有机分离分析技术-分离技术ppt

1、有机分离分析技术环境化工学院魏俊富2010.03.08许世超任课教师魏俊富： 院长，教授，博导 联系方式：24528180研究方向： 功能高分子（膜改性及应用方向） 纤维油剂（纺织助剂方向）任课教师 许世超： 副教授，硕导 联系方式：24528356/24528538Email: xsc_ 研究方向： 微纳米材料，环境微生物，DNA检测课程目的以科研及实际工作常用的实际分析程序为以科研及实际工作常用的实际分析程序为主线，综和运用各种近现代方法和手段，主线，综和运用各种近现代方法和手段，对一些复杂化学品进行分离、富集、分析对一些复杂化学品进行分离、富集、分析结合实验使同

2、学了解并掌握这一领域的概结合实验使同学了解并掌握这一领域的概况、基础知识和常用方法。况、基础知识和常用方法。了解前沿的技术和应用，掌握新的分离、了解前沿的技术和应用，掌握新的分离、富集、分析的基本步骤和程序。富集、分析的基本步骤和程序。 主要内容 经典分离与提纯方法介绍: 萃取法, 蒸馏，重结晶, 透析，升华，分馏，柱色谱（离子交换，常规硅胶柱色谱等），TLC等 近现代仪器分离方法： GC，HPLC，GPC (Depends) 装置与操作、实例 膜技术介绍及应用 课程实验：GC应用，HPLC应用，膜技术的应用，TLC应用，FPLC应用. 重点是介绍分离方法的原理（如果时间足够），以及锻炼实验操

3、作技术课时分配1传统分离分析方法介绍传统分离分析方法介绍2气相色谱法气相色谱法-原理、色谱柱介绍原理、色谱柱介绍3气相色谱法气相色谱法-实际应用、仪器介绍实际应用、仪器介绍4经典柱色谱、离子交换、经典柱色谱、离子交换、TLC应用应用5高效液相色谱高效液相色谱-原理、色谱柱介绍原理、色谱柱介绍6高效液相色谱高效液相色谱-仪器介绍、应用仪器介绍、应用7吸附分离技术吸附分离技术8膜分离技术膜分离技术9纤维状分离材料及其性能研究纤维状分离材料及其性能研究10气相色谱应用实验气相色谱应用实验1112液相色谱应用实验液相色谱应用实验1314中空纤维膜组件分离蛋白质溶液中空纤维膜组件分离蛋白质溶液1516薄

4、层色谱应用薄层色谱应用1718经典柱色谱应用经典柱色谱应用1920考试考试本课程主要参考文献http:/ (Chinese)http:/teaching.shu.ac.uk/hwb/chemistry/tutorials/chrom/gaschrm.htm /wiki/High_performance_liquid_chromatography /topics/liquid/chromatography.html 预测（in 20min）姓名，专业，方向，毕业院校，本科所学专业，现

5、在导师题目： 你了解哪些分离、富集技术，尝试举例 有一个液、固混合物，请设计简单方案进行分离、 纯化。 一个未知液状、透明的样品中可能含有，阴离子表面活性剂 、非离子表面活性剂、染料、其他添加剂，可否设计方案将 其一一分离并鉴定，尝试列出流程图。 能否利用TLC，HPLC进行未知物的定性分析？依据？第一季 传统分离方法介绍主要内容概述概述传统分离方法传统分离方法近代色谱分离方法近代色谱分离方法其他方法其他方法1.1 概述1.1 概述n在实际分析工作中，遇到的样品往往含有多种组分，进行测定时彼此发生干扰，不仅影响分析结果的准确度，甚至无法进行测定。n欲测组分的含量极微,测定方法的灵敏度不够.充分

6、利用有机分离分析技术 有机分离分析技术是一门涉及了物理分离、化学分离、色谱分离等分离、纯化、富集的技术，并通过利用传统或现代化手段对所获得的产品进行分析、表征、解释的一门综合性很强的课程。 现代分离分析技术的特点：充分利用色谱等现代化分离手段，例如FPLC，HPLC，AGE，对未知物进行分离、纯化-富集、分析。1.1 概述1.1 概述-常用（传统）分离方法常用（传统）分离方法沉淀分离法沉淀分离法溶剂萃取分离法溶剂萃取分离法色谱分离法色谱分离法挥发和蒸馏分离法挥发和蒸馏分离法其他分离方法其他分离方法色谱法色谱法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法平板色谱法平板色谱法柱色谱法柱色谱法薄薄层层色

