第二节胚胎工程实验技术(北师大)

1、小资料：小资料： 牛刚出生时，每侧卵巢大约含有牛刚出生时，每侧卵巢大约含有1515万万个卵泡，每个卵泡内都有一个初级卵母个卵泡，每个卵泡内都有一个初级卵母细胞。出生后能够发育成成熟排卵的卵细胞。出生后能够发育成成熟排卵的卵泡只有泡只有200200个个左右，一生产下左右，一生产下牛犊牛犊4545头头。其他哺乳动物的情况类似。其他哺乳动物的情况类似。可见：可见：哺乳动物一生中卵母细胞的有效哺乳动物一生中卵母细胞的有效利用率利用率 ，胚胎工程要研究解，胚胎工程要研究解决这样的问题。决这样的问题。很低很低 指对动物指对动物早期胚胎或配子早期胚胎或配子所进行的多种所进行的多种显微操作和处理技术。包括体外

2、受精、胚胎移显微操作和处理技术。包括体外受精、胚胎移植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。植、胚胎分割移植、胚胎干细胞培养等技术。即即各种胚胎操作技术各种胚胎操作技术。研究对象：研究对象：胚胎工程：胚胎工程：主要是高等脊椎动物，尤其是哺乳动物主要是高等脊椎动物，尤其是哺乳动物研究水平：研究水平：细胞水平细胞水平定义：定义：操作对象：操作对象：早期胚胎或配子早期胚胎或配子第第2 2节节 胚胎工程实验技术胚胎工程实验技术一、人工授精和胚胎体外培养一、人工授精和胚胎体外培养（一）人工授精：（一）人工授精：1、精子的获取、精子的获取2、卵细胞的获取、卵细胞的获取3、体外授精、体外授精（一）人工授精：

3、（一）人工授精：1 1、精子的获取：、精子的获取：可采集可采集部位：部位：睾丸、附睾、射出的精子及雌性生睾丸、附睾、射出的精子及雌性生殖道内。殖道内。方法：方法：常用人工采集的方式采集常用人工采集的方式采集精液精液。精液的保存：精液的保存： 低温保存低温保存（一）人工授精：（一）人工授精：2 2、卵细胞的获取：、卵细胞的获取：可采集部位：可采集部位： 卵巢、输卵管、子宫卵巢、输卵管、子宫卵母细胞方法：方法：手术法：手术法：非手术法：非手术法：中小型动物，如鼠、兔、羊中小型动物，如鼠、兔、羊大型动物，如牛大型动物，如牛超数排卵超数排卵冲洗输卵管采卵冲洗输卵管采卵子宫冲卵子宫冲卵超排卵技术超排卵技

4、术 利用利用处理，使处理，使得卵巢中有更多的卵泡发育，得卵巢中有更多的卵泡发育，更多的卵被排出，这个过程就更多的卵被排出，这个过程就称为超数排卵。称为超数排卵。超数排卵超数排卵定义：定义：指人为注射外源性指人为注射外源性促性腺激素促性腺激素，促使，促使卵巢排出更多成熟卵细胞。卵巢排出更多成熟卵细胞。下丘脑下丘脑促性腺激素释放激素垂体垂体促性腺激素卵巢卵巢排卵排卵卵细胞发生的激素调节卵细胞发生的激素调节垂体垂体促卵泡刺激促卵泡刺激素（素（FSHFSH）促黄体生成促黄体生成激素（激素（LHLH）促进卵泡细胞生长发育促进卵泡细胞生长发育促进卵泡细胞释促进卵泡细胞释放更多放更多雌激素雌激素促进卵泡生长

