蛋白质测定学习教案

1、会计学1蛋白质测定蛋白质测定第一页，编辑于星期三：点 四十四分。 了解蛋白质区别于其他有机化合物的主要标志；掌握凯氏定氮法、双缩脲法、茚三酮比色法、氨基态氮的测定方法及原理。 重点掌握：蛋白质系数的概念；凯氏定氮中各种试剂的用途；凯氏定氮装置的原理及操作技能；掌握PH计甲醛滴定法测定氨基态氮的原理、方法及其操作技能。 第1页/共57页第二页，编辑于星期三：点 四十四分。第2页/共57页第三页，编辑于星期三：点 四十四分。第一节第一节 概述概述蛋白质是生命的物质基础，也是食品蛋白质是生命的物质基础，也是食品中重要的营养指标。中重要的营养指标。食品中的蛋白质种类非常复杂，蛋白食品中的蛋白质种类非常

2、复杂，蛋白质分子量的变化范围通常为质分子量的变化范围通常为50001000,000道尔顿，它们包括氢、道尔顿，它们包括氢、 碳碳、 氮、氧和硫等元素。氮、氧和硫等元素。第3页/共57页第四页，编辑于星期三：点 四十四分。第4页/共57页第五页，编辑于星期三：点 四十四分。 蛋白质由氨基酸以不同比例构成蛋白质由氨基酸以不同比例构成；氨基酸由；氨基酸由C、H、O、N以不同以不同方法构成；方法构成； 由于氨基酸种类不同和蛋白质中由于氨基酸种类不同和蛋白质中氨基酸构成比例不同导致氨基酸构成比例不同导致蛋白质蛋白质的含氮量不同的含氮量不同第5页/共57页第六页，编辑于星期三：点 四十四分。 不同食品中不

3、同食品中蛋白质的含氮量蛋白质的含氮量为为13.4%19.1%*蛋白质系数蛋白质系数16%第6页/共57页第七页，编辑于星期三：点 四十四分。第7页/共57页第八页，编辑于星期三：点 四十四分。 食品中的总有机氮主要来自于蛋白质食品中的总有机氮主要来自于蛋白质，小部分来自于，小部分来自于非蛋白质组份非蛋白质组份的有机的有机氮，会干扰蛋白质的测定。氮，会干扰蛋白质的测定。 食品中脂类和碳水化合物可能会干扰食品中脂类和碳水化合物可能会干扰 一些具有相似的物化性质的组份干一些具有相似的物化性质的组份干扰分析。扰分析。干扰蛋白分析物质干扰蛋白分析物质:第8页/共57页第九页，编辑于星期三：点 四十四分。

4、二、二、凯氏定氮法凯氏定氮法第9页/共57页第十页，编辑于星期三：点 四十四分。第10页/共57页第十一页，编辑于星期三：点 四十四分。2.1.2 凯氏定氮过程步骤：凯氏定氮过程步骤：样品制备样品制备(自学自学) 消化消化 蒸馏蒸馏 吸收与滴定吸收与滴定*学习中特别需要注意掌握各个过学习中特别需要注意掌握各个过程中所使用的试剂都有哪些作用程中所使用的试剂都有哪些作用常量凯氏定氮法常量凯氏定氮法第11页/共57页第十二页，编辑于星期三：点 四十四分。1. 原理原理 消化：消化： 样品与浓硫酸和催化剂样品与浓硫酸和催化剂一同加热，使蛋白质分解，其中碳和一同加热，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧

5、化碳和水逸出，而样氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的品中的有机氮转化为氨有机氮转化为氨与硫酸结合成硫与硫酸结合成硫酸铵。酸铵。第12页/共57页第十三页，编辑于星期三：点 四十四分。第13页/共57页第十四页，编辑于星期三：点 四十四分。2.1.2.2 湿法消化湿法消化蛋白质中的氮形成铵离子和硫酸结蛋白质中的氮形成铵离子和硫酸结合成硫酸铵，合成硫酸铵，硫酸氧化有机物使碳元素和氧元素被硫酸氧化有机物使碳元素和氧元素被转化成二氧化碳和水。转化成二氧化碳和水。样品中的有机物消化至透明澄清样品中的有机物消化至透明澄清. 第14页/共57页第十五页，编辑于星期三：点 四十四分。第15页/共57页第十