7、色谱谱法法纸纸色色谱谱法法气气液液色色谱谱法法气气固固色色谱谱法法分分配配色色谱谱法法吸吸附附色色谱谱法法离离子子交交换换色色谱谱法法排排阻阻色色谱谱法法超临界流体色谱法超临界流体色谱法亲亲和和色色谱谱法法经典经典高效高效1.2 传统分离方法介绍1.2 传统分离方法介绍传统分离方法介绍1.2.1沉淀分离和共沉淀分离沉淀分离和共沉淀分离3/ziyuan/xinshiji/9/main/chap3/3-2/a3-3-2-2.htm沉淀分离法沉淀分离法: 在样品溶液中加入有机在样品溶液中加入有机(草酸、铜铁试剂，草酸、铜铁试剂，etc.)或者无机或者无机(NaOH

8、, SO42-, X-, etc.)沉淀剂沉淀剂,有选择地沉淀某有选择地沉淀某些离子，而与其它离子分离开来的方法。些离子，而与其它离子分离开来的方法。共沉淀分离共沉淀分离:利用共沉淀利用共沉淀现象，以加入有机现象，以加入有机(动物胶、丹动物胶、丹宁甲基紫宁甲基紫)或者无机或者无机(Fe(OH)3, Al(OH)3, 硫酸铅硫酸铅-硫酸鋇，磷酸硫酸鋇，磷酸铵镁铵镁-砷酸铵镁砷酸铵镁)沉淀试剂，将痕量组分定量地沉淀下来，溶沉淀试剂，将痕量组分定量地沉淀下来，溶解在少量溶剂中，达到分离与富集的目的，。解在少量溶剂中，达到分离与富集的目的，。狭义的讲：狭义的讲：在含有被分离物质的水溶液中，加入萃取在含

9、有被分离物质的水溶液中，加入萃取剂和与水不相混溶的有机溶剂，震荡，利用物质在两剂和与水不相混溶的有机溶剂，震荡，利用物质在两相中的分配不同的性质，使一些组分进入有机相中，相中的分配不同的性质，使一些组分进入有机相中，使另一些组分仍留在水相中，从而达到分离的目的。使另一些组分仍留在水相中，从而达到分离的目的。1.2.2 萃取分离法萃取分离法例如：乙酰基例如：乙酰基-萘萘酚的合成，需用二酚的合成，需用二氯甲烷萃取纯化氯甲烷萃取纯化1.2.2 萃取分离法萃取分离法ChloroformH2O上层？：上层？：下层？：下层？：萃取体系萃取体系 螯合物萃取体系螯合物萃取体系 离子缔合物萃取体系离子缔合物萃取

10、体系 溶剂化合物萃取体系溶剂化合物萃取体系 共价化合物共价化合物(简单分子简单分子)萃取体系萃取体系1.2.2 萃取分离法（不做重点）萃取分离法（不做重点）原理介绍：参考相关文献原理介绍：参考相关文献http:/ Chinese1.3 近代色谱分离法1.3.1 1.3.1 纸色谱纸色谱 (简单介绍简单介绍) 纸色谱 (Paper chromatography)以滤纸条为固定相，在纸条上点上待分离的混合溶液的样点，将纸条下端浸入流动相溶剂中悬挂，溶剂因为毛细作用沿滤纸条上升，样点中的溶质从而被分离。 氨基酸的纸色谱分离演示（准备及操作过程）氨基酸的纸色谱分离演示（准备及操作过程）纸纸色谱色谱 p

