普通微生物第十章微生物与基因工程

1、在在基因水平基因水平上，根据人们的需要以人工的方法上，根据人们的需要以人工的方法取得取得特定基因特定基因，在，在体外重组体外重组于于载体载体DNADNA分子上，然分子上，然后将重组后将重组DNADNA转入受体细胞进行无性繁殖（称为转入受体细胞进行无性繁殖（称为“克隆克隆” ）和行使正常功能（称为）和行使正常功能（称为“表达表达 ” ），），从而制备人类需要的基因、基因产物或创造出新从而制备人类需要的基因、基因产物或创造出新的生物类型的分子生物学技术。的生物类型的分子生物学技术。基因工程基因工程(genetic engineering)(genetic engineering) 。 载体（载体（

2、VectorVector）：）： 能能容忍外源容忍外源DNADNA片段插入，可在细胞间片段插入，可在细胞间转转移移并在宿主细胞内并在宿主细胞内自主复制自主复制的的DNADNA分子分子。DNADNA重组（重组（recombination)recombination)： 以质粒为载体构建的载体以质粒为载体构建的载体DNA，在一，在一定条件下定条件下引入受体细胞引入受体细胞的过程。或指的过程。或指DNA分子进入宿主细胞的过程。分子进入宿主细胞的过程。基因工程基因工程核心是构建重组体核心是构建重组体DNADNA的技术，因此，的技术，因此，基因工程和重组基因工程和重组DNADNA技术技术(recombi

3、nant DNA (recombinant DNA technology)technology)有时为同义词有时为同义词 基因工程的出现使得生物科学迅猛发展，并基因工程的出现使得生物科学迅猛发展，并带动了带动了生物技术产业生物技术产业的兴起！的兴起！基因工程的特点基因工程的特点可设计性可设计性稳定性稳定性远缘性远缘性风险性风险性 基因工程三大理论基础基因工程三大理论基础 基因工程三大技术发现基因工程三大技术发现 20世纪世纪40年代：证明了遗传物质是年代：证明了遗传物质是DNA 20世纪世纪50年代：年代：DNA双螺旋双螺旋结构结构 20世纪世纪60年代：确定了遗传信息的年代：确定了遗传信息的

4、传递方式传递方式基因工程酶技术基因工程酶技术 19701970年年 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶的分离和纯化（的分离和纯化（Hind IIIHind III）分子克隆分子克隆 19721972年年 Berg Berg 首次实现基因重组首次实现基因重组 19731973年年 Cohen Cohen 重组重组DNADNA转化转化DNADNA测序测序1975年年Sanger实验室建立酶法实验室建立酶法DNA测序技术测序技术1977年年Gilbert实验室又建立化学法实验室又建立化学法DNA测序技术测序技术1980年诺贝尔化学奖授予年诺贝尔化学奖授予Berg、 Sanger、 Gilbert DN

5、A的分子克隆的分子克隆+ DNA测序测序 使重组使重组DNA技术系统得以产生技术系统得以产生 基因的概念和特性基因的概念和特性 DNA的结构与性能的结构与性能 DNA的复制与表达的复制与表达 基因组基因组 遗传学概念：遗传学概念： 基因基因: : 是是DNADNA分子中携带特定遗传信息的最小功能单位，控制遗传性状分子中携带特定遗传信息的最小功能单位，控制遗传性状 分子生物学定义分子生物学定义：编码编码功能性蛋白质多肽链或功能性蛋白质多肽链或RNARNA所所必需的全部核酸序列必需的全部核酸序列，负载负载特定的遗传信息并在一定条件下调节、表达遗传信息，特定的遗传信息并在一定条件下调节、表达遗传信息

