分子生物学第11.5章原核基因转录水平的调控

1、11.5.1 原原核生物基因的表达调控核生物基因的表达调控11.5.2 原核生物基因启动子的一般结构原核生物基因启动子的一般结构11.5.3 原核生物基因的转录过程原核生物基因的转录过程11.5.4 乳糖操纵子表达的调控机制乳糖操纵子表达的调控机制11.5.5 色氨酸操纵子表达的调控机制色氨酸操纵子表达的调控机制 11.511.5 原核基因转录水平的调控组成型表达和调节型表达 在细胞中，有些基因产物的量是比较恒定的，在细胞中，有些基因产物的量是比较恒定的，它们是细胞维持代谢必需的物质，如糖酵解途径它们是细胞维持代谢必需的物质，如糖酵解途径中的酶及组成核糖体的蛋白质，这类基因的表达中的酶及组成核

2、糖体的蛋白质，这类基因的表达称为组成型表达（称为组成型表达（constitutive expression）；有）；有些基因产物的量在不同的情况下变化很大，需要些基因产物的量在不同的情况下变化很大，需要这类产物时基因表达，不需要时基因关闭，这类这类产物时基因表达，不需要时基因关闭，这类基因的表达称为调节型表达（基因的表达称为调节型表达（regulated expression）。）。真核与原核细胞转录与翻译调控特点的比较转录水平上的调节方式 代谢产物对基因表达的调节代谢产物对基因表达的调节 衰减子对基因表达的调节衰减子对基因表达的调节 降解物对基因表达的调节降解物对基因表达的调节 细菌的应急反

3、应细菌的应急反应 1.1.代谢产物对基因表达的调节 在降解代谢途径中，起始端的酶的底在降解代谢途径中，起始端的酶的底物浓度往往决定是否合成这一途径中后续物浓度往往决定是否合成这一途径中后续的各种酶（诱导）；而在合成代谢中，最的各种酶（诱导）；而在合成代谢中，最终产物往往是调节物质（阻遏）。这些调终产物往往是调节物质（阻遏）。这些调节物质必须与反式作用因子结合才能起到节物质必须与反式作用因子结合才能起到调节基因表达的作用。调节基因表达的作用。 2.2.衰减子对基因表达的调节 在这种调节方式中，起信号作用的是特定氨在这种调节方式中，起信号作用的是特定氨酰酰tRNA的浓度，如对色氨酸操纵子来说，高的

4、浓度，如对色氨酸操纵子来说，高浓度的色氨酰浓度的色氨酰tRNA抑制色氨酸操纵子的表达。抑制色氨酸操纵子的表达。具有这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵具有这种调节方式的有大肠杆菌中的色氨酸操纵子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸子、苯丙氨酸操纵子、苏氨酸操纵子、异亮氨酸操纵子和缬氨酸操纵子，以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和缬氨酸操纵子，以及沙门氏菌的组氨酸操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等。操纵子和亮氨酸操纵子、嘧啶合成操纵子等。3.3.降解物对基因表达的调节 在有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培在有葡萄糖存在的情况下，即使在细菌培养基中加入乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖养基中加入乳糖

5、、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等诱导物，与其对应的操纵子也不会启动，这等诱导物，与其对应的操纵子也不会启动，这种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。种现象称为葡萄糖效应或称为降解物抑制作用。这时，细菌所需的能量可以从葡萄糖得到满足，这时，细菌所需的能量可以从葡萄糖得到满足，而无须启动一些不常用的基因去利用这些稀有而无须启动一些不常用的基因去利用这些稀有的糖类。的糖类。降解物对基因表达的调节 其机制是葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸其机制是葡萄糖的存在会抑制细菌的腺苷酸环化酶，减少环化酶，减少cAMP的合成，的合成，cAMP受体蛋白因受体蛋白因不能与不能与cAMP结合而不能形成复合物。这种复合结合