11、aper chromatography以以分配色谱为例进行讨论分配色谱为例进行讨论取一取一大小适宜的滤纸条大小适宜的滤纸条在在滤纸条的下端点上标准和样品滤纸条的下端点上标准和样品放在放在色谱筒中展开色谱筒中展开取出，标记前沿，取出，标记前沿，凉干凉干着色，分析着色，分析固定相固定相 滤纸上的滤纸上的H2O流动相流动相 展开剂展开剂1.3.3 薄层色谱薄层色谱薄层色谱理论的提出：薄层色谱理论的提出：1938年由年由Izmailov,和Shraiber最早使用薄层色谱法，最早使用薄层色谱法，直到直到1958年年stahl发明了薄层板的涂层装置，可以制发明了薄层板的涂层装置，可以制得均匀的薄层板，对

12、吸附剂和色谱使用条件进行了得均匀的薄层板，对吸附剂和色谱使用条件进行了标准化，这使得薄层色谱快速发展，并得到了大规标准化，这使得薄层色谱快速发展，并得到了大规模的应用。模的应用。（一）概述：是一种微量、快速的分离分析方法。它是把吸附剂或载体均匀地涂在玻璃板上使成一层，将欲分离的样品点加在薄层板上，然后用合适的溶剂展开，以达到分离和鉴定的目的。与柱色谱用的相同，有硅胶、氧化铝、纤维素等。200目以下160200目 适用于少量样品（几微克）的分离，也适用于量较大样品的精制、纯化。 如将薄层面积加宽涂层厚度加厚，样品点成一条线，可以分离几百毫克的样品。 设备简单，制板、显色及实际操作都不复杂； 分离

13、速度快，一般几十分钟就可达到分离的目的，比纸色谱和经典柱色谱要快很多，后者长大数小时，甚至数天； 分辨率高，比经典柱色谱及纸色谱分离得更加清晰，拖尾小，分辨率更高，可达4003000理论板数； 灵敏度高。鉴定的低限约为纸色谱的1/101/100； 采用惰性载体，使得在鉴定无色化合物时，可能采用像硫酸之类的强腐蚀性试剂和较高温度； 不仅便于微量分离和鉴定，而且也能同柱色谱一样用于大量制备的目的。（二）基本原理：薄层色谱吸附色谱（硅胶、氧化铝为吸附剂）分配色谱（纤维素作为固定相）离子交换色谱一般吸附色谱用得较多，在这里重点讨论。一般指气相或溶解于溶液中的溶质在相边界（即固体表面）上的浓缩。因此，溶

14、质分离的关键在于吸附剂的表面性质。溶质在固定相和移动相中的状态以下图表示：S吸附剂 M移动相溶质、溶剂分子 一般讲，影响溶液中溶质的系数的因素比气体状态下复杂。因为溶剂分子在固体表面能与溶质分产生竞争吸附作用。2. 吸附平衡：吸附平衡：在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附平衡。称为吸附平衡。对于气对于气-固相的吸附解析受温度与浓度明显，但是对于液固相的吸附解析受温度与浓度明显，但是对于液-固相的吸附解析影响较小，在常压、室温

15、下，则液体在固固相的吸附解析影响较小，在常压、室温下，则液体在固体表面的吸附等温线接近直线关系，吸附系数体表面的吸附等温线接近直线关系，吸附系数K是常数。是常数。K=溶质在吸附剂中的浓度溶质在展开剂中的浓度 薄层色谱斑点面积随着展开时间延长而逐渐变大，这称为斑点的扩展。扩展原因扩散扩展慢平衡流动模型def2d2e2f2d扩散扩展引起斑点扩展的流出曲线偏差e慢平衡引起斑点扩展的流出曲线偏差f 流动模型引起斑点扩展的流出曲线偏差 斑点总扩展，在色谱上称为流出曲线的标准偏差， 其为相应的峰高0.607倍时流出峰宽度的一半。斑点扩展e2直接比例于移动相的速度，即展开剂的移动速度愈快，斑点扩散愈严重(未

16、充分平衡)，反之就愈轻。引起的扩展是因为溶质从一端展开到另一端所走过的路径不同，有的比平均值大，有的比平均值小，各分子到达终点的时间有差别，造成了斑点面积逐渐扩展变大。d2 2DtD移动相分子和溶质分 子相互扩散的扩散系数t扩散时间因此，D增大 扩展增大； t延长 扩散增大； 增大 扩展减小。tL/（t-时间；L-展开距离；v-展开剂速度）由于固体吸附剂挡住由于固体吸附剂挡住去路的程度不同所致去路的程度不同所致（三）装置和操作技术1. 装置:玻璃板玻璃板涂布器涂布器干燥器干燥器微量滴管微量滴管色层槽色层槽紫外灯紫外灯喷雾器喷雾器2. 固定相、粘合剂和移动相 建立一个比较理想的薄层色谱条件必须考

