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力）对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力略强于肠道致病菌；略强于肠道致病菌；（5 5）检出与鉴定方法比较简便迅速。）检出与鉴定方法比较简便迅速。l大肠杆菌较理想大肠杆菌较理想 ，10109 9个个mlml；但鉴定；但鉴定方法比较复

7、杂方法比较复杂 ；l含有大肠杆菌在内的总大肠菌群与粪大含有大肠杆菌在内的总大肠菌群与粪大肠菌群。肠菌群。 l总大肠菌群（总大肠菌群（total co1iform），也称），也称大大肠菌群肠菌群（coliform group或或co1iform）；）；l它们是一群能在它们是一群能在37 ，24 h内发酵乳糖内发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。性无芽孢杆菌。l形成特殊的菌落特征；形成特殊的菌落特征；l大肠菌群不是分类学上的一个名称，而大肠菌群不是分类学上的一个名称，而是人为定义的名词。是人为定义的名词。 肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：l埃希氏

8、菌属埃希氏菌属（Escherichia）在此菌属中与人类）在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希菌也生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希菌也称大肠杆菌；称大肠杆菌；l其次有其次有柠檬酸杆菌柠檬酸杆菌属或称枸橼酸杆菌属属或称枸橼酸杆菌属（Citrobacter）、）、l克雷伯菌属克雷伯菌属（Klebsiella）、）、l肠杆菌属肠杆菌属（Enterobacter）。）。1多管发酵法（multiple-tube fermentation），又称最大可能数法（most probable number，MPN）主要步骤：初发酵试验：l加入含有乳糖蛋白陈培养基（液）中，经37 培养24 h

9、，l观察产酸产气情况以初步判别是否有大肠菌群存在。 平板分离。l将初发酵试验产酸产气的发酵管分别接种在伊红美蓝琼脂平板上，置37培养24h，观察菌落形态。l挑选可疑为大肠菌群细菌的菌落涂片、革兰氏染色、镜检和进行证实试验。复发酵试验（证实试验）。l上述可能为大肠菌群的菌落再次接人乳糖蛋白陈培养液，置37温箱培养24h后观察结果。 观察结果：l复发酵试验中仍有产酸产气者即最后确证为有复发酵试验中仍有产酸产气者即最后确证为有大肠菌群存在。大肠菌群存在。l根据根据初发酵管初发酵管的数目及试验所用的检样量，利的数目及试验所用的检样量，利用数理统计原理或查阅专用统计表，最后算出用数理统计原理或查阅专用统

10、计表，最后算出每毫升检样中大肠菌群的最可能数目。每毫升检样中大肠菌群的最可能数目。 2.滤膜法（membrane filtration technique，MFT）l水样水样l滤膜滤膜l抽滤细菌抽滤细菌l滤膜培养，滤膜培养，l鉴定并计数典型菌落，鉴定并计数典型菌落，l计算总大肠菌群数。计算总大肠菌群数。主要步骤： 水样过滤培养 观察结果：l通过菌落特征及镜检菌体形态初步确定大肠菌群细菌；l凡革兰氏阴性无芽孢杆菌再接入含乳糖蛋白陈培养基中以确证为大肠菌群细菌；l最后根据通过水量及滤膜上长出的肯定为大肠菌的菌落数换算出每升水中大肠菌群数。结果表达方式 ：大肠菌群数l又称大肠菌指数，其表示方法有多种

11、，地表水环境又称大肠菌指数，其表示方法有多种，地表水环境质量标准、生活饮用水卫生标准、游泳池水卫生标质量标准、生活饮用水卫生标准、游泳池水卫生标准中以个准中以个L L表示之；食品卫生标准中用个表示之；食品卫生标准中用个m1m1表示。表示。大肠菌群值l是指水样可检出是指水样可检出1 1个大肠菌群细菌的最小水样容积，个大肠菌群细菌的最小水样容积，此值愈大即表示水中大肠菌群数愈少。此值愈大即表示水中大肠菌群数愈少。水 ：l大肠菌群值大肠菌群值1 000 m1大肠菌群数大肠菌群数土壤 l大肠菌群值大肠菌群值l g大肠菌群数大肠菌群数样品样品总大肠菌群总大肠菌群粪大肠菌群粪大肠菌群I200个个/L地表水

12、地表水*1II2 000个个/LIII10 000个个/L20 000个个/L40 000个个/L游泳池水游泳池水*218个个/L饮用水饮用水0个个/100 ml0个个/100 ml医院排放污水医院排放污水*3一级一级500个个/L二级二级1 000个个/L三级三级5 000个个/L方法评价（1）发酵法：（）发酵法：（MPN法）步骤多，耗时长，得到结法）步骤多，耗时长，得到结果需要果需要72h，不能及时指导实践工作。，不能及时指导实践工作。（2）滤膜法（）滤膜法（MFT法）：操作简单，可现场过滤水法）：操作简单，可现场过滤水样，避免运送水样的麻烦，且缩短时间。但此法不样，避免运送水样的麻烦，且

13、缩短时间。但此法不适用于混浊度高的水样。适用于混浊度高的水样。（3）总大肠菌群中细菌并非全部来自粪便，可能由）总大肠菌群中细菌并非全部来自粪便，可能由腐败的植物、土壤等其他环境带来，放可能导致某腐败的植物、土壤等其他环境带来，放可能导致某些不准确性。些不准确性。（4）饮水加氯消毒可杀灭大肠菌群而难杀灭）饮水加氯消毒可杀灭大肠菌群而难杀灭肠道病肠道病毒毒，故大肠菌群不能指示水中病毒，故大肠菌群不能指示水中病毒。l水中粪大肠菌群与肠道病原微生物具有相关水中粪大肠菌群与肠道病原微生物具有相关性，是粪大肠菌群作为指示菌的重要依据；性，是粪大肠菌群作为指示菌的重要依据； l由于人粪便中粪大肠菌群数多于粪

