第六章 酶的分离与纯化(20140320)

1、enzymatic analysis 酶学分析酶学分析第一节第一节酶的酶的分离纯化分离纯化第三节第三节影响酶促影响酶促反应的因素反应的因素第四节第四节同工酶同工酶的测定的测定第二节第二节酶活力测定酶活力测定1. 掌握酶的分离纯化的基本原理和基本方法2. 掌握酶活力测定的原理和酶活力的计算方法3. 熟悉同工酶测定的意义4. 了解测定酶促反应速度的方法目目的的要要求求细胞结构与酶分布第第 一一 节节酶酶 的的 分分 离离 纯纯 化化酶的提取、分离纯化技术路线酶的提取、分离纯化技术路线酶的分离纯化酶的分离纯化酶的分离纯化前的预处理酶的分离纯化前的预处理抽提抽提酶的分离纯化酶的分离纯化酶的纯度及活性检

2、验酶的纯度及活性检验酶的分离纯化一般包括三个基本步骤酶的分离纯化一般包括三个基本步骤(1)抽提：抽提：采样采样 细胞破碎细胞破碎 抽出全抽出全蛋白，多使用蛋白，多使用 盐析沉淀法。盐析沉淀法。(2) 部分纯化部分纯化: 初步的纯化，使用各初步的纯化，使用各钟柱层析法和电泳法。钟柱层析法和电泳法。(3)结晶或制剂结晶或制剂: 目标酶的进一步精目标酶的进一步精制纯化，可用亲和层析或制纯化，可用亲和层析或 HPLC一、酶的分离纯化前的预处理一、酶的分离纯化前的预处理抽提抽提（一）酶提取的影响因素（一）酶提取的影响因素1酶的储存及所有的操作都必须在低温条件下进行 2酶作为两性电解质，其结构受pH值的影

3、响。 3.酶和它的底物及其类似物、抑制剂等具有高的亲和性，会使酶的理化性质和稳定性发生一些有利的变化。 4重金属离子可能导致酶的失效，加入适量的螯合剂可有利于保护酶蛋白，避免因重金属离子而导致的变性。5微生物污染及蛋白酶的存在都可以导致酶被降解破坏，可以通过无菌处理或过滤除去其中的微生物，也可以在酶液中添加防腐剂，如叠氮钠等，同时为了防止蛋白质被蛋白酶降解，可以加入蛋白酶抑制剂 6搅拌时必须缓慢以减少泡沫的形成7酶蛋白质溶液浓度低，为了避免酶会经常迅速失活，经常在溶液中加入高浓度的其他蛋白质如牛血清白蛋白（BSA）。（二）酶原料的选择（二）酶原料的选择细胞产生的酶有二类：细胞产生的酶有二类：1

4、. 1. 由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为由细胞内产生后分泌到胞外发挥作用的酶，称为细胞细胞外酶外酶。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容。这类酶大部分属于水解酶。此类酶通常含量高，容易得到。易得到。2. 2. 在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催在细胞内合成后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为化作用，称为细胞内酶，细胞内酶，该类酶在细胞内往往与细胞器结该类酶在细胞内往往与细胞器结合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序合，不仅有一定的区域性，而且催化的反应具有一定顺序性。性。A. A. 了解所分离酶在细胞中分布了解所分离酶在细胞中分布 B. B

5、. 材料的获取材料的获取 在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含在提取某一酶时，首先应当根据需要，选择含此此酶最丰富的材料酶最丰富的材料。当然也要考虑原料的来源、取材方便、经济等因素。 如果目的是研究某一特定组织中的酶，自然无如果目的是研究某一特定组织中的酶，自然无选择材料可言。选择材料可言。 由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大到原料限制，成本又很大，因此，目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。例如分离纯化超氧化物歧化酶（SOD）、尽管在动物肝、肾、心

