葡萄酒中8种生物胺的测定

1、葡萄酒中8种生物胺的测定 采用高效液相色谱法，柱前衍生，以1,7-二氨基庚烷为内标，测定葡萄酒中色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精胺含量。生物胺简介v生物胺是一系列含氮低分子有机碱, 可分为单胺和多胺两类, 包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质。v生物胺除了存在于各种动植物的组织中，还普遍存在于多种食品中，尤其是发酵食品如奶酪、发酵香肠、啤酒、黄酒、葡萄酒中等。生物胺的作用v微量的生物胺是生物体内正常的活性成分， 在生物活性细胞中具有重要功能，其中多胺对细胞的生长和增殖具有重要作用。v生物胺作为药用( 鹿茸中的药用成分) 有重要的生理功能, 如: 促进

2、生长、增强代谢活力、加强肠道免疫系统、控制血压, 并在神经系统中有活性, 在消除自由基方面也有一定的作用等。过量摄入的危害v当人体摄入过量的生物胺时，就会引起诸如头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等过敏反应，严重的还会危及生命。v生物胺中以组胺对人体健康影响最大，海产鱼中的青皮红肉鱼类含组胺较高，当鱼不新鲜或腐败时，鱼体中游离的组胺酸经脱羧酶作用产生组胺。v 许多国家已经作出了葡萄酒中组胺的限量范围。澳大利亚、匈牙利和瑞士-10 mg/L 法国-8 mg/L比利时-6 mg/L荷兰-3.5 mg/L德国-2 mg/L我们国家鱼类中组胺的限量鲐鱼100mg/100g其他含组胺的鱼类30mg/1

3、00kg葡萄酒中的生物胺葡萄酒中的生物胺含量与葡萄品种、气候条件、葡萄卫生状况、酒种、酿造工艺、储存条件等诸多因素相关。曾有报道研究了葡萄牙产区不同年份的葡萄酒中生物胺变化在2003 年的葡萄酒中，酪胺和异戊胺的含量较高在2004 年的葡萄酒中，腐胺为主要的生物胺 这可能是由于不同年份气候条件的变化，自然的微生物菌群与葡萄组分的不同而引起这种差异。高效液相色谱法测定8种生物胺原理v生物胺自身没有荧光和紫外的发色基团,因此需要经过衍生化处理，才能在色谱仪器检测出来。v丹磺酰氯（Dns-Cl）可以和伯胺或仲胺基上的活泼氢发生反应，脱掉一分子的HCl，生成具有紫外和荧光的衍生物。v以1,7-二氨基庚

4、烷为内标，经过氯仿正丁醇（1：1）液液萃取净化后，以丹磺酰氯为衍生剂，60衍生30min，采用C18柱分离，紫外检测器检测，外标法定量。样品处理萃取v量取葡萄酒5mL，加入适量氯化钠使溶液饱和。准确量取上述饱和后的试样提取液5mL，置于15ml离心管中，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH至12.0。v加入5mL的正丁醇氯仿(1:1)混合液，涡旋振荡5min，3600r/min离心10min，吸取上层有机相，再重复萃取2次，合并萃取液，混匀，取3mL萃取液并加入0.2mL1mol/L HCl ，混合后40水浴下氮气吹干，加入1mL 0.1mol/L HCl 复溶，待衍生。样品处理衍生v取上

5、述待衍生的试样溶液0.5mL 置10mL具塞试管中，加入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL（5mg/mL丙酮）丹磺酰氯衍生剂，振荡使混匀。v置60培养箱中反应30min，中间振荡2次，取出，分别加入100L谷氨酸钠（50mg/ml饱和碳酸氢钠溶液），振荡混匀，60保温15min。v取出，每个试管中加入1mL超纯水，在40水浴用氮气除去丙酮。加入3mL乙醚，振荡2min，静置分层后，吸取出上层有机相（乙醚层），重复萃取2次，合并乙醚萃取液，氮气吹干。v加入1.0mL甲醇使残留物溶解，振荡混匀，0.22m微孔滤膜过滤，滤液待测。标准系列v分别移取0.5mL的1.0、2.5、5.0、10.0、1

6、5.0、25.0、50.0 mg/L生物胺标准系列溶液，分别置10ml具塞试管中。v依次加入20L（100mg/L）内标使用液，加入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL（5mg/mL丙酮）丹磺酰氯衍生剂，振荡使混匀。置60培养箱中反应30min，以下操作同试样的衍生步骤。液相色谱参考条件v色谱柱为C18柱， (150 mm4.6mmID，5m)，紫外检测波长254nm，进样量10L，柱温30，流速：1.5mL/min。v梯度洗脱程序v流动相A为甲醇溶液，B为超纯水。时间时间0714202730353645流动相A55657070901001005555流动相B4535303010004545

7、标准色谱图v1色胺，2-苯乙胺，3腐胺，4尸胺，5组胺，61,7二氨基庚烷(内标)，7酪胺，8精胺，9亚精胺计算vX = Af/V1000 vX试样中生物胺的含量，单位为毫克每升（mg/L）；vA试样中各组分生物胺对应的量，单位为微克（g）；vf试样稀释倍数；vV取样量，单位为毫升（mL）。标准谱图AU0.000.100.200.300.400.500.600.700.80分钟0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.00

8、色胺 - 12.614苯乙胺 - 14.860腐胺 - 16.336尸胺 - 17.798组胺 - 22.623内标1，7-二氨基庚烷 - 23.664酪胺 - 26.646亚精胺 - 27.449精胺 - 30.014AU0.000.020.040.060.080.100.120.140.160.180.200.22分钟0.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.0024.0026.0028.0030.0032.0034.0036.0038.0040.0042.0044.00色胺 - 12.356腐胺 - 16.347尸胺 - 18.000组胺 - 22.659内标1，7-二氨基庚烷 - 23.6981 - 25.663酪胺 - 26.658亚精胺 - 27.458葡萄酒样品谱图注意问题:反应过程中决定作用的条件衍生剂浓度缓冲溶液pH 值衍生温度衍生时间衍生剂浓度v不同浓度的Dns-Cl 对生物胺衍生效果不同，实验显示5mg/mL对于本实验足够，高浓度的Dns-Cl 只会造成试剂浪费。v董伟峰等 丹磺酰氯作为生物胺柱前衍生试剂衍生化条件的研究丹磺酰氯作为生物胺柱前衍生试剂衍生化条件的研究 J .大连轻工业大连轻工业学院