6、六页，编辑于星期三：点 四十四分。 硫酸钾：硫酸钾：增温剂，提高溶液沸点增温剂，提高溶液沸点加速蛋白质的分解，缩短消化时间，加速蛋白质的分解，缩短消化时间，加入催化剂：加入催化剂：第16页/共57页第十七页，编辑于星期三：点 四十四分。 加硫酸铜作用：加硫酸铜作用：加速有机物的氧化与分解加速有机物的氧化与分解有机物全部被消化完后，不再有硫酸有机物全部被消化完后，不再有硫酸亚铜褐色生成，溶液呈现清澈的二价铜亚铜褐色生成，溶液呈现清澈的二价铜的篮绿色，可指示消化终点的到达的篮绿色，可指示消化终点的到达第17页/共57页第十八页，编辑于星期三：点 四十四分。第18页/共57页第十九页，编辑于星期三：

7、点 四十四分。第19页/共57页第二十页，编辑于星期三：点 四十四分。第20页/共57页第二十一页，编辑于星期三：点 四十四分。第21页/共57页第二十二页，编辑于星期三：点 四十四分。指示剂在反应过程中色泽变化: （酸性条件下为甲基红所显的红色，当体系变为绿色时则呈现溴甲基酚绿所有的绿色，因此，称为混合指示剂）指示剂先加入硼酸中，呈现酸性红色，通入氨气后呈现变蓝绿色；用HCL一滴定，到后来又显了稍过量盐酸的酸性红色第22页/共57页第二十三页，编辑于星期三：点 四十四分。定氮装置一、第23页/共57页第二十四页，编辑于星期三：点 四十四分。1、电炉； 2、水蒸气发生器；3、螺旋夹a；4、小漏

8、斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管9、蒸馏液接收瓶。 定氮装置二第24页/共57页第二十五页，编辑于星期三：点 四十四分。定氮装置的检查与洗涤 检查微量定氮装置是否装好。在蒸气发生瓶内装水约三分之二，加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 测定前定氮装置如下法洗涤23次：从样品进口入加水适量（约占反应管三分之一体积）通入蒸汽煮沸，产生的蒸汽冲洗冷凝管，数分钟后关闭夹子a，使反应管中的废液倒吸流到反应室外层，打开夹子b由橡皮管排出，如此数次，即可使用。 第25页/共57页第二十六页，编辑于星期三

9、：点 四十四分。第26页/共57页第二十七页，编辑于星期三：点 四十四分。新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋新鲜食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，先测定总氮量，然后乘白质为主体，先测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，得到蛋白质含量以蛋白质换算系数，得到蛋白质含量。换算系数换算系数一般为（）。一般为（）。 即：即：%N 6.25 = %蛋白质蛋白质第27页/共57页第二十八页，编辑于星期三：点 四十四分。第28页/共57页第二十九页，编辑于星期三：点 四十四分。 问题问题1:1:为什么凯氏定氮所用为什么凯氏定氮所用试剂溶液应用试剂溶液应用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制配制, ,如何配制。如何配制。 第

10、29页/共57页第三十页，编辑于星期三：点 四十四分。第30页/共57页第三十一页，编辑于星期三：点 四十四分。第31页/共57页第三十二页，编辑于星期三：点 四十四分。 消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，含有特别难以氨化的氮化合物的样品，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或蓝色或浅绿色浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色深绿色。问题四：如何判断消化的终点？问题四：如何判断消化的终点？第32页/共57页第三十三页，编辑于星期三：点 四十四分。 问题五：蒸馏前若加碱量不足问题五：蒸馏前若加碱量不足会出现什么现象，为什么，如何解会出现什么现象，为什么，如何解决？决？ 若加碱量充足，

11、消化液变为深蓝色若加碱量充足，消化液变为深蓝色，或产生黑色氢氧化铜沉淀，若加碱，或产生黑色氢氧化铜沉淀，若加碱量不足，则消化液呈蓝色而无沉淀，量不足，则消化液呈蓝色而无沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。此时需再增加氢氧化钠用量。第33页/共57页第三十四页，编辑于星期三：点 四十四分。问题六：蒸馏完毕拆下装置时的注意事项 第34页/共57页第三十五页，编辑于星期三：点 四十四分。问题七：为何要控制硼酸吸收液的问题七：为何要控制硼酸吸收液的温度？温度？第35页/共57页第三十六页，编辑于星期三：点 四十四分。第36页/共57页第三十七页，编辑于星期三：点 四十四分。第37页/共57页第三十八页，编

