分子生物学学生实验

1、生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验一 基因组DNA的抽提生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：20SSC、 蛋白酶K （20 mg/mL）、10%SDS、0.5M EDTA(2Na) ddH2O、液N、饱和酚、氯仿、异戊醇、正丁醇、无水乙醇、3M NaAc、TE仪器及耗材：移液器、Tip头、冷藏盒、液N罐、研钵、冰箱、棉手 套、15 mL 离心管（半透明）、1.5 mL离心管、高速 冷冻离心机、恒温水浴锅、药匙、长颈玻璃吸管、移 液管、酒精灯、pH计、废液缸、灭菌锅材料：家蚕后部丝腺和家蚕个体生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程1材料磨至粉末3.5mL酶解缓冲液液N50

2、4 h以上10 mL酶解缓冲液20 mg/mL蛋白酶K 0.1 mL10% SDS 0.5 mL0.5M EDTA 1.0 mLddH2O 8.4 mL生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程23.5mL酶解缓冲液加入3.5mL饱和酚混匀30 min12000r/m10 min44去沉淀加入3.5mL饱和酚和氯仿（1：1）30 min混匀12000r/m10 min取上清等体积正丁醇混匀5 min4000r/m5min30 min4AB重复A-B去上清终体积1 mL以下0.1 mL NaAc、2.5 mL 乙醇钩出DNA溶于TE生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验二 基因组DNA的

3、RNase处理生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：RNase （10 mg/mL）、ddH2O、饱和酚、氯仿、异戊醇、正丁 醇、无水乙醇、3M NaAc、TE仪器及耗材：移液器、Tip头、冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心管、高速 冷冻离心机、恒温水浴锅、长颈玻璃吸管、移 液管、酒精灯、废液缸、灭菌锅材料：新抽提的家蚕基因组DNA生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程0.5mL基因组DNA加入1L RNase37 1 h12000r/m10 min去下层加入等体积酚和氯仿（1：1）12000r/m10 min等体积正丁醇4000r/m5min取上清终体积0.1 mL以下10L Na

4、Ac、0.25 mL 乙醇析出DNA等体积酚混匀30 min4 等体积酚混匀30 min12000r/m10 min4 去下层混匀30 min12000r/m10 min4 混匀30 min70%乙醇洗盐2次溶于TE生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验三 DNA的浓度测定生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：ddH2O、TE仪器及耗材：紫外分光光度计、Tip头、冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心 管、废液缸、吸水纸材料：RNase处理过的家蚕基因组DNA生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程DNA样品的浓度（g / l） OD260稀释倍数（100）50/1000(OD2601

5、时，dsDNA浓度约为50g / mL)2.0L基因组DNA198L TE混匀测OD260、 OD280计算DNA浓度、分析DNA纯度（OD260/ OD280）计算公式：计算公式：生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验四 DNA的凝胶电泳检测生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：琼脂糖、TBE、EB（1 mg/mL)、ddH2O、DNA上样缓冲液、 DNA标准分子量仪器及耗材：电泳仪及电泳槽、制胶槽、微波炉、三角瓶、Tip头、 冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心管、废液缸、吸水纸、凝 胶成像系统、水平仪。材料：RNase处理过的家蚕基因组DNA生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验

6、流程称取0.4g琼脂糖250 mL三角瓶40 mL1TBE微波炉加热至完全溶化冷却至60以下加入EB终浓度为0.5 g/mL倒入制胶槽室温静至40 min DNA（2-8 L） 上样缓冲液2 L混和后上样电泳40-60 min 拍照片生物学实验（四）专业：生物科学（应用）生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验五 DNA目的片段的PCR扩增生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：引物、dNTP、Tag DNA聚合酶、10PCR buffer、琼脂糖、 TBE、EB（1 mg/mL)、ddH2O、DNA上样缓冲液、 DNA标准 分子量仪器及耗材：PCR仪、电泳仪及电泳槽、制胶槽、微波炉、三

7、角瓶、 Tip头、 冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心管、废液缸、吸水 纸、凝胶成像系统、水平仪。材料：RNase处理过的家蚕基因组DNA生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程PCR试剂完全溶化做1%琼脂糖胶 PCR产物8 L 上样缓冲液2 L混和后上样电泳40-60 min 拍照片25 LP1 0.5 LP2 0.5 LdNTP 2 L10PCR buffer 2.5 LDNA 1 LTag DNA聚合酶 0.5 LddH2O 18 L PCR反应生物学实验（四）专业：生物科学（应用）GenomeP1: 5-CAGGTGTATCGTAAATAGGATGTAA-3，GenomeM1: 5-

