第2章 实验室设备与一般技术

1、第二章第二章 实验室设备和一般技术实验室设备和一般技术组织培养实验室的面积大小和装备程度组织培养实验室的面积大小和装备程度取决于两个因素取决于两个因素： 一是所要进行的实验的性质一是所要进行的实验的性质 二是所能得到的经费的多少二是所能得到的经费的多少 标准的组织培养实验室应当具备设施 1.玻璃器皿、塑料器皿和其他实验器皿的清洗和贮存； 2.培养基的制备、灭菌和贮存； 3.植物材料的无菌操作； 4.将培养物保持在温度、光照、可能时还有湿度的可控条件下； 5.培养物的观察。 第一节第一节 实验室设计和常用设备实验室设计和常用设备第二节第二节 器皿用具器皿用具第三节第三节 培养条件培养条件 第一节

2、第一节 实验室设计和常用设备实验室设计和常用设备n一、实验室设计一、实验室设计 n洗涤室、洗涤室、准备室准备室、灭菌室、灭菌室、缓冲室缓冲室、无菌操作室无菌操作室、培培养室养室、细胞学实验室、摄影室等分室，另加驯化室、细胞学实验室、摄影室等分室，另加驯化室、温室或大棚温室或大棚。 n当规模小、条件差的情况下，全部工序也可在一间室当规模小、条件差的情况下，全部工序也可在一间室内完成。内完成。 （一）准备室（一）准备室 准备室（又称化学实验室），要求20m2左右，明 亮，通风。 任务器皿洗涤，培养基配制、分装、 高压灭菌，材料预处理，重蒸馏水的制备等。同时兼顾试管苗出瓶。需安装一个较大的水池，水泥

3、制作，白瓷砖砌内外表面，池底放一张橡胶垫，以减少玻璃 器皿的破损。下水道应畅通，以免妨碍工作。大型工 作台1-2张，大桌子1-2张。玻璃橱1-3个，用以放置药品、培养瓶和物品等。此外还应有化学药剂，仪器设备，各种器皿，烘箱、冰箱、天平、酸度计、蒸馏水发生器或纯水发生器、高压灭菌器、电炉、不锈钢 锅、培养基分注器、盆与桶等。 （二）缓冲室（二）缓冲室 为避免进出时带进杂菌，无菌室外应设置缓冲室，面积约3m2-5m2。进入无菌室前需在缓冲室里换上经过灭菌的卫生服、拖鞋，戴上口罩。最好安装1盏紫外灯，用以灭菌。墙上设衣帽钩，门边摆拖鞋或设1鞋箱。还应安装1个配电板，其上设保险丝盒、闸刀开关、插座以及

4、石英电力时控器等。石英电力时控器是自动开关灯的设备，将它和交流接触器安装在电路里就可以自动控制每天的光照时数。（三）无菌操作室（三）无菌操作室 简称无菌室或接种室，10m2-20m2，具体视生产规模和超净工作台数量而定。是组培室最关键的部分。门窗要密闭，一般用移动门窗，以减少空气的扰动。安装紫外灯空调操作台和搁架以放置组培的操作器具和灭菌后待接种的培养瓶等。其主要仪器设备有：超净工作台、空调机、医用小平车等。 （四）培养室（四）培养室 培养室是将接种到培养瓶等器皿中的植物材料进行培养的场所。其面积根据培养规模和经济条件来确定。为了满足外植体的生长和发育，培养室要具备适宜的温度、湿度、光照、通风

5、等条件。其主要设计如下：培养架子和灯光 通风设施 边台 （五）驯化室（五）驯化室 当试管苗长出一定量的不定根，根长在当试管苗长出一定量的不定根，根长在0.5cm-0.5cm-1cm1cm时，及时移栽驯化。驯化室通常是在温室的基时，及时移栽驯化。驯化室通常是在温室的基础础 上营建。驯化室要求清洁无菌，配有空调机、上营建。驯化室要求清洁无菌，配有空调机、除湿除湿 器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装器、恒温恒湿控制仪、喷雾器、光照调节装置、通置、通 风口以及必要的杀菌剂。面积大小视生产风口以及必要的杀菌剂。面积大小视生产规模定。规模定。（六）温室（六）温室 为了保证试管苗不分季节地周年地生产，必