5、促进卵泡生长下丘脑下丘脑促性腺激素释放激素释放卵细胞释放卵细胞卵卵巢巢（一）人工授精：（一）人工授精：3 3、体外授精：、体外授精：获取的获取的卵细胞卵细胞培养液培养液M中卵中卵母细胞母细胞获取获取的精的精液液精子精子精浆精浆离心离心分离分离精精子子获能获能培养培养获能获能的精的精子子培养培养液法液法显微显微注射注射法法受受精精卵卵一、人工授精和胚胎体外培养一、人工授精和胚胎体外培养（二）体外培养（二）体外培养受受精精卵卵发育培发育培养液养液由于不同时期的胚胎生理代谢不同，故需配置一系列含由于不同时期的胚胎生理代谢不同，故需配置一系列含有不同成分的有不同成分的培养液培养液（CO2、O2、AA、

6、核苷酸、无机盐、核苷酸、无机盐、能源物质、维生素、激素、动物血清等。）能源物质、维生素、激素、动物血清等。）早期早期胚胎胚胎冷冻保存冷冻保存植入受体植入受体 胚胎体外培养胚胎体外培养是胚胎工程的核心技术，是胚胎工程的核心技术，但是由于哺乳动物胚胎发育条件异常复杂，因但是由于哺乳动物胚胎发育条件异常复杂，因此，只能培养不同阶段的胚胎，此，只能培养不同阶段的胚胎，目前还无从受目前还无从受精卵培养到新生儿的全体外培养精卵培养到新生儿的全体外培养。 指将雌性动物指将雌性动物体内的体内的早期胚胎早期胚胎，或，或者通过者通过体外受精及其他方式体外受精及其他方式获得的获得的胚胎胚胎，移植，移植到到同种的、生

7、理状态相同同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。使之继续发育为新个体的技术。二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术1、定义：、定义：1、定义：、定义：良种雌性动物良种雌性动物体体内内的早期胚胎的早期胚胎体外体外授精或其他授精或其他方式获得的胚胎方式获得的胚胎（超数排卵获（超数排卵获得多个胚胎）得多个胚胎）植入植入其他雌性动物其他雌性动物供体供体发育发育个体个体受体受体二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术条件：生产价值条件：生产价值高、性状优良高、性状优良条件：同种、条件：同种、同期发情、同期发情、健康健康胚胎来源胚胎来源胚胎的来源：胚胎的来源： 雌性动物

8、的早期胚胎或体外受精及雌性动物的早期胚胎或体外受精及其他方式得到的胚胎。其他方式得到的胚胎。供体：供体： 提供胚胎的个体。提供胚胎的个体。受体：受体： 接受胚胎的个体。接受胚胎的个体。受体的条件：受体的条件：同种、生理状态相同。同种、生理状态相同。培养培养体内体内授精授精超数超数排卵排卵2、胚胎的来源：、胚胎的来源：二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术体外体外授精授精供体供体多个卵多个卵细胞细胞多个多个早期早期胚胎胚胎取取出出手术法手术法非手术法非手术法多个受多个受精卵精卵早期胚胎早期胚胎3、胚胎植入：、胚胎植入：二、胚胎移植技术二、胚胎移植技术手术法：手术法：非手术法：非手术法：取出输卵管和子宫

9、，注入胚胎取出输卵管和子宫，注入胚胎通过一定的器械，注入胚胎通过一定的器械，注入胚胎（7）胚胎的移植）胚胎的移植方法一：手术法方法一：手术法具体做法：引出受体子具体做法：引出受体子宫和卵巢，将胚胎注入宫和卵巢，将胚胎注入子宫角，缝合创口。子宫角，缝合创口。方法二：非手术法方法二：非手术法将装有胚胎的移植管送将装有胚胎的移植管送入受体母牛子宫的相应入受体母牛子宫的相应部位，注入胚胎。部位，注入胚胎。4、基本程、基本程序：序：以牛为例以牛为例供体母牛供体母牛良良种种公公牛牛受体母牛受体母牛同期发情处理同期发情处理超数排卵超数排卵精子精子受精卵受精卵早期胚胎早期胚胎收集胚胎收集胚胎冲胚冲胚发育发育检