6、等器官内含量丰富，而血液含量较少，但考虑到取材容易、价廉及预处理方便等因素，实际应用中还是选择红细胞。许多酶存在于细胞内。许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破首先需要对细胞进行破碎处理。碎处理。1）机械破碎）机械破碎2）物理破碎）物理破碎3）化学破碎）化学破碎4）酶解破碎）酶解破碎JY92-II D超声波超声波细胞粉碎机细胞粉碎机细胞破碎珠细胞破碎珠高压细胞破碎机高压细胞破碎机DY89-I型型 电动玻璃匀浆机电动玻璃匀浆机（三）生物材料的破碎方法（三）生物材料的破碎方法机械破碎捣碎法研磨法匀浆法 物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法 化学破碎

7、有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的通过机械运动产生的压缩压缩力和力和剪切力剪切力，使组织、细，使组织、细胞破碎。胞破碎。通过各种物理因素的作用，通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理细胞

8、破碎方法及其原理生物材料的破碎方法生物材料的破碎方法破碎破碎方法方法机械机械 破碎破碎 化学化学 破碎破碎 酶法酶法 破碎破碎 物理物理 破碎破碎 高速高速组织组织捣碎机捣碎机 高压高压匀浆器匀浆器 研棒研棒匀浆器匀浆器 高速高速球磨机球磨机 研体研体 研磨研磨 1 1机械破碎法：机械破碎法： 破碎破碎方法方法机械机械 破碎破碎 化学化学 破碎破碎 酶法酶法 破碎破碎 物理物理 破碎破碎 渗透压法渗透压法 超声波超声波破碎破碎 冻结冻结- -融化法融化法 干燥法干燥法 2 2物理破碎法物理破碎法生物材料的破碎方法生物材料的破碎方法破碎破碎方法方法机械机械 破碎破碎 化学化学 破碎破碎 酶法酶法

9、 破碎破碎 物理物理 破碎破碎 表面活性剂表面活性剂 金属螯合金属螯合剂剂EDTAEDTA 有机溶剂有机溶剂 变性剂变性剂 3 3化学破碎法：化学破碎法： 生物材料的破碎方法生物材料的破碎方法破碎破碎方法方法机械机械 破碎破碎 化学化学 破碎破碎 酶法酶法 破碎破碎 物理物理 破碎破碎 外加外加酶制剂酶制剂 自溶法自溶法 4 4酶法破碎：酶法破碎： 生物材料的破碎方法生物材料的破碎方法（四）酶的抽提（四）酶的抽提酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为

10、酶的抽提。中的过程，也称为酶的抽提。 抽提方法及抽提液成分提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH26的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH812的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多

11、的非极性基团，则可用有机溶剂提取。提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。1.1.酶的来源不同，抽提的处理方法也有所不同酶的来源不同，抽提的处理方法也有所不同 （1 1）从动物组织或体液中分离酶蛋白）从动物组织或体液中分离酶蛋白 （2 2）从植物材料中分离酶蛋白）从植物材料中分离酶蛋白 （3 3）从微生物中分离酶蛋白）从微生物中分离酶蛋白 2.2.影响酶抽提的因素影响酶抽提的因素 （1）缓冲液）缓冲液 （2）pH值值 （3）温度）温度

12、 （4）盐）盐 （5）抽提液用量）抽提液用量（6）其他）其他（五）酶的浓缩（五）酶的浓缩提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发提取液或发酵液的酶蛋白浓度一般很低，如发酵液中酶蛋白浓度一般为酵液中酶蛋白浓度一般为0.10.11 1。因此，。因此，在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。在分离纯化过程中，酶溶液往往需要浓缩。 1减压蒸发减压蒸发 是采用抽气减压装置使待浓缩酶液在一定真空度下，在60以下的温度进行浓缩的一种方法。由于酶在高温下不稳定，容易变性失活。所以减压蒸发可以再较低温度下使溶液中部分溶剂气化蒸发达到浓缩的目的。2超滤（超滤（ultrafiltration）:浓缩蛋白质的重要方法浓