14、链球菌，动物由于人粪便中粪大肠菌群数多于粪链球菌，动物粪便中则相反，因此，在水质检测时可根据两菌粪便中则相反，因此，在水质检测时可根据两菌菌数比值不同而推测粪便污染的来源。菌数比值不同而推测粪便污染的来源。l粪大肠菌群粪链球菌的比值（粪大肠菌群粪链球菌的比值（FeFs）大于或）大于或等于等于4，则认为污染主要来自，则认为污染主要来自人粪人粪；l如小于或等于如小于或等于0.7，则认为污染主要来自，则认为污染主要来自温血动物温血动物的粪便；的粪便；l如比值小于如比值小于4而大于而大于2，则为，则为混合污染混合污染但以但以人粪为人粪为主主；l如比值小于如比值小于1而大于而大于0.7，则为混合污染但以

15、，则为混合污染但以动物动物粪便粪便为主。为主。 l产气英膜梭菌（产气英膜梭菌（Clostridium perfringenes）为）为革兰氏阳性具有芽孢、能还原亚硫酸盐的厌氧革兰氏阳性具有芽孢、能还原亚硫酸盐的厌氧杆菌。杆菌。l存在于人粪（成人每克粪内有此菌存在于人粪（成人每克粪内有此菌105106个）个）及温血动物的粪便内，可作为粪便污染指示菌。及温血动物的粪便内，可作为粪便污染指示菌。 优点：l有芽孢，对氯等消毒剂及外界不良环境具有较强的抵抗力，l能在水中较长期存在，l特别适用于在含有有毒物质（如氯等）的水体中检测是否有过粪便污染。 l蛭弧菌（蛭弧菌（Bdellovibrio）是一类以捕食

16、细菌为生的）是一类以捕食细菌为生的寄生菌，依靠对宿主菌的寄生和裂解使自身得到寄生菌，依靠对宿主菌的寄生和裂解使自身得到生长繁殖。生长繁殖。l当水体受到粪便污染时，可供蛭弧菌寄生的宿主当水体受到粪便污染时，可供蛭弧菌寄生的宿主增加，蛭弧菌因而大量繁殖，数量增加，从而对增加，蛭弧菌因而大量繁殖，数量增加，从而对污染起到指示作用。污染起到指示作用。致病菌的指示菌：1.2.志贺氏菌（Shigella）3.铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）4.金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）5.链球菌属（Streptococcus）6.破伤风梭菌（Clostridi

17、um tetani）肠道病毒的指示微生物 1.发光细菌细菌生物发光抑制试验（microtox）l一类能产生生物发光的细菌，统称为发光细菌（luminous bacteria）。 l目前发现的发光细菌分属弧菌属、发光杆菌属和异短杆菌属。发光细菌均为革兰氏阴性、兼性厌氧菌。l（0.4-1.0）（1.0-2.5）m，无孢子、荚膜，有端生鞭毛一根或数根，l最适生长温度为20-30，pH6-9，培养基中NaCl浓度2-40%。 试验原理：毒性测定：2.硝化细菌硝化作用抑制试验（nitrification inhibition test）323NONONH硝化抑制率3.藻类生长抑制试验（algoe gro

18、wth inhibition test）试验原理：l水质生物检测中比较常用的有硅藻、栅藻、小球藻等；l因为生长繁殖迅速，对水质变化敏感，可以通过测定水中这些藻类的生长量来测定水质污染情况或物质毒性程度 。测定藻类生长量的方法有下列几种：S1S2S3S4时间Lg生物量（待测物浓度S4S3S2S1）4.原生动物微尺度群落级毒性试验（microscale community-level toxicity test）试验原理l该方法中最成熟、应用最广泛的是PFU（Polyurethane foam unit，聚氨酯泡沫塑料块）法。l聚氨酯泡沫塑料块，可浸没于水体，能收集到85的种类，具有环境真实性；l

19、在一定时间内，PFU中原生动物种群构成会达到平衡，而有害污染物会破坏这一平衡。l通过比较试验组和对照组的群落结构和功能参数，即可评价水体质量与污染程度。1.脱氢酶活性试验（dehydrogenase actZvity test）l脱氢酶类能使被氧化有机质的氢原子活化并传递给特定的受氢体，l反映活性污泥对污水中有机质的氧化分解能力；l有毒物质的存在会使脱氢酶类活性降低并影响活性污泥的效果。l可通过指示剂的还原变色速度来确定脱氢酶活性，以判断毒性物质的作用强度。 2.呼吸抑制试验（respiratiion inhibition test ）l微生物在进行有氧呼吸、分解有机质的过程中会消耗氧，产生CO2，因此测定呼吸速率可以反映活性污泥中微生物的代谢速率，对分析废水生物可降解性有重要意义。l废水中有毒物质可以抑制微生物的呼吸，使其耗氧量和CO2产生量下降，下降的程度与毒性物质的浓度和强度有关。abcda：无毒，能被利用b：无毒，不能被利用c：有毒，能被利用d: 有毒，不能被利用基质浓度污泥相对耗氧速率与废水毒性、可降解性的关系100%相对耗氧速率特点：l美国美国AmesAmes教授，教授，19751975年，致突变性测试法，也称年，致突变性测