6、，指令指令蛋白质合成蛋白质合成。 结构基因（结构基因（structure gene)： 决定蛋白质决定蛋白质/多肽链或酶分子结构的基多肽链或酶分子结构的基因因 调控基因调控基因 (regulatory gene)： 调节控制结构基因表达功能调节控制结构基因表达功能 半保留自我复制半保留自我复制 决定生物表型或性状决定生物表型或性状 基因突变基因突变 新的生物性状新的生物性状. .两条脱氧核苷酸链成反向平行排列，两条脱氧核苷酸链成反向平行排列，. .一条呈一条呈5 5 3 3方向方向. .另一条呈另一条呈3 3 5 5方向。方向。. .以碱基配对形成氢键而形成双螺旋结构以碱基配对形成氢键而形成双

7、螺旋结构. .遵循互补配对原则即：遵循互补配对原则即： A AT GT GC C 基本单位：核苷酸（碱基、五碳糖、磷酸）基本单位：核苷酸（碱基、五碳糖、磷酸） 双螺旋结构双螺旋结构(A)腺嘌呤腺嘌呤(G)鸟嘌呤鸟嘌呤(C)胞嘧啶胞嘧啶(U) 尿嘧啶尿嘧啶(T) 胸腺嘧啶胸腺嘧啶 -超螺旋：超螺旋：共价闭环（共价闭环（CCC） -开环：单链缺口（开环：单链缺口（OC） -线型：双链断裂（线型：双链断裂（L）LC cccoc 吸收光谱高峰为吸收光谱高峰为260nm260nm 溴化乙啶（溴化乙啶（EBEB）嵌入）嵌入DNADNA双链配对碱基之间，紫外线照射，可显示双链配对碱基之间，紫外线照射，可显示

8、DNADNA位置位置 在电场中的在电场中的迁移率迁移率与分子量大小、构象有关与分子量大小、构象有关 DNA变性变性：在物理或化学因素作用下，氢键断裂成单链的过程在物理或化学因素作用下，氢键断裂成单链的过程 DNA复性复性：变性因素去除后变性因素去除后在适当条件下在适当条件下恢复恢复 成双链的过程。成双链的过程。 指指DNADNA分子由稳定的双螺旋结分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现构松解为无规则线性结构的现象。象。 变性时维持双螺旋稳定性的氢变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，键断裂， 但不涉及到其一级但不涉及到其一级结构的改变。结构的改变。 凡能破坏双螺旋稳定性的因素，凡能破坏双螺

9、旋稳定性的因素，均可引起核酸分子变性。均可引起核酸分子变性。 解链温度解链温度:Tm:Tm Tm=69.3 Tm=69.30.41(%G+C0.41(%G+C) 是是DNADNA变性的一种逆转过程。热变性后的变性的一种逆转过程。热变性后的DNADNA一般一般 经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为退火退火(annealing)(annealing)。 最佳复性条件一般认为是比最佳复性条件一般认为是比TmTm低低2525左右的温度左右的温度 复性时温度下降必须缓慢复性时温度下降必须缓慢 ，若在超过，若在超过TmTm的温度下迅速冷却至的温度下迅速冷却至低温低温( (如

10、如44以下以下) )，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持此方式保持DNADNA的变性的变性( (单链单链) )状态。状态。 半保留复制半保留复制 （semi-conservative replication） 基因表达（基因表达（gene expression）mRNA蛋白蛋白 转录转录翻译翻译基因组（基因组（genome) 概念：细胞或生物体的概念：细胞或生物体的全套遗传物质全套遗传物质 常见基因组特点：常见基因组特点： 病毒基因组病毒基因组 原核生物基因组原核生物基因组 真核生物基因组真核生物基因组 基因组小，基因数少基因组小，基因数少 带

11、有重叠基因带有重叠基因 大部分为编码蛋白质的结构基因大部分为编码蛋白质的结构基因HBVHBV基基因因组组1 1） 基因组较小基因组较小2 2） 基因是连续的基因是连续的3 3） 没有转录后加工过程和翻译后加工过程。没有转录后加工过程和翻译后加工过程。4 4） 转录和翻译偶联，可同时进行。转录和翻译偶联，可同时进行。 细菌染色质细菌染色质 质粒（质粒（plasmid）： 细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链细菌染色体以外的遗传物质，是环状闭合的双链DNA。可自主复制可自主复制编码生物学形状编码生物学形状基因工程常用载体基因工程常用载体 基因组庞大基因组庞大3 310106 6bpbp、染色