13、缩蛋白质的重要方法 超过滤是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只超过滤是在加压的条件下，将酶溶液通过一层只允许小分子物质选择透过微孔半透膜。而酶等大允许小分子物质选择透过微孔半透膜。而酶等大分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。分子物质被截留，从而达到浓缩的目的。 目标蛋白目标蛋白杂蛋白杂蛋白盐分子盐分子酶混合液酶混合液（1）平面膜）平面膜 将膜平铺在多孔支持板上，加压将膜平铺在多孔支持板上，加压（可带有搅拌）可将水及小分子（可带有搅拌）可将水及小分子溶质透过膜孔而排出，而大分子溶质透过膜孔而排出，而大分子（如酶）被截留。（如酶）被截留。 （2）管式膜）管式膜 将管式膜置于多孔硬管将管式膜置于多孔

14、硬管的外侧或内侧，酶溶液的外侧或内侧，酶溶液在管内或管外流动，水在管内或管外流动，水和分子溶质透过越滤膜，和分子溶质透过越滤膜，而大分子物质被截留而而大分子物质被截留而浓缩。浓缩。 （3）中空纤维）中空纤维 超滤方法的优点是：无热破坏、无相变化、保持原超滤方法的优点是：无热破坏、无相变化、保持原来的离子强度和来的离子强度和pH值，如果膜选择适当，浓缩过值，如果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行粗分离，成本也不高，故较为常程还可能同时进行粗分离，成本也不高，故较为常用。超滤可用于少量样品，也可用于工业生产规模，用。超滤可用于少量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超滤装置可供选择。现在已有各

15、种超滤装置可供选择。 凝胶过滤凝胶过滤又称为凝胶层析、分分子排阻层析子排阻层析，分子筛层析分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。3凝胶过滤（凝胶过滤（gel filtration） 凝胶层析柱中装有多孔凝胶多孔凝胶，当含有各种组分的混合溶液流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不能进入凝胶的微孔，只能分布于凝胶颗粒的间隙中，以较快的速度流过凝胶柱。较小的分子能进入凝胶的微孔内，不断地进出于一个个颗粒的微孔内外，这就使小分小分子物质向下移动的速度比大分子的子物质向下移动的速度比大分子的速度慢，从而使混合溶液中各组分

16、速度慢，从而使混合溶液中各组分按照相对分子质量由大到小的顺序按照相对分子质量由大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目先后流出层析柱，而达到分离的目的的。优点是：条件温和，操作简便，也没有优点是：条件温和，操作简便，也没有pH值与离子强度值与离子强度等的改变，但可能导致蛋白质回收率降低。等的改变，但可能导致蛋白质回收率降低。 4沉淀法沉淀法 用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀，再将沉淀溶解在小体积的样品溶液中。优点： 浓缩的倍数可以很大 能达到初步纯化的目的缺点： 往往造成酶蛋白的损失，同时应避免酶的变性失效5吸附法：吸附法： 利用聚丙烯酰胺凝胶等能吸水膨润，而酶等利用聚丙烯酰胺凝胶等能吸水膨润

17、，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩。大分子被排阻于胶外的原理进行的一种浓缩。 优点： 条件温和，操作简便，也没有pH值与离子强度等的改变 缺点： 只能用于体积较小的酶抽提液6透析浓缩法：透析浓缩法： 将蛋白质溶液放入透析袋中，然后在密闭容器中缓慢减压，水及无机盐流向膜外，蛋白质即被浓缩。 用聚乙二醇（PEG）涂于装有蛋白质的透析袋上，置于4下，干粉PEG吸收水分和盐类，大分子溶液即被浓缩。 优点：优点： 条件温和，操作简便，快速有效条件温和，操作简便，快速有效 缺点：缺点： 只能用于小量样品，而且成本很高。只能用于小量样品，而且成本很高。 7反复冻融反复冻融 原理：抽提液相对纯水，

18、会发生融点升高、冰点降低原理：抽提液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。的现象。方法一：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓融解，这方法一：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓融解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面，而酶样，几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液；等则融解并集中于下层溶液；方法二：先让酶溶液缓缓冻融，然后再移去形成的冰方法二：先让酶溶液缓缓冻融，然后再移去形成的冰块。块。优点：优点：条件温和，操作简便条件温和，操作简便缺点：缺点：需要大功率的制冷设备需要大功率的制冷设备 。 8冷冻干燥法冷冻干燥法 将酶溶液冻成固体后抽真空，使水分子直接从将酶溶液