6、而不能形成复合物。这种复合物是一个正调节物质，它可与操纵子上的启动子物是一个正调节物质，它可与操纵子上的启动子区结合，促进基因转录的启动。若培养基中缺乏区结合，促进基因转录的启动。若培养基中缺乏葡萄糖，而有其它种类的糖，相应的操纵子就会葡萄糖，而有其它种类的糖，相应的操纵子就会启动。启动。4.4.细菌的应急反应 上述上述3个方面是细菌处于正常生活条件下的基个方面是细菌处于正常生活条件下的基因表达调节方式，这种正常也包括生活环境中缺因表达调节方式，这种正常也包括生活环境中缺少某一种或两种物质，但能找到代用物。可是，少某一种或两种物质，但能找到代用物。可是，细菌有时会遇到十分恶劣的环境，比如氨基酸

7、饥细菌有时会遇到十分恶劣的环境，比如氨基酸饥饿时，就不是缺少一两种氨基酸，而是氨基酸全饿时，就不是缺少一两种氨基酸，而是氨基酸全面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌会产生面匮乏。为了紧缩开支，渡过难关，细菌会产生应急反应，包括合成各种应急反应，包括合成各种RNA、糖、脂肪和蛋白、糖、脂肪和蛋白质在内的几乎全部生化反应过程均被停止。质在内的几乎全部生化反应过程均被停止。细菌的应急反应 当当氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸饥饿时，细胞中便存在大量的不带氨基酸的氨基酸的tRNA，这种空载，这种空载tRNA会激活焦磷酸转会激活焦磷酸转移酶，使移酶，使ppGpp大量合成，其浓度可增加大量合成，

8、其浓度可增加10倍以倍以上，上，ppGpp的出现会关闭许多基因，当然也会打的出现会关闭许多基因，当然也会打开一些合成氨基酸的基因。开一些合成氨基酸的基因。ppGpp的作用原理还的作用原理还不清楚，它不只影响一个或几个操纵子，而是影不清楚，它不只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批操纵子，所以响一大批操纵子，所以它是超级调控因子。它是超级调控因子。原核基因启动子的一般结构 原原核生物基因的启动子有两个保守的区域，一核生物基因的启动子有两个保守的区域，一个位于个位于10处，称为处，称为Pribnow box，另一个位于，另一个位于35处，称为处，称为Sextama box。它们的保守性为。它们的保

9、守性为Sextama box Pribnow box T82T84G78A65C54A45 T80A95T45A60A50T96 通过缺失分析发现，强启动子通过缺失分析发现，强启动子Pribnow box和和Sextama box之间的间隔为之间的间隔为171bp，增大或减小这，增大或减小这个间距能明显影响启动子的强度。个间距能明显影响启动子的强度。几种原核基因的启动子原核生物的RNA聚合酶 原核细胞中只有一种原核细胞中只有一种RNA聚合酶，它催聚合酶，它催化所有种类化所有种类RNA的合成。真核细胞中有三种的合成。真核细胞中有三种RNA聚合酶，分别称为聚合酶，分别称为RNA聚合酶聚合酶、，它们

10、催化合成的，它们催化合成的RNA种类不同。种类不同。 大肠杆菌RNA聚合酶 大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶通常认为由聚合酶通常认为由5个亚基组个亚基组成，即成，即2、及及，这，这5个亚基组成的酶叫全个亚基组成的酶叫全酶，而只由酶，而只由2、4个亚基组成的酶叫做核个亚基组成的酶叫做核心酶。此外，还可以看到一个相对分子量在心酶。此外，还可以看到一个相对分子量在10000左右的左右的亚基，其功能尚不清楚；后来又亚基，其功能尚不清楚；后来又发现一个分子量为发现一个分子量为69000的酸性蛋白，称为的酸性蛋白，称为NusA蛋白，现在又称为转录延伸因子，其功能可能与蛋白，现在又称为转录延伸因子，其功能可能与