10、测检测健康健康胚胎胚胎胚胎胚胎移植移植保存保存手术法手术法非手术法非手术法分娩分娩胚胎移植后代胚胎移植后代体体内内授授精精多个卵细胞多个卵细胞良种母牛良种母牛卵母细胞的体外培养卵母细胞的体外培养良种公牛良种公牛精子体外获能精子体外获能体外受精体外受精良种牛体外受精胚胎良种牛体外受精胚胎胚胎移植胚胎移植受体牛受体牛良种犊牛良种犊牛成熟期牛成熟期牛屠宰加工厂屠宰加工厂市场市场采集卵巢中的采集卵巢中的卵母细胞卵母细胞“试管牛试管牛”工厂化生产的技术流程图工厂化生产的技术流程图超数排卵超数排卵有有性性生生殖殖 试管动物 与 克隆动物相比生殖方式：技术手段：有性生殖核移植技术、胚胎移植体外受精体外受精胚

11、胎移植胚胎移植无性生殖5 5、胚胎移植的现状和意义、胚胎移植的现状和意义1) 1)保持供体优良特性保持供体优良特性(加速育种工作和品种改良加速育种工作和品种改良) )2)2)节约成本节约成本费用费用(大量节省购买种畜的费用大量节省购买种畜的费用) )；3)3)大规模繁殖大规模繁殖(一胎多产一胎多产) )；4)4) 保存品种资源和保存品种资源和保护保护濒危物种；濒危物种；5)5)充分发挥雌性个体的繁殖潜力充分发挥雌性个体的繁殖潜力,缩短供体本身的缩短供体本身的繁殖周期繁殖周期。三、胚胎分割三、胚胎分割概念概念: 将早期胚胎切割成将早期胚胎切割成2等份，等份，4等份或等份或8等份等份等，经移植获得

12、同卵双胎或多胎的技术。等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。一）胚胎分割技术研究概况 胚胎分割技术开始于Nicholas （1942）对大鼠2-细胞卵裂球的分离和培养。其后，Tarkowski等研究了小鼠1/4,2/4,3/4卵裂球的发展规律,得到了世界上首例半胚来源的活体动物。20世纪70年代以来,随着胚胎培养及移植技术的发展和提高,哺乳动物胚胎分割技术取得了突破性进展。目前胚胎分割的研究方向也正向着简单化和实用化发展。 我国1986年张涌等首次利用胚胎分割方法获得同卵双生小鼠，1987年又获得同卵双生山羊。1986年窦忠英等获得分割胚牛犊，1990年又获得奶牛四分胚后代。1987年谭丽玲等获

13、得同卵双生犊。 二）胚胎分割的基本程序二）胚胎分割的基本程序 切割器具的准备；切割器具的准备； 胚胎的预处理；胚胎的预处理； 胚胎的分割；胚胎的分割； 分割胚的培养；分割胚的培养； 分割胚的移植；分割胚的移植；1. 切割器具切割器具 体视显微镜； 显微操作仪； 胚胎固定管； 胚胎分割针；2. 胚胎的预处理胚胎的预处理 用链霉蛋白酶处理 链霉蛋白酶的作用： 使透明带软化、变薄或去除3. 胚胎的分割方法胚胎的分割方法 酶解法：用链霉蛋白酶处理 机械法：用分割针切开透明带4. 分割胚的培养；分割胚的培养； 原因： 早期胚胎切割后发育能力低，一般是经包埋后移植到中间受体的输卵管中培养几天至囊胚，再从输

14、卵管中回收胚胎，最后移植给受体。 方法：体外培养 体内培养（需琼脂包埋）琼脂包埋的作用 固定胚胎 便于回收分割胚的移植分割胚的移植 要求： 胚胎分割后可以直接移植给受体，也可胚胎分割后可以直接移植给受体，也可以进行超低温冷冻保存。以进行超低温冷冻保存。 为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割为提高冷冻胚胎移植后的受胎率，分割的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或的胚胎需要在体内或体外培养到桑椹或囊胚阶段，再进行冷冻。囊胚阶段，再进行冷冻。 早期胚胎胚胎分割基本过程胚胎分割基本过程代孕母牛植入植入分割胚胎移入培养液胚胎移入培养液分割胚胎（机械法、酶处理）分割胚胎（机械法、酶处理）移植胚胎给受体移植胚胎给