19、冻成固体后抽真空，使水分子直接从表面升华，最后酶呈干粉状。表面升华，最后酶呈干粉状。 优点：优点：能使多种酶活性长期保存能使多种酶活性长期保存 缺点：缺点：需要冷冻干燥需要冷冻干燥注意事项：注意事项：避免抽提液混有有机溶剂避免抽提液混有有机溶剂 避免抽提液混有磷酸盐避免抽提液混有磷酸盐 二、酶分离纯化二、酶分离纯化 常用的提纯方法常用的提纯方法性性 质质方方 法法溶解度改变离子强度 改变pH温度 改变介电常数电荷极性离子交换层析 电泳 等电聚焦大小或重量离心分离 透析超滤 凝胶过滤亲和部位亲和层析、染料配体亲和层析、免疫吸附层析、 共价层析酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度

20、酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度 （一）根据酶的溶解度进行分离（一）根据酶的溶解度进行分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度溶解度降低降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理 盐析沉淀法盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离沉淀分离方法分离原理有机溶剂沉淀有

21、机溶剂沉淀法法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析盐析现象现象。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用

22、硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。1.盐析盐析由于各种酶在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度不由于各种酶在不同浓度的硫酸铵溶液中溶解度不同，故可采用分级沉淀法分离酶。同，故可采用分级沉淀法分离酶。硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度沉淀析出的蛋白质沉淀析出的蛋白质20%纤维蛋白原纤维蛋白原28%-33%血红蛋白血红蛋白35%拟球蛋白拟球蛋白50%球蛋白球蛋白100%清蛋白清蛋白硫酸铵分级沉淀法硫酸铵分级沉淀法硫酸铵分级改进法（反抽提法）硫酸铵分级改进法（反抽提法） 原理原理 将包括要分离的酶在内的多种蛋白质一起先沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的

23、硫酸铵溶液来抽提沉淀物。这种方法的优点在于许多蛋白质从溶液中沉淀析出十分容易，是非特异性的，但反过来，沉淀在溶液中溶解却有相当高的特异性。 Ecoli RNA聚合酶通常在4250硫酸铵饱和度时沉淀。 等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质在不同pH下有着不同的溶解度，离等电点越远溶解度度越大，离等电点越近溶解度越小，等电点处溶解度最小。 利用两性电解质在等电点时溶解度低，以及不同的酶蛋白具有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出。有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20时水的介电常数为80，而82乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的

24、介电溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂与水作用使蛋白质的表面水化层厚度压缩，导致蛋白质脱水，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析

25、出。 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 （二）根据酶的电荷极性进行分离（二）根据酶的电荷极性进行分离分离方法 分离依据离子交换层离子交换层析析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力亲和力不同而达到分离目的电泳电泳利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离，鉴定或提纯的技术。 分离方法 分离依据等电聚焦等电聚焦电泳电泳蛋白质分子在偏离其等电点的pH条件下带有电荷，因此可以在电场

26、中移动；当蛋白质迁移至其等电点位置时，其静电荷数为零，在电场中不再移动，据此将蛋白质分离。 离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交阳离子交换剂换剂和阴离子交换剂阴离子交换剂。离子交换层析离子交换层析原理：当酶蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这

27、类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。酶纯化过程中常用的离子交换介质酶纯化过程中常用的离子交换介质类型商品名功能基因小分子交换容量阴离子交换剂弱碱性AE-Cellulose氨乙基-(CH2) 2-NH20.3-0.4中等碱性DEAE- CelluloseDEAE-SepHadexA-25,50DEAE-SepHaroseCL-6B二乙基氨基乙基-( CH2) 2-NH(C2H5) 20.2-103

