课题3血红蛋白的提取和分离1111

1、课题3 血红蛋白的提取和分离专题5 DNA和蛋白质技术思考思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？分离生物大分子的基本思路是什么？选用一定的物理或化学的方法分离具有选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。不同物理或化学性质的生物大分子。思考思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？蛋白质的分离和提取的原理是什么？根据蛋白质各种特性的差异，如分子的根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。和力等等，可以用来分离不

2、同蛋白质。一、基础知识：一、基础知识： 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、凝胶：、凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛），具多孔的凝胶就叫分子筛） 2、概念：、概念：根据被根据被分离物质的蛋白质相对分离物质的蛋白质相对分子质量的大小分子质量的大小，利用具有网状结构的凝，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。胶的分子筛作用，来进行分离。分子量大小直径大小大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部运动方式垂直向下移动垂直向下移

3、动，无规则扩散进入颗粒内部运动速度较快较慢运动路径较短较长洗脱次序先从凝胶柱洗脱出来后从凝胶柱洗脱出来 用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质大的蛋白质 A A路程较长，移动速度较慢路程较长，移动速度较慢 B B路程较长，移动速度较快路程较长，移动速度较快 C C路程较短，移动速度较慢路程较短，移动速度较慢 D D路程较短，移动速度较快路程较短，移动速度较快D4 4、具体过程、具体过程 相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个的进行过程可表示为图中哪一个B1 1、概念：、概念：在一定的范围内，能对抗外来少在

4、一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PHPH发发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。冲作用的溶液叫做缓冲溶液。 缓冲溶液：2 2、作用：、作用：能够抵制（能够抵制（ ）对溶）对溶液（液（ ）的影响，维持）的影响，维持PHPH基本不基本不变。变。外界的酸或碱外界的酸或碱pHpH值值3 3、缓冲溶液的配制、缓冲溶液的配制通常由（通常由（ ）种缓冲剂溶解于水中）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（配制而成。调节缓冲剂的（ ）就可以制得（就可以制得（ ）使用的缓冲液。）使用的缓冲液

5、。1 12 2使用比例使用比例在不同在不同PHPH范围内范围内思考：说出人体血液中缓冲液。思考：说出人体血液中缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3磷酸缓冲液，磷酸缓冲液，保证血红蛋白的正常结构和保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察功能，便于观察()和科学研究其和科学研究其()4、在本课题中使用的缓冲液？、在本课题中使用的缓冲液？（三）（三） 电泳：电泳：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 许多重要的生物大分子，如多肽、许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的核酸等都具有可解离的基团，在一定的P

6、HPH下，下，这些基团会带上正电或负电。这些基团会带上正电或负电。在电场的作用在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。而实现样品中各种分子的分离。琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳在电场的作用下，这些带电分子会向着与在电场的作用下，这些带电分子会向着

7、与其所带电荷相反的电极移动其所带电荷相反的电极移动 4 4、聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳（1 1）聚丙稀酰胺凝胶：）聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰是由单体丙烯酰胺和交联剂胺和交联剂N,NN,N，亚甲基双丙烯酰胺在引发剂亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率迁移率取取决于它所带决于它所带净电荷净电荷的多少以及的多少以及分子的大分子的大小小等因素。等因素。为了消除为了消除净电荷对迁移率的影响，净电荷对迁移率的影响，可以可以在凝胶中加入在凝胶中加

8、入SDSSDS。（2 2）原理：）原理： SDS SDS能使蛋白质发生完全变性。能使蛋白质发生完全变性。由几条由几条肽链组成的蛋白质复合体在肽链组成的蛋白质复合体在SDSSDS的作用下的作用下会会，因此测定的结果只，因此测定的结果只是是。SDSSDS能与各种蛋白能与各种蛋白质形成质形成，SDSSDS所带负所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子电荷的量大大超过了蛋白质分子。因而掩盖了因而掩盖了，使电泳迁移率完全，使电泳迁移率完全取决于分子取决于分子的大小。的大小。（3 3）SDS-SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳作用机理作用机理: :使用使用SDS-SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋聚

9、丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于白质的电泳迁移率完全取决于A A 电荷的多少电荷的多少 B B 分子的大小分子的大小C C 肽链的多少肽链的多少 D D 分子形状的差异分子形状的差异 二、实验操作：样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取和分离一般分为四步：蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理）样品处理：包括洗涤红细胞；血：包括洗涤红细胞；血红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红红蛋白稀释；离心等操作收集到的血红蛋白溶液。蛋白溶液。（2）粗分离）粗分离：透析除去分子较小的杂：透析除去分子较小的杂质。质。（3）纯化）纯化：通过凝胶色谱法将分子量：通过凝胶色谱法将分子量较大

10、的杂质蛋白质除去。较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定）纯度鉴定：通过聚丙烯酰胺凝胶：通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。电泳鉴定。二、实验操作：（一）样品处理（一）样品处理1 1、红细胞的洗涤：、红细胞的洗涤：2 2、血红蛋白的释放：、血红蛋白的释放：3 3、分离血红蛋白溶液：、分离血红蛋白溶液：4 4、透析、透析：如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？血液柠檬酸钠血液柠檬酸钠低速短时离心低速短时离心吸出上层血浆吸出上层血浆红细胞红细胞5倍倍体积生理盐水体积生理盐水 缓慢搅拌缓慢搅拌10min低速短时离心低速短时离心吸出上清液吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色反复洗