12、辑于星期三：点 四十四分。优点：优点：1可用于所有食品的蛋白质分析。可用于所有食品的蛋白质分析。 2操作比较简单。操作比较简单。 3实验费用低。实验费用低。 4结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。结果准确，是一种测定蛋白质的经典方法。 5用微量法可测定样品中微量的蛋白质。用微量法可测定样品中微量的蛋白质。缺点缺点 1最终测定的是总氮含量，而不只是蛋白质氮。最终测定的是总氮含量，而不只是蛋白质氮。 2实验时间太长。实验时间太长。 3所用试剂有腐蚀性。所用试剂有腐蚀性。 本实验方法的优、缺点本实验方法的优、缺点第38页/共57页第三十九页，编辑于星期三：点 四十四分。2.2 2.2 微量凯氏定氮

13、法微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量加入硼酸量有有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。可用微量滴定管。第39页/共57页第四十页，编辑于星期三：点 四十四分。2.3常量改良凯氏定氮法常量改良凯氏定氮法2.3.1 2.3.1 原理及适用范围同前原理及适用范围同前 在凯氏法改良中主要的问题是：在凯氏法改良中主要的问题是： 氮的完全氮化、缩短时间、简化操氮的完全氮化、缩短时间、简化操作作 这里主要需解决的是催化剂的种类、这里主要需解决的是催化剂的种类、

14、硫酸和盐类的添加量等。硫酸和盐类的添加量等。 第40页/共57页第四十一页，编辑于星期三：点 四十四分。2.3.2 2.3.2 特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消化完毕。分钟可消化完毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，氮百分含量并记录，12分钟完成分钟完成1个样个样。第41页/共57页第四十二页，编辑于星

15、期三：点 四十四分。为什么在蒸汽发生瓶中要加入指示剂甲基橙和硫酸？加入数粒玻璃珠的作用是什么？第42页/共57页第四十三页，编辑于星期三：点 四十四分。第43页/共57页第四十四页，编辑于星期三：点 四十四分。第44页/共57页第四十五页，编辑于星期三：点 四十四分。样品的测定：样品的测定： 自学自学第45页/共57页第四十六页，编辑于星期三：点 四十四分。氨基酸态氮的测定双指示剂甲醛滴定法电位滴定法四、氨基酸态氮的测定第46页/共57页第四十七页，编辑于星期三：点 四十四分。4.1 双指示剂甲醛滴定法原理： 氨基酸具有酸性的氨基酸具有酸性的-COOH基和碱性的基和碱性的-NH2基。它们相互租

16、用而使氨基酸成为中基。它们相互租用而使氨基酸成为中性的内盐。性的内盐。 当加入甲醛溶液时，当加入甲醛溶液时，-NH2基与甲醛结合基与甲醛结合，从而使其碱性消失。，从而使其碱性消失。 这样就可以用强碱标准溶液来滴定这样就可以用强碱标准溶液来滴定 -COOH基，并用间接的方法测定氨基酸的总基，并用间接的方法测定氨基酸的总量。量。第47页/共57页第四十八页，编辑于星期三：点 四十四分。 吸取含氨基酸约吸取含氨基酸约20mg20mg的样品溶液于的样品溶液于100ml100ml容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取置于容量瓶中，加水至标线，混匀后吸取置于200ml200ml烧杯中，加水烧杯中，加水60ml6

17、0ml，开动磁力搅拌器，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示，记录用氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示，记录消耗氢氧化钠标准溶液消耗氢氧化钠标准溶液mlml数（数（V V1010），供计算），供计算总酸含量。总酸含量。 加入甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠加入甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至，记录消耗氢氧化钠标准标准溶液继续滴定至，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。溶液体积。第48页/共57页第四十九页，编辑于星期三：点 四十四分。第49页/共57页第五十页，编辑于星期三：点 四十四分。 此法准确快速，适用于测定食品中游离此法准确快速，适用于测定食品中游离氨基酸。氨基酸。 固体样品应先进行粉碎，准确称样后用固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。、饮料等可直接吸取试样