8、TTTCCATATTCACGGTTTCTGT-3。PCR反应条件为：94预变性2 min, 然后94 30 sec 52.5 30 sec，72 45 sec 32个循环，最后72延伸10 min。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验六 LB培养基的配制生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：胰蛋白栋、酵母抽提物、NaCl、NaOH、ddH2O、Amp仪器及耗材：9cm培养皿、试管、磁力搅拌器、玻璃棒、三角瓶、 Tip头、 冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心管、废液缸、吸水 纸、超净工作台、灭菌锅。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）配制方法LB液体培养基胰蛋白栋 10g酵母抽提物 5

9、gNaCl 10g1M NaOH调pH至7，加水至1000 mL灭菌分装（3 mL)LB固体培养基：在LB液体中加入1.4%琼脂粉，灭菌备用（需要时加Amp等）。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验七 感受态细胞的制备生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：TG1或DH5、LB培养基、75 mmol/L CaCl2、无菌甘油仪器及耗材：试管、恒温摇床、移液器、Tip头、分光光度计（测 OD550）、冰盒、冰箱、离心机生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程培养液转入离心管冰上放置10 min5000r/min10 min4弃上清菌液一半体积的Cacl2冰上放置30 min300

10、0r/min10 min4弃上清200LCacl2冰上放置4 h感受态细胞注：也可加入总体积15%甘油，制备甘油菌，-70 可保存6个月生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验八 PCR产物的回收与连接反应生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：胶回收试剂盒、电泳一套试剂、T载体、T4连接酶及缓冲 液、ddH2O仪器及耗材：移液器、Tip头、冰盒、冰箱、离心机、金属浴、电泳 一套、天秤、解剖刀（切胶用）生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程PCR产物电泳切胶DNA回收电泳检验（可省）连接反应T4 DNA 10Buffer 1 LT载体 1 LddH2O 5 LT4DNA连接酶 1

11、 L回收DNA 2 L（0.4g)连接过夜16 生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验九 转化与涂平板生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：连接产物、感受态细胞、LB培养基（液体和固体 Amp+100g/mL)、 X-gal(48mg/mL) 、IPTG(96mg/mL)。仪器及耗材：移液器、Tip头、冰盒、冰箱、离心机、水浴、 涂菌环、酒精灯、培养箱生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程连接产物200 L感受态42 90min1 mL 37预热LB 加入5 LX-gal、 5 LIPTG留下200 L加入冰浴30min冰浴2min37 60min振荡培养 4 4000r/m

12、in 5min涂Amp+平板37 正面向上培养30min37 倒置培养过夜生物学实验（四）专业：生物科学（应用） 是根据载体的遗传特征筛选重组子，如-互补、抗生素基因等。现在使用的载体都带有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质

13、粒之间实现了互补，称为-互补。由-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，会导致读码框改变，表达蛋白失活，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。蓝白斑筛选原理蓝白斑筛选原理生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验十 质粒DNA的提取生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：LB培养基、Amp+、溶液、溶液、溶液、无水乙醇、 3M NaAc、TE。仪器及耗材：移液器、Tip头、冰盒、冰箱、离心机、水浴、 酒精灯、培养箱、摇床。生物学实验（四）专业：生

14、物科学（应用）实验流程取1.5 mL菌液1.5 mL EP管弃上清100 L溶液12000 r/min 10 min加入4 4000r/min 1min200 L溶液取上清至新管室温10 min2倍体积的无水乙醇、1/10体积的NaAc离心室温5 min150 L溶液室温3 min-20 30min12000 r/min 10 min弃上清70% 乙醇1 mL洗盐沉淀溶于50 L TE生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验十 质粒DNA的酶切鉴定生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：pst 及Buffer、标准分子量、电泳试剂一套仪器及耗材：金属浴、移液器、Tip头、冰盒、冰箱、电泳

15、一套。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程质粒DNA 1-2 Lpst 1 L10Buffer 2 LH2O 15-16 L10 L电泳检测分析外源DNA片段的大小生物学实验（四）专业：生物科学（应用）pUCm-T载体的图谱 生物学实验（四）专业：生物科学（应用）生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验十一 动物组织总RNA的抽提生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：氯仿、异丙醇、DEPC乙醇、Trizol试剂、液N仪器及耗材：超净工作台、研钵（DEPC处理）、移液器、Tip头 （RNase free)、Ep管（ RNase free)、冰盒、冰箱、 离心机。生物学实验（四）

16、专业：生物科学（应用）实验流程组织块研钵加入Trizol 1mL12000 r/min 15 min快速研磨至粉末移入Ep管取上清至新管完全溶化加入与上清等体积的异丙醇超净台室温5 min200 L氯仿室温5 min12000 r/min 10 min弃上清75% 乙醇1 mL洗沉淀溶于100 L DEPC水中振荡混匀4 室温10 min4 生物学实验（四）专业：生物科学（应用）生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验十二 RNA浓度的测定与反转录生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：模板RNA、Oligo(dt) primer(50M)、RNase free dH2O、 DEPC乙醇