11、涤直至上清液无黄色在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放在蒸馏水和甲苯（？）作用下，红细胞破裂释放红细胞破碎混合液红细胞破碎混合液中速长时离心（中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明得到红色透明液体。液体。装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为为7.0）透析）透析二、实验操作：二、实验操作：分离血红蛋白溶液有机溶剂有机溶剂 无色透明的甲苯层无色透明的甲苯层脂类物质脂类物质 白色脂溶性物质沉淀层白色脂溶性物质沉淀层血红蛋白溶液血红蛋白溶液 红色透明液体红色透明液体红细

12、胞破碎物沉淀红细胞破碎物沉淀 暗红色沉淀物暗红色沉淀物练习巩固1、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是做的一步是A 弄清各种蛋白质的空间结构弄清各种蛋白质的空间结构B 弄清各种蛋白质的功能弄清各种蛋白质的功能C 弄清各种蛋白质的合成过程弄清各种蛋白质的合成过程D 获得高纯度的蛋白质获得高纯度的蛋白质2、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是，关于蛋白质的叙述，正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分

13、子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质相对分子质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较3、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异4、在采血容器中加入柠檬酸钠的目的是、在采血容器中加

14、入柠檬酸钠的目的是A 调节调节pH B 维持红细胞的能量供应维持红细胞的能量供应C 防止微生物生长防止微生物生长 D 防止血液凝固防止血液凝固5、一分子血红蛋白最多可携带的、一分子血红蛋白最多可携带的 O2分子分子数和数和CO2分子数分别是分子数分别是A 4、2 B 4、4 C 2、1 D、1、16、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序分层顺序自上而下自上而下是：是：有有机溶剂机溶剂-脂脂类物质类物质-血血红蛋白溶液红蛋白溶液-红红细胞破碎物沉淀细胞破碎物沉淀1 1、凝胶色谱柱的制作：、凝胶色谱柱的制作：二、实验操作：二、实验操作：样品处理样品处理粗分

15、离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定色谱柱的制作过程：准备材料色谱柱的制作过程：准备材料加工橡皮塞加工橡皮塞安装色谱柱安装色谱柱凝胶色谱柱取长为凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为，内径为16 cm，有关说法中，正确的是，有关说法中，正确的是 (多选多选)A一般凝胶色谱柱直径的大小不影响一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果分离的效果B凝胶色谱柱过高超过凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响，不影响分离的效果分离的效果C凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度分离度D凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大脱液，样品的稀释度过大步骤步骤

16、操作要求操作要求操作要求操作要求色谱柱垂直固定在支架上色谱柱垂直固定在支架上计算称量凝计算称量凝胶胶根据色谱柱体积计算凝胶用量根据色谱柱体积计算凝胶用量配制悬浮液配制悬浮液凝胶颗粒蒸馏水凝胶颗粒蒸馏水充分溶胀充分溶胀凝胶颗粒洗脱液凝胶颗粒洗脱液沸水浴沸水浴装填悬浮液装填悬浮液一次性缓慢倒入；轻轻敲打一次性缓慢倒入；轻轻敲打缓冲液洗涤缓冲液洗涤平衡平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡12h12h装配好的凝胶柱打开下端出口，使柱内缓冲液缓打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱柱的顶样品加到色谱

17、柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝不要破坏凝胶面。胶面。加样后打开下端出口，使样品加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。小心加入小心加入pH=7.0 pH=7.0 的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液到的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每收

18、集流出液，每5ml5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功），如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）正确的加样操作：正确的加样操作：1 1、不要触及并破坏凝胶面、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。正确的加样操作是正确的加样操作是（1 1）不要触及并破坏凝胶面不要触及并破坏凝胶面。（2 2）贴壁加样。）贴壁加样。（3 3）使吸管管口沿管壁环绕移动）使吸管管口沿管壁环绕移动。让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范

19、围内，维持结构和功能。范围内，维持结构和功能。 血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。非常直观，大大简化了实验操作。 血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：。首先通过洗涤红细胞、血红蛋。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液血红蛋白溶液，即，即: :样品的处理样品的处理；再经过透析去除分子

20、量较小的杂质，即样品的粗分离；然后；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后将相对分子质量较大的将相对分子质量较大的杂质蛋白除去杂质蛋白除去，即，即: :样样品的纯化；最后经品的纯化；最后经进行纯度鉴定。进行纯度鉴定。收集得到的纯化后的蛋白 在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是是 A A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果序，降低分离效果 B B、气泡阻碍蛋白质的运动、气泡阻碍蛋白质的运动 C C、气泡与蛋白质发生化学反应、气泡与蛋白质发生化学反应 D D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧、气泡

21、在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密密A 样品的加入和洗脱的操作不正确的是样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面面的下面 B B加样后，打开下端出口，使样品渗入加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内凝胶床内 C C等样品完全进入凝胶层后，关闭下端等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口出口 D D用吸管小心的将用吸管小心的将1ml1ml透析后的样品加到透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面A 下列是有关血红蛋白提取和分离的

22、相关操下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（作，其中正确的是（ ） A A可采集猪血作为实验材料可采集猪血作为实验材料 B B用蒸馏水重复洗涤红细胞用蒸馏水重复洗涤红细胞 C C血红蛋白释放后应低速短时间离心血红蛋白释放后应低速短时间离心 D D洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液出液 A鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。血红蛋白的取和分离凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定血红蛋白的提取和离蛋白质分子的差异性蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法

23、缓冲溶液组成作用缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18），），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？理后的样品发生了哪些变化吗？2 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的