结核病实验室诊断技术新进展

1、 结核病实验室诊断技术新进展结核病实验室诊断技术新进展 山东省结核病防治中心山东省结核病防治中心 王海英王海英 2011.11.5 2011.11.5主要内容主要内容l 结核病实验室常用的诊断技术和方法结核病实验室常用的诊断技术和方法l 结核病实验室新的诊断技术和方法结核病实验室新的诊断技术和方法l 未来实验室结核病的诊断模式未来实验室结核病的诊断模式 2 1 1、细菌学方法细菌学方法 2 2、免疫学方法、免疫学方法 3 3、分子生物学方法、分子生物学方法3 3一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法1 1、细菌学方法（抗酸染色双目显微镜、固体或液体培养）、细菌学方法（抗酸染色双目

2、显微镜、固体或液体培养）4 4一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法培养on plates or in broth identification by biochemical or serological tests on pure growth from single colony显微镜检查脱色复染染色unstained or stained with e.g. Gram stain 2 2、免疫学方法、免疫学方法 抗体检测是结核病辅助诊断手段，抗体检测是结核病辅助诊断手段， 对菌阴肺结核有对菌阴肺结核有一定的参考价值。一定的参考价值。 1 1、酶联免疫吸附试验、酶联免疫吸附试

3、验 2 2、免疫胶体金标技术免疫胶体金标技术 5 5一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法673 3、分子生物学方法、分子生物学方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术：技术：也称分子信标技术，是今年发展起来的核酸定量也称分子信标技术，是今年发展起来的核酸定量技术。是技术。是PCR与核酸探针技术的结合，将与核酸探针技术的结合，将PCR较高的灵敏度和核酸探针的较高的灵敏度和核酸探针的高特异性相结合。高特异性相结合。 8 8一、目前实验室常用检测方法一、目前实验室常用检测方法9 9 二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法 分类分类 新方法新方法 用途用途 细菌学检查细菌学检查 L

4、ED(LED(发光二极管显微镜发光二极管显微镜) ) 涂片检查涂片检查 免疫学方法免疫学方法 - -干扰素释放实验干扰素释放实验 潜伏感染者潜伏感染者分子生物学分子生物学 LAMP( LAMP( 等温扩增等温扩增) ) 涂阴涂阴 涂阳涂阳 LPA( LPA( 线性探针线性探针) )MDR-TB, MDR-TB, 鉴定鉴定 GenechipGenechip( (基因芯片基因芯片) MDR-TB, ) MDR-TB, 鉴定鉴定 GeneXpertGeneXpert( (多色巢式定量多色巢式定量PCR) PCR) 耐耐RFP, RFP, 涂阴涂阴 分子分型技术分子分型技术 指纹图谱分析指纹图谱分析

5、其他其他 DNA DNA 测序法测序法 突变检测突变检测 HPLC HPLC 胞壁成分检测胞壁成分检测 10 10二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法1 1、细菌学检查、细菌学检查 发光二极管发光二极管（ （LEDLED） ）荧光显微镜荧光显微镜光源寿命光源寿命长长（30,000h30,000h）不不需要预热需要预热不需要不需要暗室暗室可用现有的显微镜可用现有的显微镜可使用可使用电池电源电池电源与与通常通常荧光显微镜的荧光显微镜的判定一判定一致率致率98.0%98.0%两种方法观察结果两种方法观察结果Z-N染色镜检结果染色镜检结果LED镜检结果镜检结果二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术

6、和方法中盖项目中盖项目LED评估结果评估结果LED涂阳患者检出率为14.96%（552/3691），萋尼氏染色明场显微镜涂阳患者检出率12.46% (460/3691)，前者较后者提高2.5个百分点（P=0.000）LED和明场显微镜的检出率分别为7.09%(178/2509)和2.83%（71/2509)，提高4.26个百分点（P=0.000）中盖项目中盖项目LED评估结果评估结果LED 读片时间120.0338.88秒，明场显微镜206.3175.86秒（p=0.00）对于进一步推广建议，大多数(8/9)认为应进一步推广，但其中有2人认为应在日工作量大的实验室优先使用14 14二、二、 新