17、虑三方面问题：样品的性质样品的性质固定相固定相移动相移动相决定因素，选择固定相和移动相的依据。决定因素，选择固定相和移动相的依据。固定相：常用的有固定相：常用的有a.硅胶硅胶 b.氧化铝氧化铝 c.纤维素纤维素 ； 其它固定相有：硅藻土、醋酸纤维素、聚酯胺。其它固定相有：硅藻土、醋酸纤维素、聚酯胺。粘合剂粘合剂：湿法涂层都要加粘合剂，最常用的是火段石膏、羧酸：湿法涂层都要加粘合剂，最常用的是火段石膏、羧酸 基纤维素钠（基纤维素钠（CMC）、淀粉。）、淀粉。移动相移动相：在薄层色谱中称为展开剂。薄层色谱分离的好坏取决：在薄层色谱中称为展开剂。薄层色谱分离的好坏取决 于对展开剂的选择。于对展开剂的

18、选择。 展开剂对样品应有足够的溶解度，并且能够使样品在固定相移动中。 样品中化合物的移动速度及Rf值，与溶剂的极性有关，溶剂的极性可以用介电常数来衡量。 一般可按下面的办法选择合理的展开剂：见右图。即在薄层板上点若干在薄层板上点若干同样的混合样品，待溶剂蒸发干后，用同样的混合样品，待溶剂蒸发干后，用充满各种展开剂的毛细管接触每个点中充满各种展开剂的毛细管接触每个点中心，这时溶剂呈圆形向外扩散。合适的心，这时溶剂呈圆形向外扩散。合适的展开剂会使混和燃料的成分各自分开。展开剂会使混和燃料的成分各自分开。右图中苯最好。右图中苯最好。燃料中常用溶剂介电常数（增加顺序）戊烷丁酮环己烷丙酮CCl4丙醇苯甲

19、醇三氯乙烷硝基苯CHCl3甲酸氯苯水吡啶.己烷CCl4苯氯甲烷CHCl3（加1甲醇）2.5cm3. 操作技术 操作步骤制备薄层板制备薄层板点样点样展开展开斑点定位斑点定位定性分析定性分析定量分析定量分析演示薄层板的制备可以参考薄层板的制备可以参考复杂物质剖析课复杂物质剖析课程讲义程讲义或者其他相关资料或者其他相关资料定性分析定性分析：比移值：比移值Rf：表示样品化合物的薄层色谱的特性。外界影响因素：外界影响因素：薄层厚度；薄层厚度；吸附剂的吸附力及颗粒大小；吸附剂的吸附力及颗粒大小；酸碱性；酸碱性；含水量；含水量；展开剂的极性、纯度、挥发性；展开剂的极性、纯度、挥发性；温度；温度；斑点上溶质的

20、含量；斑点上溶质的含量；气态组成的变化等等。气态组成的变化等等。相对比移值相对比移值Rst：同一化合物的比移值同一化合物的比移值Rf并不是非常恒定的，有并不是非常恒定的，有时在一个很小的范围内变化，因此有时也用相对比移值时在一个很小的范围内变化，因此有时也用相对比移值Rst表示。表示。离原点到展开点到展开剂原点到斑点中心的距离Rf值标值试样st准物斑点的比移斑点的比移R定量分析u 常用方法：直接定量法 目测 测量色谱斑点面积法 反射光密度法间接定量法 分光光度法 重量分析法 极谱法等u 其他方法：放射活性法气相色谱法薄层扫描（定性，定量） 薄层扫描法系指用定波长的光照射在经薄层层析后的层析板上