28、-410-14强碱性CellexGETEAE-CelluloseQAE-SepHadexA-25,50胍乙基(CH2)2-NH -C-NH2三乙氨基乙基- (CH2)2-N-(C2H5)6二乙基-(2-羟丙基)-氨乙基0.3-0.50.4-0.75-类型商品名功能基因小分子交换容量阳离子交换剂弱酸性CM-celluloseCM-SepHadexC-25,50CM-SepHaroseCL-6B 羧甲基-CH2-COO-0.6-1.04-511-15中等酸性CellexP磷酸-P(O)0.8-7.4强酸性SP-SepHadex C-25,50磺丙基-(CH2)3-SO3-2-2.6酶纯化过程中常用

29、的离子交换介质酶纯化过程中常用的离子交换介质 离子交换柱的柱长通常为柱径的45倍。离子交换剂如CM-纤维素或DEAE-纤维素，在装柱前应充分溶胀（在10倍量的蒸馏水中溶胀一夜或在100沸水浴中溶胀1h以上），倾析除去过细粒子，然后用23倍量0.5molL HCl和0.5molL NaOH溶液进行循环转型，每次转型至少维持1015min。对于阳离子交换剂，转型次序为酸一碱一酸，而阴离子交换剂则为碱一酸一碱，经平衡缓冲液平衡，即可进行层析操作。 使用过的离子交换剂可用2molL NaCl彻底洗涤，阳离子交换剂转成H+型或盐型贮存，弱碱性阴离子交换剂以OH-型贮存，中等和强碱性阴离子交换剂以盐型贮存

30、，并且加入适当的保存剂， 表7-4 离子交换剂保存剂保存剂浓度（%）在下列介质中具有保存活性洗必太0.002中性、弱酸和弱碱苯基汞盐0.001弱碱三氯丁醇0.05弱酸甲 苯0.03所有介质硫柳汞0.02弱酸叠氮化钠0.02中性、弱酸和弱碱离子交换层析要取得好的效果应注意以下几点：在上样时加入的蛋白量及样品体积尽可能小，才能得到较高的分辨率。正确地选择离子交换剂电荷基团，确定是选择阳离子交换剂还是阴离子交换剂，这要取决于被分离的物质在其稳定的pH值下所带的电荷，如果带正电荷，则选择阳离子交换剂；如带负电荷，则选择阴离子交换剂。正确地选择离子交换剂基质。聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一

31、般常用于分离小分子物质；纤维素、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数来表示，目数越大表示直径越小。洗脱时，可以通过改变洗脱剂的离子强度，减弱蛋白质与载体亲和力的方法，逐一洗脱各蛋白组分；也可通过改变洗脱剂的pH值，使蛋白质的有效电荷减少而被洗脱。 （三）根据酶的分子大小和重量分离（三）根据酶的分子大小和重量分离方法 分离依据离心分离离心分离离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。凝胶过滤凝胶过滤以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的

32、相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。透析透析小分子物质能透过生物半透膜，而大分子蛋白质不能透过，从而将酶抽提液中的盐类、有机溶剂、抑制剂等 分离出去。 方法 分离依据超滤超滤在一定的压力下，当原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。 1离心分离离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和

33、离心条件。常速离心机又称为低速离心机常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力（RCF）在1104 g 以下。用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机高速离心机的最大转速为（12.5）104 r/min ，相对离心力达到 11041105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。有些高速离心机是高速冷冻离心机。有些高速离心机是高速冷冻离心机。超速离心机超速离心机的最大转速达 (2.512)104 r/min，相对离心力可以高达 5105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子等的分离纯化。（1）差速离心：差速离心法

34、是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。将动植物组织制成匀浆，在适当的悬浮介质中差速离心法可以分离细胞线粒体。在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。细胞器沉降先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。（2）等密度梯度离心：等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液

35、包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。在离心力的作用下，不同浮力密度的颗粒或向下沉降，或向上漂移，只要时间足够长，就可以一直移动到与他们各自的浮力密度恰好相当的位置（等密度点），形成区带。区带的形成与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。（四）根据酶的亲和部位进行分离（四）根据酶的亲和部位进行分离 分离方法分离依据亲和层析亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而专

