自学内容分子杂交技术学习教案

1、会计学1自学自学(zxu)内容分子杂交技术内容分子杂交技术第一页，共39页。核酸分子核酸分子(fnz)杂交杂交 (nucleic acid hybridization ) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分子单链分子(fnz)放在同一溶液中，或把放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起放在一起，只要在，只要在DNA或或RNA的单链分子的单链分子(fnz)之间有一定之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子的碱基配对关系，就可以在不同的分子(fnz)之间形之间形成杂交双链成杂交双链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹一、分子杂交与印迹(yn j

2、)(yn j)技术的原技术的原理理第1页/共39页第二页，共39页。复性复性(f xn)RNADNA第2页/共39页第三页，共39页。（一）印渍技术(jsh) Blotting 首先由首先由Edwen Southern在在1975年提出。年提出。Blotting即即“印渍印渍”，指将存在于凝胶中的生物大分，指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印渍）到固定化介质上并加以检测分析子转移（印渍）到固定化介质上并加以检测分析(fnx)的技术，目前广泛应用于的技术，目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋、和蛋白质的检测。白质的检测。 第3页/共39页第四页，共39页。二、印渍技术(jsh)的类别及应用 DNA

3、印迹技术(jsh) Southern blottingRNA印迹技术(jsh) Northern blotting蛋白质印迹技术(jsh) Western blotting 斑点印迹 Dot blotting原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术(jsh) DNA chip 第4页/共39页第五页，共39页。（一）DNA印迹(yn j)技术 Southern blotting 又称为又称为Southern杂交，即杂交，即DNA-DNA杂杂交分析，是研究交分析，是研究DNA图谱的基本技术，图谱的基本技术，主要主要(zhyo)用于基因组

4、用于基因组DNA的分析，的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测等如在基因组中特异基因的定位及检测等，在遗传诊断，在遗传诊断DNA图谱分析及图谱分析及PCR产物产物分析等方面有重要价值。分析等方面有重要价值。第5页/共39页第六页，共39页。第6页/共39页第七页，共39页。Paper TowelsSouthern BlottingtissueSDS蛋白酶K酚/氯仿(l fn)无水乙醇离心(lxn)第7页/共39页第八页，共39页。（二）RNA印渍技术(jsh) Northern blotting又称为又称为Northern杂交，即杂交，即RNA-DNA杂交分析杂交分析。是一种将。是一种将RN

5、A从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。维素膜上的方法。主要主要(zhyo)用于检测某一组织或细胞中已知用于检测某一组织或细胞中已知的特异的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。细胞的同一基因的表达情况。第8页/共39页第九页，共39页。（三）蛋白质印渍技术(jsh)Western blotting又称为又称为Western杂交，或免疫印渍技术，杂交，或免疫印渍技术，即利用抗原即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。维素膜上的特异性蛋白质。应用应用(yngyng

6、)：用于检测样品中特异性：用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。 第9页/共39页第十页，共39页。三种三种(sn zhn)印迹技术的比较印迹技术的比较第10页/共39页第十一页，共39页。（一）（一）DNA印迹印迹(yn j)技术技术 (Southern blotting) 用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。、重组质粒和噬菌体的分析。（二）（二）RNA印迹技术印迹技术 (Northern blotting) 用于用于RNA的定性的定性(dng xn

7、g)定量分析。定量分析。（三）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹(yn j)分析分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。第11页/共39页第十二页，共39页。第12页/共39页第十三页，共39页。第13页/共39页第十四页，共39页。n与标记的第二抗体（酶标二抗）与标记的第二抗体（酶标二抗）反应反应n显色反应：酶促反应显色反应：酶促反应第14页/共39页第十五页，共39页。斑点印迹Dot blotting 斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标斑点杂交法是不经过电泳，而将被检标本直接点到膜上，烘烤本直接点到膜上，烘烤(hn ko)

8、固定固定，用于杂交。这种方法耗时短，可做半，用于杂交。这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样定量分析，一张膜上可同时检测多个样品。品。 第15页/共39页第十六页，共39页。原位杂交in situ hybridization 即组织原位杂交即组织原位杂交(zjio)，指组织切片或，指组织切片或细胞涂片直接用于杂交细胞涂片直接用于杂交(zjio)分析。先分析。先经适当处理，使细胞通透性增加，让探经适当处理，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与针进入细胞内与DNA或或RNA杂交杂交(zjio)。 因此原位杂交因此原位杂交(zjio)可以确定探针的互可以确定探针的互补序列在胞内的空

9、间位置，这一点具有补序列在胞内的空间位置，这一点具有重要生物学和病理学意义。重要生物学和病理学意义。第16页/共39页第十七页，共39页。第17页/共39页第十八页，共39页。第18页/共39页第十九页，共39页。第19页/共39页第二十页，共39页。学反应，经荧光检测体系在镜学反应，经荧光检测体系在镜下对待测下对待测DNA进行定性、定量进行定性、定量或相对定位分析。或相对定位分析。第20页/共39页第二十一页，共39页。探针探针(tn zhn)技术技术 probe将一小段已知序列的核酸片段用放射性同将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全位素、生物素或荧光染料

10、对它的末端或全链进行进行标记，称为链进行进行标记，称为“探针探针”然后用于然后用于分子杂交，杂交后通过分子杂交，杂交后通过(tnggu)(tnggu)放射自显放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来现出来第21页/共39页第二十二页，共39页。第22页/共39页第二十三页，共39页。第23页/共39页第二十四页，共39页。第24页/共39页第二十五页，共39页。第25页/共39页第二十六页，共39页。第26页/共39页第二十七页，共39页。第27页/共39页第二十八页，共39页。第28页/共39页第二十九页，共39页。第29页/共39页第三十页，共

11、39页。第30页/共39页第三十一页，共39页。蛋白质相互作用研究蛋白质相互作用研究(ynji)(ynji)技术技术 Research Technology of Interaction of Protein第31页/共39页第三十二页，共39页。蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制的复制(fzh)与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。 蛋白质之间相互作用研究蛋白质之间相互作用研究(ynji)(ynji)的重的重要性要性第32页/共39页第三十三页，共39页。酵母双杂交酵母双杂交各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等）荧光共振能量转换荧光共振能量转换(zhunhun)效应分析