21、，对具有吸收或能产生荧光的层析斑点进行扫描，用反射法或透射法测定吸收的强度，以检测层析谱。 通过软件分析，作图。（本学期开实验，可咨询陈智老师）X (cm)Y(sample)Z(density) 小结：薄层色谱中，样品、吸附剂、展开剂三者之间一般关系图：极性小的待分离染极性小的待分离染料不易被薄层所吸料不易被薄层所吸附时，应选用活性附时，应选用活性大的吸附剂和极性大的吸附剂和极性小的展开。小的展开。分离分离PEG4001.3.3 离子交换色谱离子交换色谱法分离：离子交换色谱法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。 。1.3.3 经典离子交换色谱经典

22、离子交换色谱 IECIon exchange： A chromatographic procedure that allows the separation of ions and polar molecules based on their charge on a stationary phase, on which consisting of ion-exchange resins which may be acidic or basi. Http:/ Http://wiki/Ion_chromatographyHttp:/ ChineseHttp:/ Ch

23、inese 根据离子交换树脂基体种类分主要原料：苯乙烯和丙烯酸(酯)两大类其 他：酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系凝胶型树脂凝胶型树脂的在吸水时润胀，在大分子链节间形成很微细的孔隙，通常平均孔径为2。适于吸附无机离子，它们的直径较小，一般为0.30.6nm。蛋白质分子直径为520nm，不能进入这类树脂的显微孔隙中。 大孔型树脂大孔型树脂是在聚合反应时加入致孔剂，形成多孔海绵状构造的骨架，内部有大量永久性的微孔，再导入交换基团制成。它并存有微细孔和大网孔，润湿树脂的孔径达100500nm。根据离子交换树脂物理结构分1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC特种树脂螯合树脂大孔树脂萃淋

24、树脂纤维素交换剂负载螯合剂树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂弱酸性阳离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂R-SO3H树脂树脂R-COOH, R-OH 树脂树脂R4 N+Cl- 树脂树脂-NH2, -NHR, -NR2 树脂Http:/www.sugar- 按按基质链接的基质链接的活性基团不同活性基团不同，离子交换树，离子交换树脂可分类脂可分类1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC对离子交换树脂的要求：对离子交换树脂的要求：1. 不溶于水，对酸碱氧化剂还原剂及加热具有一定的化学稳定性2. 具有较大的交换容量（有相关讨论）3. 对

25、不同离子具有良好的交换选择性（有相关讨论）4. 交换速率大（有相关讨论）5. 树脂容易再生1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC离子交换树脂的结构与性质离子交换树脂的结构与性质 CHCH2CH2CH CH2CH CH2CH CH2CHSO3HCH CH2CH2CH2CH2CHCH2CHSO3HCHCH2SO3HnnCHCH2CH CH2CH CH2+高分子聚合物，具有网状结构，稳定性好。在网状结构高分子聚合物，具有网状结构，稳定性好。在网状结构的骨架上连接有活性基团，如的骨架上连接有活性基团，如-SO3H, -COOH,-N(CH3)3Cl等，它们可以与溶液中的离子进行交换。等，

26、它们可以与溶液中的离子进行交换。1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IECO, m, p交联后、活化后，在树脂表面发生的交换反应形式交联后、活化后，在树脂表面发生的交换反应形式阳离子交换树脂阳离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂螯合交换树脂螯合交换树脂1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC离子交换树脂的性能参数离子交换树脂的性能参数, 交联度交联度:表征骨架性能的参数表征骨架性能的参数树脂合成中，二乙烯苯为交联剂，树脂中含有二乙烯苯的百树脂合成中，二乙烯苯为交联剂，树脂中含有二乙烯苯的百分率就是该树脂的交联度。分率就是该树脂的交联度。交联度大，交联度大， 树脂孔隙树

27、脂孔隙 ，交换反应速度，交换反应速度 ，选择性，选择性 。小小慢慢高高交联度小，交联度小， 树脂孔隙树脂孔隙 ，交换反应速度，交换反应速度 ，选择性，选择性 。大大快快低低氨基酸的分离，交联度8 %， 多肽的分离 2 4 %一般交联度:4-14适宜。交联度小，适合分离无机物质，交联度大，适合做脱色1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC离子交换树脂的性能参数, 交换容量:表征活性基团的性能参数决定于网状结构中活性基团的数目。交换容量由实验测得定义：每克干树脂所能交换的物质的量(mmol)。一般树脂的交换容量36mmol/g。称取某称取某R4N+OH- 型阴离子交换树脂型阴离子交换树