11、RNA转录的延伸和终止有关。转录的延伸和终止有关。 大肠杆菌RNA聚合酶各亚基的功能 亚基的主要功能是识别启动子；亚基的主要功能是识别启动子；亚基亚基的主要功能是参与和启动子的结合、的主要功能是参与和启动子的结合、DNA双双链的解链和恢复双螺旋；链的解链和恢复双螺旋；亚基可能参与底物亚基可能参与底物的结合及的结合及RNA合成时磷酸二酯键的形成；合成时磷酸二酯键的形成；亚基的碱性最强，可能起到与亚基的碱性最强，可能起到与DNA模板模板结合的作用。结合的作用。 RNA的转录过程 原核原核RNA聚合酶通过聚合酶通过亚基发现启动子亚基发现启动子35区识别位点后，首先与区识别位点后，首先与35区序列结合

12、成区序列结合成一个封闭的启动子复合体，几乎与此同时，一个封闭的启动子复合体，几乎与此同时，全酶向全酶向10序列转移并与之紧密结合，使序列转移并与之紧密结合，使10区及转录起始区发生局部解链而形成开放区及转录起始区发生局部解链而形成开放型复合体。型复合体。转录起始转录起始RNA的转录过程 在开放型复合体中，在开放型复合体中，RNA聚合酶上的起始聚合酶上的起始位点和延伸位点分别被两个相应的核苷三磷酸位点和延伸位点分别被两个相应的核苷三磷酸按碱基配对原则占据（起始位点只允许嘌呤核按碱基配对原则占据（起始位点只允许嘌呤核苷三磷酸进入），在苷三磷酸进入），在亚基催化下形成第一个磷亚基催化下形成第一个磷酸

13、二酯键，这样就形成了一个酸二酯键，这样就形成了一个RNA聚合酶聚合酶DNA新生新生RNA的三元复合体。三元复合体一的三元复合体。三元复合体一旦形成，旦形成，亚基就从全酶上解离下来，此时转录亚基就从全酶上解离下来，此时转录起始完成，进入延伸阶段。起始完成，进入延伸阶段。 转录起始转录起始转录起始过程RNA的转录过程RNA合成的速度大约每秒合成的速度大约每秒3050个核苷酸。个核苷酸。转录延伸转录延伸RNA的转录过程 原核基因转录的终止机制比较清楚。以大肠原核基因转录的终止机制比较清楚。以大肠杆菌为例，转录的终止需要一个信号，这个信号杆菌为例，转录的终止需要一个信号，这个信号就是一个叫做转录终止区

14、或终止子（就是一个叫做转录终止区或终止子（terminator）的的DNA序列。终止子序列存在于已被序列。终止子序列存在于已被RNA聚合酶聚合酶转录过的序列中。转录过的序列中。 转录终止转录终止终止子的类型 已知有两类终止子：一类是不依赖蛋白已知有两类终止子：一类是不依赖蛋白辅助因子而能实现转录终止的终止子，叫做辅助因子而能实现转录终止的终止子，叫做-非依赖性终止子；另一类是依赖蛋白辅助非依赖性终止子；另一类是依赖蛋白辅助因子因子才能实现转录终止的终止子，叫做才能实现转录终止的终止子，叫做-依赖性终止子。依赖性终止子。-非依赖性终止子-非依赖性终止机制 -非依赖性终止子不是在非依赖性终止子不是

15、在DNA水平上终止转水平上终止转录的，而是在已转录产生的录的，而是在已转录产生的RNA水平上发生作用水平上发生作用的。终止子序列从的。终止子序列从DNA模板上转录后，在新生模板上转录后，在新生RNA链中产生发卡结构，在发卡结构后面跟着大链中产生发卡结构，在发卡结构后面跟着大约由约由6个个U组成的序列。这两种结构都为转录终止组成的序列。这两种结构都为转录终止所必需。如果在发卡区产生突变，破坏其发卡结所必需。如果在发卡区产生突变，破坏其发卡结构，会妨碍转录终止。构，会妨碍转录终止。RNA聚合酶在发卡处通过聚合酶在发卡处通过相互作用使相互作用使RNA转录停滞，而一连串的转录停滞，而一连串的U提供了提