7、诊断技术和方法新诊断技术和方法 单核细胞分离单核细胞分离TBTB抗原刺激，抗原刺激，IFN-IFN- 释放释放与标记的二抗结合与标记的二抗结合 酶作用标记物显色酶作用标记物显色每一斑点代表释放每一斑点代表释放 IFN- IFN- 的的一个一个细胞细胞Y Y Y YY Y Y YY Y Y YYYYYY Y Y YYYYYIFN-抗原抗原一抗捕获一抗捕获IFN-IFN- 2 2、免疫学方法：、免疫学方法： - -干扰素释放实验干扰素释放实验BCG进化过程进化过程16 16二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法分子生物学分子生物学 LAMPLAMP( ( 等温扩增等温扩增) )LPALPA(

8、( 线性探针线性探针) )GenechipGenechip( (基因芯片基因芯片) )GeneXpertGeneXpert( ( 多色巢式定量多色巢式定量PCRPCR) )分子分子分型技术分型技术17 17二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1 1）环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)：Eiken,Japan 可同时检测可同时检测患者是否感染结核患者是否感染结核 所用仪器设备极其简单所用仪器设备极其简单 63 63 扩增（避免非特异性扩增扩增（避免非特异性扩增 多对引物（提高特异性和速度）：靶基

9、因多对引物（提高特异性和速度）：靶基因6 6个不同区域，设计个不同区域，设计4 4种引物种引物 对对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 密闭密闭系统系统( (没有污染的风险）没有污染的风险） 快速，快速，两小时两小时内即可得到检测结果，内即可得到检测结果， 肉眼观察肉眼观察 18 18二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1 1）环介导等温扩增技术环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)临床标本临床标本（咯痰咯痰等）等）DNADNA提取提取基因扩增基因扩增基因检出基因检出标本处

10、理标本处理Extraction solution 1 and 210min ,1001min ,2000gSupernatant，capture DNAReconstitute reaction mix40min ,67LAMP amplificationPCR LAMP 需要使用需要使用PCRPCR扩增仪扩增仪 设计特异性的两条引物设计特异性的两条引物 扩增效率扩增效率:1:10 07 7 不需要使用不需要使用PCRPCR扩增仪扩增仪 多对引物保证扩增的特异性多对引物保证扩增的特异性 扩增效率扩增效率: :10101010二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（1 1）环介导等温扩增技术

11、）环介导等温扩增技术( (Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)1920 20二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（2） 线性探针检测技术线性探针检测技术（LPA）可进行结核杆菌复合群的鉴定可用于MDR-TB高危人群的筛查对利福平的抗药性(通过检测rpoB基因的最常见突变)对异烟肼的抗药性(通过检测katG基因和inhA基因的最常见突变)检测的样本可以是纯培养物或是涂片阳性的痰标本内部控制保证了结果的正确可以获得商品化的试剂盒约五小时内即可得到检测结果需要配备生物安全柜的生物安全二级实验室需要至少三间房子W

12、ho policy statement， June 200821 21二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（2） 线性探针检测技术线性探针检测技术（LPA）耐药分子诊断的基本原理耐药分子诊断的基本原理利福平利福平/ /异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点异烟肼耐药性的产生与结核分枝杆菌特定基因某些位点的突变相关。的突变相关。抗结核药抗结核药基因基因基因功能基因功能耐药百分比耐药百分比利福平利福平rpoB编码编码DNA依赖依赖RNA聚合酶，聚合酶，参与参与mRNA转录过程转录过程 90 % 90 %异烟肼异烟肼katG编码过氧化氢编码过氧化氢-过氧

13、化物酶，过氧化物酶，参与参与INH体内的转化体内的转化40 - 100 %40 - 100 %高水平耐药高水平耐药inhA编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸编码烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依赖的依赖的enoyl-ACP还原酶，参与脂酸的合成还原酶，参与脂酸的合成appr25 %appr25 %低水平耐药低水平耐药 22 22DNADNA提取提取标本标本 固体或液体培养基培养的菌种固体或液体培养基培养的菌种 抗酸染色涂片阳性标本抗酸染色涂片阳性标本方法方法 超声波裂解超声波裂解 GenoLyse试剂盒试剂盒0.50.51 1 h h23 23 PCRPCR扩增扩增不同标本不同标本, ,扩增参数不同扩增