28、脂2 .00 g，置于锥型瓶中，置于锥型瓶中，加入加入0.200 mol / L 标准标准HCl 100 mL 浸泡一昼夜。用移液浸泡一昼夜。用移液管吸取管吸取25.00 mL, 以甲基红为指示剂，用以甲基红为指示剂，用0.100 mol /L NaOH溶液滴定，消耗溶液滴定，消耗20.00 mL。计算离子交换树脂的交计算离子交换树脂的交换容量。换容量。1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC性能参数，性能参数，总交换量总交换量 （exchange capacity）:指离子交换剂所能提供交换离子的总量，又称为总交换容量，它只和离子交换树脂本身的性质有关性能参数，性能参数，有效交换

29、容量：层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量，它与所用的树脂及实验条件有很大的关系。1. 离子交换树脂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。2. 离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质 （例如，小分子，可使用小孔径的树脂，提高比表面积，提高交换容量；对于大分子样品，无法进入孔径，只能选小颗粒，在表面发生交换，颗粒越小的比表面越大，交换容量增加） 例如弱酸在pH6时不容易发生解离，交换容量变小；弱碱，同理）1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC性能参数，性能参数，离子交换亲合力离子交换亲合力 Affinity- 亲和力的差异是亲和

30、力的差异是离子交换分离的基础离子交换分离的基础离子交换树脂与被分离溶液接触时发生离子交换反应时亲离子交换树脂与被分离溶液接触时发生离子交换反应时亲和力的差异主要下列因素有关有关：和力的差异主要下列因素有关有关：半径小半径小电荷数电荷数亲和力亲和力亲和力亲和力理论依据及详细讨论参考：Http:/ Http:/ /wiki/Chromatography Http:/ /reedr/./Affinity%20Chromatography%201.ppt 极化度极化度亲和力亲和力1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC强酸性阳离子交换

31、树脂对下列阳离子亲和力的顺序强酸性阳离子交换树脂对下列阳离子亲和力的顺序Li+ H+ Na+ NH4+ K+ Rb+ Cs+ Ag+ Tl+（铊）（铊） Mg2+Zn2+Co2+Cu2+Cd2+Ni2+Ca2+Sr2+Pb2+Ba2+ Al3+ Fe3+Na+Ca2+Al3+Th4+（钍）钍）对于弱酸性阳离子交换树脂，对于弱酸性阳离子交换树脂，H的亲合力大于阳离子的亲合力大于阳离子 a 阳离子交换树脂阳离子交换树脂b.阴离子交换树脂阴离子交换树脂强碱型阴离子交换树脂F-OH-CH3COO-HCOO-Cl-NO2-CN-Br-C2O42- NO3- HSO4- I- CrO42- SO42- C

32、it(柠檬酸).弱碱型阴离子交换树脂F-Cl-BrI-CH3COO-MoO42-PO43-AsO43-NO3-CrO42- SO42- OH-1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IECMechanism of IEC(on Anion Exchange Beads )1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC操作（将在后面的经典柱色谱中详细介绍）操作（将在后面的经典柱色谱中详细介绍）离子交换分离操作与应用离子交换分离操作与应用应用应用装柱装柱离子交换离子交换洗脱洗脱树脂再生树脂再生制备去离子水制备去离子水微量组分富集分离（微量组分富集分离（Au,Pt,Re-铼）铼）阴阳离子

33、分离阴阳离子分离 1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC阳离子交换阳离子交换阴离子交换阴离子交换除去水中的杂质离子除去水中的杂质离子去去离子水离子水 de-ionized waterde-ionized water1.3.3 经典离子交换色谱经典离子交换色谱 IEC1.3.4 其他经典柱色谱其他经典柱色谱吸附柱色谱1.作用：分离各种类型的非离子组分2.区别：与离子交换色谱法相比，柱色谱分析是在中性条件下操作，样品不会受到破坏；同时，它能有效地分离多种组分。3.分类：硅胶、氧化铝为吸附剂的吸附色谱纤维素为载体的分配色谱4.吸附剂：市场供应的硅胶、氧化铝粒度为100200目，使用前需