12、质、染色体、染色质、染色体. . 基因不连续性基因不连续性 断裂基因、内含子、外显子（大部分断裂基因、内含子、外显子（大部分基因含有内含子）基因含有内含子） 含有大量重复序列含有大量重复序列 非编码区域多于编码区域非编码区域多于编码区域 非编码区较多非编码区较多 多于编码序列多于编码序列(9:1(9:1） 转录和翻译不偶联转录和翻译不偶联一、目的基因的制备一、目的基因的制备( donor DNA ) ( donor DNA ) 二、体外二、体外DNADNA重组重组(DNA recombination )(DNA recombination )三、重组三、重组DNADNA导入宿主细胞导入宿主细胞

13、( Transformation)( Transformation)四、重组体的筛选鉴定四、重组体的筛选鉴定 ( identification)( identification)五、控制外源基因的表达五、控制外源基因的表达(gene expression)(gene expression)三、微生物学与基因工程的关系三、微生物学与基因工程的关系1.1.提供丰富而独特的基因资源提供丰富而独特的基因资源2.2.工具酶工具酶3.3.克隆载体克隆载体4.4.基因克隆的宿主基因克隆的宿主5.5.基因表达的反应器基因表达的反应器6.6.有关基因结构、性质和表达调控的理论主要来自对微生有关基因结构、性质和表

14、达调控的理论主要来自对微生物的研究物的研究一切基因工程操作都离不开微生物一切基因工程操作都离不开微生物操作技术和理论指导操作技术和理论指导 一、从基因文库或一、从基因文库或cDNAcDNA文库分离目的基因文库分离目的基因 二、酶法或化学方法人工合成基因二、酶法或化学方法人工合成基因 三、三、PCRPCR扩增基因扩增基因 四、基因的定位诱变四、基因的定位诱变基因文库基因文库 基因组基因组DNA片段的全部克隆片段的全部克隆 建立基因文库步骤：建立基因文库步骤：1、提取基因组、提取基因组DNA2、DNA片段化片段化3、选择合适载体、选择合适载体4、DNA与载体连接与载体连接5、重组体转化或者转染、重

15、组体转化或者转染cDNA文库：文库： 生物体全部生物体全部mRNA的的cDNA的克隆总体的克隆总体1.mRNA的提取的提取2.利用逆转录酶以寡聚利用逆转录酶以寡聚dT或随机寡聚核苷酸为引物合或随机寡聚核苷酸为引物合成成cDNA的第一条链的第一条链3.利用利用DNA聚合酶聚合酶，以，以cDNA的第一条链为模板，的第一条链为模板，用适当引物合成用适当引物合成cDNA的第二条链，常用的第二条链，常用RNA酶酶H在在杂交分子的杂交分子的mRNA链上造成缺口和切口，产生一系链上造成缺口和切口，产生一系列引物，或是除去杂交分子的列引物，或是除去杂交分子的mRNA后，加入随机后，加入随机引物合成第二条链引物

16、合成第二条链4.其它同基因文库的构建其它同基因文库的构建 适于遗传背景清楚的细菌染色体适于遗传背景清楚的细菌染色体 酶切电泳分离酶切电泳分离DNADNA应用：应用：1、合成基因、合成基因2、合成核酸探针、合成核酸探针 探针探针(probe)：用同位素或其它非放射物质标：用同位素或其它非放射物质标 记的一段特定的记的一段特定的DNA或或RNA片段片段3、合成、合成DNA引物引物 聚合酶链式反应聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction, PCR是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法片段的一种方法高温变性9296低温复性（退火）4060中温延伸7072三、