14、参数不同 培养菌种：扩增培养菌种：扩增2020个循环个循环 涂阳标本：扩增涂阳标本：扩增3030个循环个循环引物：生物素标记引物：生物素标记多重多重PCRPCR扩增扩增2.5 2.5 3h3h24 24 杂杂 交交采用反向杂交法采用反向杂交法: :PCRPCR扩增产物扩增产物变性（变性（DNADNA成单链）成单链）与线性与线性探针杂交探针杂交洗涤洗涤显色显色判断结果判断结果1 1 2h2h25 25结果判读结果判读0.5h0.5h中盖项目线性探针检测利福平评价中盖项目线性探针检测利福平评价利福平利福平线性线性探针探针传统药敏传统药敏合计合计一致率一致率灵敏度灵敏度特异性特异性PPVNPV耐药耐

15、药敏感敏感合计合计耐药耐药1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感敏感451127172合计合HO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和通过系统评估和META分析（和分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本RIP ：敏感性：敏感性97%， 特异性特异性99%中盖项目线性探针检测异烟肼评价中盖项目线性探针检测异烟肼评价异烟肼异烟肼线性线性探针探针传统药敏传统药敏总计总计一致率一致率灵敏度灵敏度特异性特异性PPVNPV耐药耐药敏感敏感合计合计耐药耐药14930179

16、93.2%71.0%97.4%83.2% 94.8%敏感敏感6111081169合计合计21011381348WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和通过系统评估和META分析（和分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本INH：敏感性：敏感性90%， 特异性特异性99%中盖项目线性探针检测中盖项目线性探针检测MDR评价评价MDR线性线性探针探针传统传统合计合计一致率一致率灵敏度灵敏度特异性特异性PPVNPVMDR非非-MDR合计合计MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8% 96.8%非非-MD

17、R4012011241合计合计11912291348WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 2008通过系统评估和通过系统评估和META分析（和分析（和DST比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本比较）：结核分枝杆菌或涂阳的痰标本MDR-TB检测准确性：检测准确性：99%。WHO POLICY STATEMENT 27 JUNE 200829基因芯片基因芯片 基因芯片指基因芯片指采用光导原位采用光导原位合成或微量点样合成或微量点样等方法，将等方法，将核核酸片段有序地固化于支持物的酸片段有序地固化于支持物的表面表面，然后，然后与已标记的待测生与已标记的待测生物样品中靶分子杂交物样品

18、中靶分子杂交，通过特，通过特定的仪器定的仪器对杂交信号的强度对杂交信号的强度进进行快速、并行、高效地检测分行快速、并行、高效地检测分析，从而析，从而判断样品中靶分子的判断样品中靶分子的数量数量。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）GenechipGenechip( (基因芯片基因芯片) )30检测过程检测过程杂交反应杂交清洗清洗干燥扫描检测数据分析检测分析PCR扩增DNA 提取样品制备二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）GenechipGenechip( (基因芯片基因芯片) )31芯片结果图例芯片结果图例二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）Ge

19、nechipGenechip( (基因芯片基因芯片) )3233 33二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（3 3）GenechipGenechip( (基因芯片基因芯片) ) 结核耐药检测芯片获结核耐药检测芯片获北京市自主创新产品证书北京市自主创新产品证书获国家医疗器械证书和欧盟CE认证样品制备仪样品制备仪 杂交仪杂交仪n 通通 量：两个一线抗结核药量：两个一线抗结核药n 速速 度：度： 6 6 小时（比传统药敏试验法快小时（比传统药敏试验法快 50-100 50-100 倍）倍）n 灵敏度：灵敏度：10103 3 CFU/ CFU/反应反应n 特异性：对照设计严谨；自动判读特异性：对

20、照设计严谨；自动判读基于基于rpoBrpoB/ /katGkatG/ /inhAinhA的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中的基因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。结核杆菌多药耐药（利福平、异烟肼）。软件判读软件判读激光共焦扫描仪激光共焦扫描仪International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 13:914-920, 2009（IF=2.3） 是一种是一种半定量巢式实时半定量巢式实时PCRPCR的检测方法，能检测杆菌的检测方法，能检测杆菌和利福平耐药性。扩增出和利福平耐药性。扩增出ropBropB基