17、、5M-MLV buffer、dNTP Mixture(各10 mM）、 RNase Inhibitor(40U/l)、RTase M-MLV(RNase H-)(200U/l)仪器及耗材：超净工作台、金属浴、移液器、Tip头 （RNase free)、Ep管（ RNase free)、冰盒、冰箱、 离心机。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程RNA样品稀释50倍测定OD260值紫外分光光度计计算RNA浓度冰上2 min后加入70 10 minOligo(dt) primer(50M) 1 lRNA 1 gRNase free dH2O up to 6 l5M-MLV buffer

18、2 ldNTP Mixture (各10 mM) 0.5 lRNase Inhibitor(40U/l) 0.25 lRTase M-MLV(RNase H-)(200U/l) 0.25-1 lRNase free dH2O up to 10 l42 60 min70 15 min-70 保存生物学实验（四）专业：生物科学（应用）RNA量（ g/mL ）=OD260稀释倍数40 g/mLRNA量的计算公式：生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验十三 PCR检测(A3)cDNA质量生物学实验（四）专业：生物科学（应用）试剂：A3引物、dNTP、Tag DNA聚合酶、10PCR buffer、

19、琼脂糖、 TBE、EB（1 mg/mL)、ddH2O、DNA上样缓冲液、 DNA标准 分子量仪器及耗材：PCR仪、电泳仪及电泳槽、制胶槽、微波炉、三角瓶、 Tip头、 冷藏盒、冰箱、1.5 mL离心管、废液缸、吸水 纸、凝胶成像系统、水平仪。材料：RNase处理过的家蚕基因组DNA生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验流程PCR试剂完全溶化做1%琼脂糖胶 PCR产物8 L 上样缓冲液2 L混和后上样电泳40-60 min 拍照片25 LP1 0.5 LP2 0.5 LdNTP 2 L10PCR buffer 2.5 LDNA 1 LTag DNA聚合酶 0.5 LddH2O 18 L PC

20、R反应生物学实验（四）专业：生物科学（应用）Actin-3 P1 AACACCCCGTCCTGCTCACTGActin-3 P2 GGGCGAGACGTGTGATTTCCT94预变性2 min，然后94 30 sec，60 30 sec，72 30 sec 22个循环，最后72延伸10 min；PCR引物PCR程序生物学实验（四）专业：生物科学（应用）生物学实验（四）专业：生物科学（应用）实验十四 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）测定蛋白质分子量生物学实验（四）专业：生物科学（应用）一. 实验目的学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。掌握垂直板电泳的操作方法。运用SDS-PAGE测

21、定蛋白质分子量及染色鉴定。生物学实验（四）专业：生物科学（应用） 二二 .实验原理实验原理带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。区带电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）P

22、AGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子

23、按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子

24、量。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）SDS电泳的成功关键之一是电泳过程中，待别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。影响它们结合的因素主要有三个：1、溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1:4或1:32、样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，通常是10100mmol/L3、二硫键是否完全被还原生物学实验（四）专业：生物科学（应用）采用SDS-聚丙

25、烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，只有完全打开二硫键， 蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上而给出相对迁移率和分子量对数的线性关系。因此在用SDS处理样品同时往往用巯基乙醇处理，巯基乙醇是一种强还原剂，它使被还原的二硫键不易再氧化，从而使很多不溶性蛋白质溶解而与SDS定量结合。有许多蛋白质是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇作用下，解离成亚基或单条肽链，因此这一类蛋白质，测定时只是它们的亚基或单条肽链的MW。已发现有些蛋白质不能用SDS-PAGE测定分子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构

26、蛋白，如胶原蛋白等。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测蛋白质分子量时，往往采取2种以上测定方法结合使用。目前其他常用测定相对分子量的方法有：聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子量（有浓缩样品特点，可分次加样；不需解离亚基，适宜测定球蛋白，而对纤维蛋白有误差。电泳需2000伏特小时）凝胶层析法测定蛋白质相对分子量（特点方法简单，样品用量少，而且有时不需纯物质，一般不引起生物活性物质的变化。局限性是pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，蛋白质有可能因变性而偏离。）生物学实验（四）专业：生物科学（应用） 三. 实验试剂和器材1.材料： 低分

27、子量标准蛋白试剂盒: 低分子量标准蛋白： 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200l蒸馏水，置-20保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解。生物学实验（四）专业：生物科学（应用） 2.实验试剂实验试剂 (1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺 （Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中， 4贮存可用1-2月。（2）10%

28、SDS（十二烷基磺酸钠）（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g， 加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏 水定容至100ml。（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水 定容至100ml。（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加 入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定 容至100ml。生物学实验（四）专业：生物科学（应用）（7）10%过硫酸铵(AP)（8）TEMED（四甲基乙二胺）（9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g） +0.05mol/L pH8.0Tris- HCl（2ml），最后定容至10ml。（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀。（11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液 250ml， 过滤后备用。（12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml。（13）电极缓冲液（内含0.1%S