17、三、PCRPCR扩增基因扩增基因PCR基本原理所用所用DNA聚合酶：聚合酶：Klenow聚合酶聚合酶1988年年Saiki等从水生栖热菌等从水生栖热菌(Thermus aquaticus)分离到分离到TaqDNA 聚合酶聚合酶火球菌火球菌(Pyrococcus furiosus)分离到分离到Pfu DNA 聚合聚合酶酶;从从Thermococcus litoralis分离到分离到Vent DNA 聚合酶聚合酶从从Thermus thermophilus中分离中分离Tth DNA 聚合酶聚合酶校校正正功功能能PCR注意事项：1. 引物的设计2. 退火温度3. 实验操作PCR应用应用1、基因扩增和

18、制备、基因扩增和制备DNA探针探针2、临床医学上传染病的检测等、临床医学上传染病的检测等3、法医上判定亲缘关系、法医上判定亲缘关系4、定性、定量检测基因表达水平、定性、定量检测基因表达水平qRT-PCR (quantitative real-time PCR)四、基因的定位诱变四、基因的定位诱变 在基因精确限定的位点引入突变在基因精确限定的位点引入突变1、寡核苷酸指导的定位诱变、寡核苷酸指导的定位诱变2、盒式诱变、盒式诱变3、PCR定位诱变定位诱变1.1.寡核苷酸指导的定位诱变寡核苷酸指导的定位诱变2.2.盒式诱变盒式诱变(cassette mutagenesis)(cassette muta

19、genesis) 较大片段的诱变较大片段的诱变PCR定位诱变定位诱变3.PCR3.PCR诱变诱变1 1）变异部位位于基因的）变异部位位于基因的末端末端引物引物5 5端限制位点的引入端限制位点的引入2 2）变异部位位于基因的）变异部位位于基因的中间中间 重组重组PCR(recombinant PCR(recombinant PCR)PCR)Higuchi,1988Higuchi,1988年年3 微生物与克隆载体微生物与克隆载体克隆载体克隆载体(cloning vector)： 以扩增外源以扩增外源DNA为目的的载体为目的的载体到目前为止，基因工程中使用的载体基本到目前为止，基因工程中使用的载体基

20、本上均来自微生物上均来自微生物克隆载体的基本要求克隆载体的基本要求 应是一个独立的复制子应是一个独立的复制子(replicon) 具有多克隆位点具有多克隆位点 具有选择标记具有选择标记 安全性安全性载体的种类载体的种类一、质粒克隆载体一、质粒克隆载体二、二、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体(cosmid vector黏粒载体黏粒载体)四、四、M13噬菌体载体噬菌体载体五、噬菌质粒载体五、噬菌质粒载体(phagemid/phasmid)一、质粒克隆载体一、质粒克隆载体1.1.质粒克隆载体的特性：质粒克隆载体的特性： 具有独立的复制起点具有独立的复制起点 含有多种限制酶

21、的单一识别位点含有多种限制酶的单一识别位点 具有较小的相对分子质量具有较小的相对分子质量 1200kbp 外源外源DNA15kbp 具有较高拷贝数具有较高拷贝数 具有便于选择的标记具有便于选择的标记 易于导入细胞易于导入细胞 具有安全性具有安全性2.2.质粒质粒pBR322pBR322的结构特点的结构特点19771977年年BolivarBolivar构建构建 环状双链环状双链DNA 4,361bp DNA 4,361bp 外源外源DNA 5kbpDNA 5kbp左右左右 松弛型质粒，一个复制起点松弛型质粒，一个复制起点 两个抗性基因两个抗性基因 TetTetr r AmpAmpr r 多克隆

22、位点（多克隆位点（multiple cloning site; multiple cloning site; polylinker;24polylinker;24）插入失活插入失活(insertional inactivation):(insertional inactivation): 因外源因外源DNADNA的插入而导致基因失活的现象的插入而导致基因失活的现象3.3.其它质粒载体其它质粒载体pUC pGEMpUC pGEM系列系列二、二、噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体噬菌体克隆载体的优点噬菌体克隆载体的优点分子遗传学背景十分清楚分子遗传学背景十分清楚容量较大容量较大（23kbp23kbp）具