21、因含有基因含有81bp81bp的核心区的核心区序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序序列，探针能够区分野生型基因序列与突变型基因序列。列。 集样本准备、扩增和实时检测于一体集样本准备、扩增和实时检测于一体。 盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液。盒子中含有冻干的试剂，缓冲液和洗涤液。使用使用6 6色色激光检测装置对靶核酸进行实时检测激光检测装置对靶核酸进行实时检测。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpertGeneXpert( ( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检测技术检测技术34 标本类型：标本类型：临床痰标本，或浓缩处理后的标本临床痰标本，或浓

22、缩处理后的标本（涂阳（涂阳或涂阴培阳）或涂阴培阳），不能用于用于治疗随访的病人。，不能用于用于治疗随访的病人。 对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药可同时检测患者是否结核以及是否对利福平耐药 两小时两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单内即可得到检测结果，所用仪器设备简单 不需要生物安全柜，满足涂片试验条件的实验室不需要生物安全柜，满足涂片试验条件的实验室 二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpertGeneXpert( ( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检测技术检测

23、技术35 利福平耐药阴性预测值：利福平耐药阴性预测值： 在结核病利福平耐药流行低或高的地区，在结核病利福平耐药流行低或高的地区，NPVNPV大于大于99%.99%.即阴性结果能即阴性结果能排除排除RIPRIP耐药耐药 利福平耐药阳性预测值：利福平耐药阳性预测值： RIP RIP耐药流行耐药流行15%15%，PPVPPV90%90% RIP RIP耐药流行耐药流行5%5% 10%10%，PPVPPV：71%71%84%84% RIP RIP耐药流行耐药流行5%5%，PPVPPV：70%70%，在这种情况下，在这种情况下，RIPRIP耐药的结果需要耐药的结果需要传统的传统的DSTDST证实。证实。

24、二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpertGeneXpert( ( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检测技术检测技术36基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测基于核酸扩增的一步法利福平耐药检测Xpert TM MTB/Rif技术平台技术平台 利福平的耐药性分析 喹诺酮类药物耐药性 HIV 病毒载量分析自动化得标本处理和检测，自动化得标本处理和检测，可以在可以在2小时内出结果小时内出结果二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（4 4）GeneXpertGeneXpert( ( 多色巢式定量多色巢式定量PCR)PCR)检测技术检测技术38 38 结核分枝杆菌菌株

25、水平鉴定最早采用生化分析、血清学结核分枝杆菌菌株水平鉴定最早采用生化分析、血清学技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限技术和噬菌体分型等技术进行分析，但由于这些方法的局限性而未得到广泛应用。性而未得到广泛应用。 基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等基于核酸基础上的分子流行病学研究技术是对结核病等感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌感染性疾病进行检测的一个强有力的手段，可以进行结核菌传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感传播的研究，结核病实验室交叉污染的研究，判断结核再感染或复发以及国际间传播的研究。染或复发以及国际间传播的研究。二、二、

26、新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术39 39 简单介绍以下三种分型技术：简单介绍以下三种分型技术：（1 1）插入序列）插入序列 6110 6110 限制性片段长度多态性分析：限制性片段长度多态性分析：IS6110IS6110（2 2）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分）直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：间隔寡核苷酸分 型型( spacer oligonucleotide typing ,( spacer oligonucleotide typing ,SpoligotypingSpoligotyping) )（3 3）分枝杆菌分散重复单元）分枝杆

27、菌分散重复单元- -可变数目串联重复序列：可变数目串联重复序列： ( (mycobacterialmycobacterial interspersed repetitive units-variable interspersed repetitive units-variable number tandem repeats, MIRU-VNTR)number tandem repeats, MIRU-VNTR)二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学（5 5）分子分型技术）分子分型技术40 40插入序列插入序列 6110 6110 限制性片段长度多态性分限制性片

28、段长度多态性分析：析： IS6110 IS6110是一个是一个只存在于结核分枝杆只存在于结核分枝杆菌复合群菌复合群基因组中的插入序列，长度为基因组中的插入序列，长度为1355bp1355bp，具有高度的保守性，属于，具有高度的保守性，属于IS3IS3家家族。族。不同结核菌株不同结核菌株IS6110IS6110的数目和位置不的数目和位置不同同。在。在IS6110IS6110序列中，限制性内切酶序列中，限制性内切酶PvuIIPvuII的酶切位点只有一个，经酶切后产的酶切位点只有一个，经酶切后产生大小两个不同的片段，再与只针对酶切生大小两个不同的片段，再与只针对酶切位点右侧的位点右侧的245bp24