6、须为了保证试管苗不分季节地周年地生产，必须有足够面积的温室与之配套。温室内应配有温度控有足够面积的温室与之配套。温室内应配有温度控制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置、杀菌制装置、通风口、喷雾装置、光照调节装置、杀菌杀虫工具及相应药剂。杀虫工具及相应药剂。二、常用设备 1超净工作台 2无菌箱 3空调机 4除湿机 5恒温箱 6烘箱 7高压灭菌器 8冰箱 9天平 10显微镜 11水浴锅 12摇床13转床 14蒸馏水发生器 15酸度计 16离心机 1 1超净工作台超净工作台 2 2无菌箱无菌箱 3 3空调机空调机 250C20C 4 4除湿机除湿机：湿度也要求恒定，一般保持70%- 80%，湿度过

7、高易滋长杂菌，湿度过低培养器皿 内的培养基会失水变干，从而影响外植体的正 常生长。湿度过高时，可采用小型室内除湿机 除湿，当湿度过低时，可采用喷水来增湿。5 5恒温箱恒温箱: :又称培养箱，可用于植物原生质 体和酶制剂的保温，也用于组织培养材料的保 存和暗培养。恒温箱内装上日光灯，可进行温 度和光照实验。 6 6烘箱烘箱：可以用80C-100C的温度，迅速干 燥洗净后的玻璃器皿。也可以用160C-180C的 温度，进行1h-3h的高温干燥灭菌。还可用80C 的温度烘干组织培养植物材料，以测定干物质。 7 7高压灭菌器：高压灭菌器： 是一种密闭良好又可承受高 压的金属锅，其上有显示灭菌器内压力和

8、温度 的表头。灭菌器上还有排气孔和安全阀。各种型号的高压灭菌锅各种型号的高压灭菌锅8 8冰箱冰箱 有普通冰箱、低温冰箱等。用于在常温下易变性或失效的试剂和母液的储藏，细胞组织和试验材料的冷冻保藏，以及某些材料的预处理。 9 9天平天平 包括药物天平、扭力天平、分析天平和电子天平等。大量元素、糖、琼脂等的称量可采用感量为0.1g的药物天平，微量元素、维生素、激素等的称量则应采用感量为0.0001g的分析天平。有条件的，最好配用感量为0.0001g的电子天平。百分之一天平百分之一天平千分之一天平千分之一天平万分之一天平万分之一天平1010显微镜显微镜: : 包括双目实体显微镜（解剖镜）、 生物显微

9、镜、倒置显微镜和电子显微镜。显微镜 上要求能安装或带有照相装置，以对所需材料进 行摄影记录。有：双目实体显微镜、生物显微镜 倒置显微镜。 1111水浴锅水浴锅: : 水浴锅可用于溶解难溶药品和熔化 琼脂条。 1212摇床（振荡培养机摇床（振荡培养机) ):在液体培养中为了 改善浸于液体培养基中的培养材料的通气状况， 可用摇床来振动容器。 1313转床（旋转培养机）转床（旋转培养机）: :同样用于液体培养。由 于旋转培养使植物材料交替地处于培养液和空气 中，所以氧气的供应和对营养的利用更好。体视显微镜体视显微镜普通光学显微镜普通光学显微镜倒置显微镜倒置显微镜倒置荧光显微镜倒置荧光显微镜1414蒸

10、馏水发生器蒸馏水发生器: : 制备培养基所用的重蒸馏水，是将蒸馏水再蒸馏一次，使水中不含或少含某些离子。一种是用蒸馏水重新蒸馏，另一种是用自来水连续蒸馏两次，以获得重蒸馏水。此外，还可用纯水发生器将自来水制成纯净的实验室用水，生产速率可达到4 L /h、15 L/h或40L/h（因型号而异）。这种水与“试剂级”水比较，其杂质的含量仍然太高，但却得到了质量一致的较好的实验室用水。1515酸度计酸度计 用于校正培养基和酶制剂的pH值。半导体小型酸度测定仪，既可在配制培养基时使用，又可在培养过程中测定pH值的变化。 1616离心机离心机 用于分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体。一般每分钟3

11、000-4000转即可。第二节第二节 器皿用具器皿用具一、组培器皿 （一）器皿的类型 培养器皿 分注器 离心管 刻度移液管 细菌过滤器1 1培养器皿培养器皿 （1 1）概念）概念 培养器皿培养器皿-指用于盛放培养基和接种培养材料的指用于盛放培养基和接种培养材料的器皿。要求透光度好，能耐高压灭菌。器皿。要求透光度好，能耐高压灭菌。 （2 2）类型）类型 按材料分：按材料分： 玻璃培养器皿：优点是透光度好、容易清玻璃培养器皿：优点是透光度好、容易清洗；缺点是容易破碎；洗；缺点是容易破碎； 塑料培养器皿：优点是不容易破碎、成本塑料培养器皿：优点是不容易破碎、成本较低，但缺点是透光度较玻璃的差、遇火较