23、有较高的感染率具有较高的感染率噬菌体克隆载体的构建噬菌体克隆载体的构建删除基因组中非必需区删除基因组中非必需区除去多余的限制酶切位点除去多余的限制酶切位点噬菌体克隆载体的种类噬菌体克隆载体的种类插入型载体插入型载体(insert vector)(insert vector)取代型载体取代型载体(replacement vector) (replacement vector) 78%105%三、柯斯质粒载体三、柯斯质粒载体(cosmid vector黏粒载体黏粒载体)由由噬菌体的粘性末端噬菌体的粘性末端(cos位点位点)和质粒构建而成和质粒构建而成黏粒的优点黏粒的优点具有噬菌体的高效感染率，具有

24、噬菌体的高效感染率， 以质粒形式存在以质粒形式存在具有质粒的复制方式具有质粒的复制方式具有克隆大片段外源具有克隆大片段外源DNA的能力的能力(45kbp)四、四、M13噬菌体载体噬菌体载体 E.coli丝状噬菌体丝状噬菌体 环状环状ssDNA 6,407bp 感染雄性菌后变感染雄性菌后变成复制型成复制型dsDNA,以滚环方式复制出以滚环方式复制出ssDNA特点：特点： 1. 间隔区插入间隔区插入-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N端一小段编码序列，编端一小段编码序列，编 码码-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的肽，可与肽，可与E.coli lacZ突变基因产突变基因产 物物M15进行进行互补，产生有活性的互补，产生

25、有活性的-半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。 在含有异丙基硫代在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷半乳糖苷(IPTG)和显色物和显色物5- 溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- D-半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)的平板上的平板上 时出现蓝色噬菌斑时出现蓝色噬菌斑 2. 在在肽的编码区插入多克隆位点，肽的编码区插入多克隆位点， 外源基因插入这一外源基因插入这一 区段，破坏区段，破坏 互补作用，使互补作用，使-半乳糖苷酶失活，半乳糖苷酶失活， 重组体产生白色噬菌斑重组体产生白色噬菌斑M13噬菌体载体噬菌体载体克隆能力较小克隆能力较小 300400bp特别适合用于制备单链特别适合用于制备单链DNA模板、单链模板、单链DN

26、A探针、定位诱变模板探针、定位诱变模板五、噬菌粒载体五、噬菌粒载体(phagemid/phasmid) 又称噬粒，由噬菌体又称噬粒，由噬菌体M13的基因间隔区和质粒载体共同构建的基因间隔区和质粒载体共同构建的载体的载体 pUC118 将野生型将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体的基因间隔区插入质粒载体 pUC18构建而成构建而成 在宿主细胞内以质粒形式存在，产生双链在宿主细胞内以质粒形式存在，产生双链DNA；当辅助噬；当辅助噬菌体菌体M13感染宿主细胞后，以滚环方式复制，产生单链感染宿主细胞后，以滚环方式复制，产生单链DNA特点：特点：分子小分子小容量大容量大 10kbp可制备单链或双链可制

27、备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因，克隆和表达外源基因几类大肠杆菌克隆载体比较几类大肠杆菌克隆载体比较载体类型载体类型 克隆容量克隆容量主要用途主要用途质粒载体质粒载体 15kbp克隆和表达外源基因，克隆和表达外源基因， DNA测序测序噬菌体载体噬菌体载体 23kbp构建基因文库和构建基因文库和cDNA文库文库柯斯质粒载体柯斯质粒载体 45kbp构建基因文库构建基因文库M13载体载体 300400bp制备单链制备单链DNA，定位诱变，噬菌体展示，定位诱变，噬菌体展示噬菌质粒载体噬菌质粒载体 10kbp制备单链或双链制备单链或双链DNA，克隆和表达外源，克隆和表达外源基因基因六、真核生物的克

28、隆载体六、真核生物的克隆载体1.酵母质粒载体酵母质粒载体 利用酵母的利用酵母的2m质粒和其他染色体组分与质粒和其他染色体组分与pBR322构建而成，为穿梭质粒构建而成，为穿梭质粒附加体质粒（附加体质粒（episomal plasmid)复制质粒复制质粒(replicating plasmid)整合质粒整合质粒(integrating plasmid)附加体质粒（附加体质粒（episomal plasmid)具有较高拷贝数具有较高拷贝数酵母染色体酵母染色体的自主复制的自主复制序列序列复制质粒复制质粒(replicating plasmid)中等拷贝数中等拷贝数整合质粒整合质粒(integrati