29、5bp探针杂交，则杂交后产探针杂交，则杂交后产生的条带数即为菌株生的条带数即为菌株IS6110IS6110拷贝数。拷贝数。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术41 41插入序列插入序列 6110 6110 限制性片段长度多态性分析：限制性片段长度多态性分析：IS6110IS6110这种方法存在一定的缺陷：这种方法存在一定的缺陷：对于基因组中对于基因组中IS6110IS6110低拷贝低拷贝66或缺陷的分辨能力有限；或缺陷的分辨能力有限；需要大量的基因组需要大量的基因组DNADNA，操作步骤繁琐且工作量大；，操作步骤繁琐且工作量大；各实验室所采用的各实验室

30、所采用的IS6110-RFLPIS6110-RFLP分型方法的标准不统一，不分型方法的标准不统一，不同实验室的同实验室的IS6110-RFLPIS6110-RFLP分型结果难于进行比对。分型结果难于进行比对。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）分子分型技术）分子分型技术42 42直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：直接重复片段及寡核苷酸多态性分型： 基于直接重复区（基于直接重复区（RDRD区）的多态性。区）的多态性。DRDR区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由区只出现于结核分枝杆菌复合群中。由若干个保守的长为若干个保守的长为36bp36bp的直接重复序列的直接重复序列组组成，并被非

31、重复序列即成，并被非重复序列即间隔区分开间隔区分开。每隔。每隔间隔区序列长为间隔区序列长为34-41bp34-41bp。通常。通常间隔区的间隔区的顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生顺序在所有菌株都是相同的，但可能发生某一间隔区的插入或缺失，某一间隔区的插入或缺失，因此利用因此利用SpoligotypingSpoligotyping就可以对结核分支杆菌进就可以对结核分支杆菌进行株水平的鉴定。行株水平的鉴定。 可以区分结核分枝杆菌复合群和可以区分结核分枝杆菌复合群和M.bovisM.bovis以及以及M.bovis BCGM.bovis BCG二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法（5 5）

32、分子分型技术）分子分型技术43 43直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：直接重复片段及寡核苷酸多态性分型：SpoligotypingSpoligotyping该方法该方法对菌株的分辨能力明显弱于对菌株的分辨能力明显弱于IS6110IS6110一一RFLPRFLP方法，特方法，特别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核别是不能有效分辨北京家族菌株，而在我国目前流行的结核菌株中，大约菌株中，大约50%50%属于北京家族属于北京家族；同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。同时与其他方法相比有高估菌株间流行病学联系的倾向。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物

33、学、分子生物学44 44可变数目串联重复序列：可变数目串联重复序列：MIRU-VNTRMIRU-VNTR 该技术是近年发展起来的以该技术是近年发展起来的以PCRPCR为基为基础的分型技术。础的分型技术。MIRUMIRU为为40-100bp40-100bp的的DNADNA元元件件，通常以串联重复形式散步于结核分，通常以串联重复形式散步于结核分枝杆菌复合群基因中。枝杆菌复合群基因中。H37RvH37Rv基因组中含基因组中含4141个个MIRUMIRU区区，其中有，其中有1212个区具有多态性个区具有多态性，其拷贝数在不同菌株之间其拷贝数在不同菌株之间1212个区拷贝数个区拷贝数在在不同菌株之间存在差异不同菌株之间存在差异。MIRUMIRU技术利技术利用不同菌株之间这用不同菌株之间这1212个区拷贝数的差异个区拷贝数的差异达到鉴定菌株的目的。达到鉴定菌株的目的。二、二、 新诊断技术和方法新诊断技术和方法3 3、分子生物学、分子生物学45 45可变数目串联重复序列：可变数目串联重复序列：MIRU-VNTRMIRU-VNTR 该方法操作简单该方法操作简单 , ,分辨率高分辨率高 , ,结果容易分析结果容易分析