15、受体着床产仔着床产仔三）胚胎分割技术的应用 应用： 在畜牧方面：扩大优良家畜的数量 在研究方面：培养遗传特性相同的实验动物 性别鉴定 存在问题： 如：早期胚胎细胞的分化和定位的发育机制 不同阶段胚胎细胞的分化时间和发育潜力四、胚胎干细胞核移植技术四、胚胎干细胞核移植技术1.1.概念：概念：（胚胎干细胞）胚胎干细胞）：简称：简称ESES或或EKEK细胞，是由细胞，是由早早期胚胎期胚胎或或原始性腺原始性腺中分离出来的一类细胞。中分离出来的一类细胞。2.2.特点特点: : 1) 1)形态：形态：体积小、细胞核大、核仁明显。体积小、细胞核大、核仁明显。 2)2)功能：功能：具有发育的具有发育的全能性全

16、能性；是一种高度；是一种高度未分化未分化的细的细胞，可分化为成年动物体内任何一种组织和器官。胞，可分化为成年动物体内任何一种组织和器官。 3 3）应用：）应用：在在体外体外培养的条件下，可以培养的条件下，可以增殖而不发生增殖而不发生分化分化；对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。；对它可以进行冷冻保存，也可以进行遗传改造。3.3.主要用途：主要用途： (1)(1)治疗人类的某些顽症治疗人类的某些顽症 (2)(2)培育出人造组织器官，用于器官移植培育出人造组织器官，用于器官移植 (3)(3)是研究体外细胞分化的理想材料是研究体外细胞分化的理想材料1. 饲养层细胞培养体系的建立饲养层细胞培养体

17、系的建立饲养层培养体系的构成 胚胎成纤维细胞 作用：抑制细胞分化成纤维细胞（fibroblast）：是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。细胞较大，轮廓清楚，多为突起的纺锤形或星形的扁平状结构，细胞核卵圆形，核仁大而明显。 细胞功能活动旺盛，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动。成纤维细胞对不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损以及骨创伤的修复有着十分重要的作用。饲养层细胞（feeder layer ）：在正常机体内，细胞除了获得一些血液来的营养外，还在细胞与细胞之间互换特殊的物质，用于分裂分化和营养等。因而，在细胞体外培养中，除

18、了正常的培养基外，先培养一层特殊的细胞，然后再在其上接种要实验的细胞，这样更能模拟体内环境。这些特殊的细胞就是饲养层细胞，通常是成纤维类细胞，这些细胞可以提供实验细胞更好的营养，有的分化研究则是必须有饲养层细胞。 2.胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的获得 时期：囊胚或囊胚期以前 如小鼠：桑椹胚、囊胚 人体：囊胚、原始生殖细胞 培养：置于含饲养层的培养液中培养 方法：原代培养和传代培养 传代培养的作用：抑制胚胎干细胞分化胚胎干细胞分化一）胚胎干细胞核移植程序胚胎干细胞核移植程序 饲养层细胞培养体系的建立饲养层细胞培养体系的建立 胚胎干细胞的获得胚胎干细胞的获得 胚胎干细胞的核移植胚胎干细胞的核移植胚

19、胚胎胎干干细细胞胞培培养养3. 胚胎干细胞的核移植胚胎干细胞的核移植指把胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，指把胚胎干细胞核移植到去核的卵细胞中，经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接经过胚激活、胚胎培养、胚胎移植后直接由受体完成克隆动物的技术。由受体完成克隆动物的技术。胚胚胎胎干干细细胞胞核核移移植：植： 二）胚胎干细胞的应用二）胚胎干细胞的应用 培养克隆动物的核供体 获得基因敲除动物 治疗性克隆1.1.下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是下列有关动物胚胎移植的叙述中，错误的是A.A.受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植受孕母畜体内的受精卵或胚胎均能移植B.B.受体母畜必须处于与供体母畜同步发情的状态受体母畜必须处于与供体母