34、进行活化。一般吸附剂用量是被分离试样的3050倍，根据被分离试样中组分分离的难易程度而定。 5. 柱色谱操作步骤： 装柱：柱的大小和粗细，根据被分离试样的量而定。一般柱的高度为直径的2030倍。可定做，亦可用分析用滴定管代替。 装柱方法有湿法和干法两种。u 湿法：a) 洗净玻璃管，底部塞子用石墨涂好，在底部铺一层玻璃纤维位或脱脂棉，再将硅胶装入管内。b) 在柱内加入少量试剂，派出滴定管下部及棉花内的气泡。c) 将用溶剂硅胶调成浆装，缓慢、连续不断地倒入柱中，此时应打开柱下端活塞，使溶剂流出，吸附剂即渐渐沉于柱底。d) 待沉降稳定后，放出多余的溶剂，液面保持溶剂约0.51cm。 加样与洗脱u 加

35、样：加样：溶解被分离试样的溶剂体积要小，极性宜低，样品轻轻加于柱顶部。u 洗脱剂的选择：洗脱剂的选择： 可根据被分离物质各组分的极性、溶解度和吸附剂的极性大小等考虑。常用一系列极性渐次增大的溶剂，如：石油醚、苯、乙醚、氯仿及甲醇等顺序洗脱。为了逐步提高洗脱剂的洗脱能力，亦可用溶剂作为过渡，顺次用石油醚苯、苯、苯乙醚、乙醚、乙醚氯仿、氯仿、氯仿甲醇等洗脱。5. 柱色谱操作步骤：1-5 ml收集洗脱液用等分连续法收集流出的洗脱液，收集每份洗脱液的体积随所用吸附剂的量，以及样品的分离情况而定（Introduced previously）；可以手工收集也可以自动收集，自动收集可以节省时间和人力。可以恒

36、温（尤其是低温；冰水浴）可以恒温（尤其是低温；冰水浴）5. 柱色谱操作步骤：吸附柱色谱操作实例色谱法色谱法液相色谱法液相色谱法气相色谱法气相色谱法平板色谱法平板色谱法柱色谱法柱色谱法薄薄层层色色谱谱法法纸纸色色谱谱法法气气液液色色谱谱法法气气固固色色谱谱法法分分配配色色谱谱法法吸吸附附色色谱谱法法离离子子交交换换色色谱谱法法排排阻阻色色谱谱法法超临界流体色谱法超临界流体色谱法亲亲和和色色谱谱法法除前面介绍的其他方法 离心 电泳 透析（膜分离的一种） 磁力 膜分离（魏老师）简要介绍，开拓眼界，为后面研究打基础。离心技术离心技术 （centrifugal techniquecentrifugal

37、technique） 离心技术（离心技术（centrifugal techniquecentrifugal technique） 是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一种分个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。离分析技术。 离心技术的应用离心技术的应用 1. 1. 工业生产工业生产 化工、制药、食品等化工、制药、食品等 转速转速5000r/min5000r/min 2. 2. 生物、医学、化学生物、医学、化学 转速从每分钟几千到几万转以上转速从每分钟几千到几万转以上 目的在于分离和纯化样品，以及对纯目的在于分离和纯化样品，以及

38、对纯 化的样品有关性能进行研究。化的样品有关性能进行研究。二二. . 离心设备离心设备 离心机离心机 转子转子 离心管离心管 附件附件（一）（一）. .离心机离心机( (CentrifugelCentrifugel) ) 1.1.低速离心机低速离心机 转子转子 电动机电动机 转子带有放置离心管的孔转子带有放置离心管的孔 转子的中央位于离心机的驱动轴上转子的中央位于离心机的驱动轴上 离心机的转速和温度控制不够准确离心机的转速和温度控制不够准确 一般最高转速在一般最高转速在6,000rpm6,000rpm以下以下 实验室中常用于分离制备。实验室中常用于分离制备。 2.2.高速离心机高速离心机 制冷