36、一而又可逆的亲和力又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化亲和超滤亲和超滤需要提纯的粗酶自由存在于抽提液时，可以顺利通过截留分子量较大的超滤膜。但当酶与大分子亲和配体混和，形成酶-配体复合物后，由于其分子量远大于超滤膜的截留分子量，因而被截留。 酶与底物酶与底物,酶与竞争性抑制剂酶与竞争性抑制剂,酶与酶与辅助因子辅助因子,抗原与抗体抗原与抗体，酶酶RNARNA与互与互补的补的RNARNA分子或片段分子或片段,RNARNA与互补的与互补的DNADNA分子或片段分子或片段等之间等之间，都是具有专一而又可逆亲和力的生物分子对。故此,亲和层析在酶的分离纯化中有重要应用.亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有

37、的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。亲和层析的四个要素亲和层析的四个要素三、酶的纯度及活性检验三、酶的纯度及活性检验（一）酶纯度的检验（一）酶纯度的检验一些常用的检验酶纯度的方法方 法备 注超速离心对检测少量杂质（5）时不太满意，当存在络合一解离体系时也会出现问题电 泳必须在多种pH值下进行，在单一pH值下，两种酶可能一起移动SDS电泳检测与亚基分子量不同的杂质的一个主要方法，对检测制备物中蛋白水解酶的水解作用非常有用，酶由不同亚基组成时，会出现多条区带等电聚焦检测杂质的极灵敏方法，有时当存在表观异质时，会出现假象N-末端分析应该指明只存在单一多肽链，有些酶具有封闭和N-末端，

38、另一些酶则由二硫键连接的几条肽链组成免疫技术高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦第二节第二节 酶活力测定酶活力测定酶活力（酶活力（enzyme activityenzyme activity）的概念）的概念 酶活力也称为酶活性，酶活力也称为酶活性，指酶催化一定化学反应的能指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的力。酶活力的测定实际上是测定一个被酶所催化的化学反应的速度。酶活力的大小可用在一定条件下，化学反应的速度。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。度愈

39、大，酶活力愈高，反之活力愈低。 注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。内产物的生成量为好。 酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。 一、酶活力单位一、酶活力单位n定义：定义：在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成在规定条件下，酶促反应在单位时间内生成一定量的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。一定量的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。 惯用单位：惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。酶活性测定方法的建立者所规定的单位。ALT的比色测定法有金氏法、穆氏法、赖氏法的比色测定法有金氏法、

40、穆氏法、赖氏法 金氏法： 1mol丙酮酸/每100ml血清(37,60min)穆氏法： 5g丙酮酸/ 1ml血清(37,60min)赖氏法：在规定条件下（血清1ml，反应液总量3ml，25，作用1min，内径1cm比色杯）测定340nm波长处，吸光度减少值，每减少0.001为一个酶活性单位。 国际单位国际单位 ：1IU1IU指在规定条件（最适指在规定条件（最适pHpH，最适底物浓，最适底物浓度）下，每分钟转化度）下，每分钟转化1 1 molmol底物所需的酶量底物所需的酶量, ,或是转化或是转化底物中底物中1mol1mol的有关基团的有关基团所需所需的酶量的酶量, ,单位为单位为1 1 mol

41、 mol /min,/min,或或1 mol.min-1KatalKatal单位单位：1Katal1Katal指在规定条件下，每秒钟转化指在规定条件下，每秒钟转化1mol1mol底物所需的酶量，底物所需的酶量，单位为单位为1mol/s或或 1mol.s-1 Katal与与IU的换算关系的换算关系 ：1Katal=601Katal=6010106 6IU=IU=6107IU1IU = 16.67nkatal 比活力比活力 （specific activity） 在特定的条件下，单位质量（在特定的条件下，单位质量（mg）蛋白质或）蛋白质或RNA所具有的酶活力单位数所具有的酶活力单位数酶比活力酶比活