12、低，但缺点是透光度较玻璃的差、遇火焰易被焰易被熔化。按形状分按形状分试管特别适合于用少量培养基及试验各种不同配方时选用，在茎尖培养及花药和单子叶植物分化长苗培养时更显方便。有圆底的和平底的两种。 三角瓶是植物组织培养中最常用的培养器皿，适合于各种培养，固体或液体、大规模或小规模都行。 其优点是：采光好、瓶口较小不易失水和污染。 L形管和T形管为专用的旋转式液体培养试管。 培养皿适于作单细胞的固体平板培养、胚和花药培养和无菌发芽。 角形培养瓶和圆形培养瓶适于液体培养用。 果酱瓶常用于试管苗大量繁殖，200ml-500ml规格2分注器 作用作用-分装培养基。分装培养基。 分注器可以把配置好的培养基

13、按一分注器可以把配置好的培养基按一定量注入到培养器皿中。一般由定量注入到培养器皿中。一般由4cm-6cm4cm-6cm的大型滴管、漏斗、橡皮管的大型滴管、漏斗、橡皮管及铁夹组成。还有量筒式的分注器，及铁夹组成。还有量筒式的分注器，上有刻度，便于控制。微量分注还上有刻度，便于控制。微量分注还可采用注射器。可采用注射器。3离心管 离心管用于离心，将培养离心管用于离心，将培养的细胞或制备的原生质体从的细胞或制备的原生质体从培养基中分离出来，并进行培养基中分离出来，并进行收集。收集。 4刻度移液管刻度移液管 在配制培养基时，生长调节物质和微量元素等溶液，用量很少，只有用相应刻度的移液管才能准确量取。同

14、时，不同种类的生长调节物质，不能混淆，这就要求专管专用。常用的移液管容量有0.1ml、0.2ml、0.5ml、2ml 、5ml、10ml等。 移液器移液器 培养基中有些生长调节物质以及有机附加物质如吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA）等，在高温条件下易被分解破坏，而用细菌过滤器（图17）既可除菌又可保持试剂的功效。可用金属制的蔡式漏斗，以石棉滤膜来除去细菌。在过滤少量的液体时，宜用醋酸纤维素和硝酸纤维素混合物制成的微孔滤膜，其孔径为0.45m。在过滤时需要一套减压吸滤设备（通常使用真空泵），漏斗下接吸滤瓶，吸嘴处接上一只内装脱脂棉的滤气玻璃管。5细菌过滤器细菌过滤器图17 细菌过滤器灭菌装置 （

15、二）器皿的清洗（二）器皿的清洗 植物组织培养除了要对待培养的实验材料 和接种用具进行严格消毒外，各种培养器皿也 要求洗涤清洁，以防止带入一些有毒的或影响 培养效果的化学物质或一些微生物等，对那些 常用的玻璃器皿的清洁程度要求更为严格。 1 1洗涤剂洗涤剂清洗玻璃器皿用的洗涤剂主要有肥皂、洗洁精、洗衣粉和铬酸洗涤液（由重铬酸钾和浓硫酸混合而成）。配制铬酸洗涤液的注意事项：配制铬酸洗涤液的注意事项：（1）在配制时重铬酸钾一定要冷却后才能加浓硫酸，且只能把浓硫酸缓慢加入重铬酸钾溶液中，决不能将重铬酸钾溶液或蒸馏水倒入浓硫酸中。（2）由于铬酸洗涤液具有极强的氧化能力和腐蚀作用，故不要用手直接接触洗涤液

16、。 2洗涤方法洗涤方法 使用前先用1%稀盐酸浸泡1 夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后用蒸馏水冲淋1遍，干后备用。 已用过的玻璃器皿洗涤方法：已用过的玻璃器皿洗涤方法：去残渣水洗热肥皂水（或洗洁精）水洗蒸馏水冲洗1次。 较脏的玻璃器皿的洗涤：较脏的玻璃器皿的洗涤：洗衣粉或洗洁精刷洗几次并冲净浸入洗涤液中流水中冲洗蒸馏水冲洗。 已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿的洗涤：已被霉菌等杂菌污染的玻璃器皿的洗涤： 121高温高压蒸汽灭菌30min趁热倒去残 渣清水中冲洗浸泡在浓的重铬酸钾洗 涤液中2h后取出水洗数次蒸馏水 冲淋1次。 用过的吸管和滴管的清洗：用过的吸管和滴管的清洗：洗涤液中浸泡 2h以上取出