39、设备温度控制在制冷设备温度控制在0-40-4范围内范围内 制动器制动器 实际速度和温度可通过仪表显示实际速度和温度可通过仪表显示 配有一定类型及规格的转子配有一定类型及规格的转子 最高转速在最高转速在25,000rpm25,000rpm以下以下 常用于生物大分子的分离制备常用于生物大分子的分离制备 3.3.超速离心机超速离心机 驱动和速度控制驱动和速度控制 温度控制温度控制 真空系统真空系统 转子转子 常用于分离亚细胞器、病毒粒子、常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNADNA、RNARNA和蛋白质分子。和蛋白质分子。 在分离时无须加入可能引起被分离物质结在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变

40、的物质。构改变的物质。（二）（二）. .转子转子(Rotor)(Rotor) 固定角式转子固定角式转子(fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor) 水平转子水平转子(swing-out rotor)(swing-out rotor) 垂直转子垂直转子(vertical rotor)(vertical rotor) 带状转子带状转子(zonal rotor)(zonal rotor) 连续转子连续转子(continuous rotor) (continuous rotor) 转子的材质：转子的材质：铝质铝质 较轻较轻, ,耐受强度较弱耐受强度较弱, ,适合在较低适

41、合在较低 的转速下使用的转速下使用; ;不锈钢不锈钢 耐受强度最好耐受强度最好, ,但材质本身太重；但材质本身太重； 钛合金钛合金 耐受强度不错耐受强度不错, ,重量也比不锈钢轻。重量也比不锈钢轻。 1.1.固定角式转子固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转离心管在离心机中放置的位置与旋转轴心形成一个固定的角度轴心形成一个固定的角度, ,角度变化在角度变化在14-14-4040之间。之间。 常见的角度常见的角度 2020 28 28 34 34 40 40 三三. .离心分离方法离心分离方法 根据离心原理根据离心原理, ,按照实际工作的需按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法

42、综要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分三类合起来大致可分三类 例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞已破碎的细胞 500g,10500g,10分钟分钟 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (细胞核）细胞核） 10,000g,1010,000g,10分钟分钟 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (细胞膜碎片细胞膜碎片, ,线粒体线粒体,) 100,000g,3,) 100,000g,3小小时时 溶酶体溶酶体 沉淀沉淀 上清液上清液 ( (核糖核蛋白体）核糖核蛋白体） ( (可溶性成份可溶性成份) ) 电泳分离技术电泳分离技术原理 电泳技术就是利用在电场

43、作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。 迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的黏度成反比 影响电泳的主要因素 1、大分子的性质 2、电场强度 3、溶液的pH 4、溶液的离子强度 5、 电渗 6、温度 7、支持物的影响 （三）聚丙烯酰胺胶体的制备 制胶模制胶模1 梳形样品槽模板 2 长玻璃板（后面）3 短玻璃板（前面） 4 U形橡胶框 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备 选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值样品分子量范围适宜的凝胶浓度(T%)蛋白质（酶）5

44、10520301520101551025核酸（RNA）10410410511052106152051023.6本章要点本章要点LC 以及TLC的应用举例柱色谱法分离实例(0)准备工作：1.准备烧杯（试管），称重，贴标签并编号准备烧杯（试管），称重，贴标签并编号2.准备硅胶，烘干（同时准备试样）准备硅胶，烘干（同时准备试样）1247494850W1W47W2W50W49W48 非离子型表面活性剂和相关化合物的分离：非离子型表面活性剂和相关化合物的分离：l 分离柱：50ml滴定管601cml 填充剂：硅胶（100200目）105活化2hl 步骤：10ml氯仿加入柱内玻璃纤维塞于柱底部玻璃棒搅动除棉花中气泡25g已活化的硅胶与6080ml氯仿搅匀装入柱内柱色谱法分离实例粒径（m） 微米mm 纳米nm 目数单位(目) 10-4m 100mm 100000nm 180目 10-5m 10mm 10000nm 1800目 10-6m 1mm 1000nm 1.8万目 10-7m 0.1mm 100nm 18万目 10-8m 0.01mm 10nm 180万目 10-9m 0.001mm 1nm 1800万目 10-9