29、ng plasmid)2.真核生物病毒载体真核生物病毒载体哺乳动物病毒载体哺乳动物病毒载体SV40、腺病毒、牛痘病毒、腺病毒、牛痘病毒、 逆转录病毒逆转录病毒昆虫病毒载体昆虫病毒载体 杆状病毒：高容量（杆状病毒：高容量（100kbp)、 高表达效率高表达效率(25%)、安全、安全植物病毒载体植物病毒载体 花椰菜花叶病毒载体，花椰菜花叶病毒载体，Ti质粒质粒载体载体七、人工染色体七、人工染色体酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast artificial chromosome,YAC)Murray 1983年构建，年构建，Burke等等1987年用以构建成年用以构建成YAC克隆库，克隆库，100

30、0kbp容量容量细菌人工染色体细菌人工染色体(BAC)-120-300kb4 4微生物与基因工程工具酶微生物与基因工程工具酶 基因工程所用到的工具酶大多数是基因工程所用到的工具酶大多数是从不同微生物中获得的从不同微生物中获得的一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) 限制性酶限制性酶(restriction enzyme)： 能识别双链能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其分子的特定序列，并在识别位点或其附近特异切割附近特异切割DNA的一类内切酶的一类内切酶1.命名与分类命名与分类Eco RHpa , Hpa (Haemophilu

31、s parainfluenzae，副流感嗜血杆菌，副流感嗜血杆菌)Hph (Haemophilus parahaemolyticus，副溶血嗜血杆菌，副溶血嗜血杆菌) 、 、三种类型三种类型2.限制性核酸内切酶的基本特性限制性核酸内切酶的基本特性识别序列通常由识别序列通常由48bp组成，具有二重旋转对称组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构轴，序列呈回文结构(paliindromic structure)切割片段理论大小为切割片段理论大小为4nA.黏性末端黏性末端(cohesive end)Hind 5-A AGCT T-3 3-T TCGA A-5Pst 5-C TGCA G-3 3-G

32、ACGT C-5B.平末端平末端Hpa 5-GTT AAC-33-CAA TTG-5同裂酶同裂酶(isoschizomers)同尾酶同尾酶(isocaudomers)Mun Eco R5-C AATT G-35-G AATT C-33-G TTAA C-53-C TTAA G-5表表10-2 常用限制酶常用限制酶二、二、DNADNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA ligase)T4 DNA连接酶：连接酶：Mg2+和和ATP 能催化平端连接能催化平端连接大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶：连接酶：Mg2+和和NAD+其它酶其它酶5 5 外源基因导入宿主细胞外源基因导入宿主细胞一、外源基因

33、与载体的体外连接一、外源基因与载体的体外连接 1.黏性末端连接法黏性末端连接法 2.接头或衔接物连接法接头或衔接物连接法 3.均聚物加尾法均聚物加尾法 4.平末端连接法平末端连接法二、宿主的基本要求与性质二、宿主的基本要求与性质1.具有安全性具有安全性2.能高效吸收外源能高效吸收外源DNA3.不具有限制修饰系统不具有限制修饰系统4.一般为重组缺陷型一般为重组缺陷型(RecA-)菌株菌株5.根据载体类型选择相应宿主根据载体类型选择相应宿主6.根据载体的标记选择合适的宿主根据载体的标记选择合适的宿主大肠杆菌、酿酒酵母大肠杆菌、酿酒酵母1、原核生物宿主、原核生物宿主 根据载体性质及导入方式选择宿主细胞根据载体性质及导入方式选择宿主细胞 质粒作为载体、转化导入：易于形成感受态的细胞质粒作为载体、转化导入：易于形成感受态的细胞 噬菌体或柯斯质粒作为载体、感染导入：噬菌体或柯