17、在流水中冲洗半小时蒸馏 水冲淋1次。 用过的载玻片和盖玻片的清洗用过的载玻片和盖玻片的清洗: : 洗涤液中浸泡数小时水洗绸布擦干放在95%的洒精中备用。 总之，要求洗净的玻璃器皿应透明发亮，内外壁水膜均匀，不持水珠。二、器械用具二、器械用具 组织培养所需要的器械用具，可选用医疗器械和微生物实验所用的器具。常用的器械用具如图18所示。 镊子镊子 尖头镊子，适用于取植物组织和分离茎尖、叶片表皮等。长20 cm-25cm的枪形镊子，可用于接种和转移植物材料。 剪刀剪刀 常用的有解剖剪和弯头剪，一般在转移植株时用。 1.1. 解剖刀解剖刀 常用的解剖刀，有长柄和短柄两种。刀片也有双面及单面之分，可以经

18、常更换。对大型材料如块茎、块根等就需用大型解剖刀。4.显微接种工具显微接种工具 包括接种针、接种钩及接种铲，由白金丝或镍丝制成，用来接种花药或转移植物组织。 5.钻孔器钻孔器 取肉质茎、块茎、镜肉质根内部的组织时使用。钻孔器一般做成T形，口径有各种规格 6.6.其它其它 燃烧工具用的酒精灯、用于熔解培养基的带有磁搅拌器的电炉、用于加速熔解琼脂培养基的微波烘箱、用于贮备无离子水和重蒸馏水的大型塑料桶、试管架以及转移培养瓶、试管架的搪瓷盘或塑料框等。18 18 植物组织培养中常用的器械植物组织培养中常用的器械 1镊子 2剪刀 3解剖刀 4接种针和接种钩 第三节第三节 培养条件培养条件 在植物组织培

19、养中温度、光照、湿度等各种环境条件，培养基组成、pH值、渗透压等各种化学环境条件都会影响组织培养育苗的生长和发育。 3.13.1温度温度 因为温度是植物组织培养中的重要因素，所以植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养 都是在2327、之间进行，一般采用25土2。低于15时培养，植物组织会表现生长停止，高于35时对植物生长不利。 不同培养目标采用的培养温度也不同 。3.23.2光照光照 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面 3.2.13.2.1光照强度光照强度 光照强度对培养细胞的增殖和器官的分化有重要影响，从目前的研究情况看，光

20、照强度对外植体、细胞的最初分裂有明显的影响。一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长。 3.2.23.2.2光质光质 光质对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。 如百合珠芽在红光下培养，8周后，分化出愈伤组织。但在蓝光下培养，几周后才出现愈伤组织， 而唐菖蒲子球块接种15d后，在蓝光下培养首先出现芽，形成的幼苗生长旺盛，而白光下幼苗纤细。 3.2.33.2.3光周期光周期 试管苗培养时要选用一定的光周期来进行组织培养，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 研究表明，对短日照敏感的品种的器官组织，在短日照下易分化，而在长日照下产生愈伤组织，有时

21、需要暗培养，尤其是一些植物的愈伤组织在暗下比在光下更好。如红花、乌饭树的愈伤组织。 3.33.3湿度湿度 包括:培养容器湿度 环境的湿度条件，容器内主要受培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受阻，也会导致植物生长发育受影响。 环境的相对湿度可以影响培养基的水分蒸发，一般要求70-80的相对湿度，常用加湿器或经常洒水的方法来调节湿度。湿度湿度过低：过低：会使培养基丧失大量水分，导致培养基各种成分浓度的改变和渗透压的升高，进而影响组织培养的正常进行。 湿度过高时：湿度过高时：易引起棉塞长霉，造成污染。 合适的环境湿度合适的环境湿度3.4 3.4 渗透压渗透压 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。 通常12个大气压对植物生长有促进作用， 2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用， 56个大气压植物生长就会完全停止， 6个大气压植物细胞就不能生存。 3.5 pH3.5 pH值值 不同的植物对培养基