42、力=酶活力（单位）酶活力（单位）/mg（蛋白质或（蛋白质或RNA）。）。 比活力比活力作为酶制剂纯度的常用指标作为酶制剂纯度的常用指标 二、酶活力测定方法二、酶活力测定方法（一）按照（一）按照酶促反应时间分类酶促反应时间分类 连续监测法连续监测法 固定时间法固定时间法以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性 在多个时间点连续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度 n特点：特点： 优点优点是简单是简单。 缺点缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线性期。 n注意：

43、注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以固定时间法时间段的预定不宜太长，一般以30306060分分钟为宜。钟为宜。 1.1.固定时间法固定时间法n定义：定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减测定酶促反应开始后一段时间内底物的减少量或产物的增加量。（少量或产物的增加量。（两点法）两点法）2.2.连续监测法连续监测法n原理：原理：n定义：定义：测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。测定底物或产物随时间的变化量，又称为速率法。 该方法每隔一定时间（该方法每隔一定时间（10s10s60s60s）测定一次底物）测定一次底物或产物的变化量，连续测定多点，然后将测定结果对或产物的变化量，连续测

44、定多点，然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度曲线。时间作图，绘制反应速度曲线。 n特点：特点： 在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法在方法设计上，选择紫外吸收法或色原显色法 缺点：缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、要求高，要求能够精确地控制温度、pHpH值和底物浓度等反值和底物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自应条件，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些要求。动生化分析仪都能达到这些要求。优点优点: : 能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反应的线性期，结果准确可靠，

45、标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。结果准确可靠，标本和试剂用量少，可在较短时间内完成测定。 （二）按监测方法分类法（二）按监测方法分类法1分光光度法及比色法 2酶偶联测定法 3荧光法和同位素法 4量气法 5电化学测定法 几种常用酶活的测定方法优缺点及应用范围几种常用酶活的测定方法优缺点及应用范围 方法方法介绍/原理检测特点/优缺点应用/举例酶偶联测定法将该酶作为试剂加入到待测的酶促反应体系中，使本来不易直接测定的反应转化为可以直接监测的系列反应。加入的偶联工具酶应该高度纯净、专一而且过量，使测得的反应速度和酶浓度间有线性关系。偶联指示酶的用量一般应为被测酶的100倍左右。谷草转氨酶活性

46、的测定量气法在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很容易计算出气体变化量。适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶华勃呼吸仪Van-slyke测二氧化碳结合力氧化酶脱羧酶还原酶方法方法介绍/原理检测特点/优缺点应用/举例比色法比色法是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色。需作标准管或标准曲线测定淀粉酶的Somogyi法，碱性磷酸酶的Bodansky法、King法分光光度法产物和底物在某一波长或波段上，有明显的特征吸收差别。简便易行，测定一般可在较短的时间内完成。缺点：灵敏度不高NAD（P）H反应系统设计得当可用

47、于各种酶的测定方法方法介绍/原理检测特点/优缺点应用/举例荧光法酶反应的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变化的速度可代表酶反应速度。不易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准脱氢酶等反应适于酶量或底物量极低时的快速分析多用于研究实验室同位素法用同位素标记的底物进行酶测定。灵敏度高对人体有害，操作麻烦C12标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶三、影响酶活测定的干扰因素三、影响酶活测定的干扰因素（一）其他酶和物质的干扰（二）酶的污染（三）非酶反应 （五）沉淀形成（四）分析容器的污染如酶偶联法测 ALT时，由于反应体系中含有大量NADH和LD 组织匀浆中往往含有NADH-细胞色素C还原酶，它将干扰各种还原酶的测定 五 标本的采集、运输与保存的技术误差因素（二）抗凝剂 大部分酶在细胞内外浓度差异明显，且其活性远高于血清，少量血细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高 （一）溶血（三）温度草酸盐、枸橼酸盐和EDTA等抗凝剂为金属螯合剂，可抑制需要Ca2+的酶一般应在血清分离后的当天进行测定，否则应放冰箱冷藏 不同贮存室温体液酶的稳定性（活性变化小于10%） 酶室温（25） 冷藏（0-4） 冰