16、供了使使RNA聚合酶从模板上解离下来的信号而使转录聚合酶从模板上解离下来的信号而使转录终止。终止。 -依赖性终止子 在在-依赖性终止子中，转录终止点前也有依赖性终止子中，转录终止点前也有发卡结构，但发卡结构中发卡结构，但发卡结构中GC对含量较少，发卡对含量较少，发卡结构的下游序列没有固定的特征，其结构的下游序列没有固定的特征，其AT对含量对含量比比-非依赖性转录终止子低。非依赖性转录终止子低。-因子利用其因子利用其NTP酶活性产生的能量，结合到酶活性产生的能量，结合到RNA链上，然链上，然后沿着后沿着RNA链滑向链滑向RNA聚合酶，当聚合酶，当RNA聚合酶聚合酶在发卡结构处停滞时，在发卡结构处

17、停滞时，-因子与因子与RNA聚合酶相聚合酶相互作用而终止转录。互作用而终止转录。 依赖性终止机制RNA聚合酶正在转录聚合酶正在转录因子附着到因子附着到RNA的的识别位点上识别位点上因子沿因子沿RNA移动，移动，追赶追赶RNA聚合酶聚合酶在终止子处，在终止子处，因子与因子与RNA聚合酶相互作用聚合酶相互作用在转录泡处，在转录泡处，因子使因子使DNA-RNA杂交双链解旋杂交双链解旋转录终止转录终止终止子的终止效率 -非依赖性转录终止在有非依赖性转录终止在有-因子参与时，终止效因子参与时，终止效率提高；终止子序列发卡结构中率提高；终止子序列发卡结构中GC含量高时，终止含量高时，终止效率高。效率高。

18、The sequences required for rho-dependent termination (sometimes called rut sites) are 50-90 bases long and lie upstream of the actual termination site. Their common feature is that the RNA is rich in C residues and poor in G residues. C is by far the most common base (41%) and G is the least common

19、base (14%). As a general rule the efficiency of a rut site increases with the length of the C-rich/G-poor region.Rut 位点的序列特征A rut site has a sequence rich in C and poor in G preceding the actual site(s) of termination.The sequence correspodns to the 3 end of the RNA.乳糖操纵子 乳糖操纵子控制乳糖操纵子控制3个酶的表达。即个酶的表达

20、。即lac Z、lac Y、lac A，它们分别编码，它们分别编码半乳糖苷酶、半乳糖苷酶、半乳糖苷透半乳糖苷透过酶和过酶和半乳糖苷乙酰基转移酶。由于多顺反子半乳糖苷乙酰基转移酶。由于多顺反子mRNA中各基因翻译效率的不同，中各基因翻译效率的不同，-半乳糖苷酶：半乳糖苷酶：半乳糖苷透过酶：半乳糖苷透过酶：半乳糖苷乙酰基转移酶合成的比半乳糖苷乙酰基转移酶合成的比例为例为1：0.5：0.2。 大肠杆菌如果以乳糖为唯一碳源和能源的话，前两大肠杆菌如果以乳糖为唯一碳源和能源的话，前两种酶是必需的。种酶是必需的。 lac operonlac A 的可能作用No defect is identifiable

21、 in lacA- cells, which is puzzling. It is possible that the acetylation reaction gives an advantage when the bacteria grow in the presence of certain analogs of b-galactosides that cannot be metabolized, because the modification results in detoxification and excretion.乳糖操纵子的表达调控 在不含乳糖及在不含乳糖及半乳糖苷的培养基

22、中，半乳糖苷的培养基中，lac+基因型大肠杆菌细胞内基因型大肠杆菌细胞内半乳糖苷酶和透过酶的半乳糖苷酶和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有浓度很低，每个细胞内大约只有12个酶分子，这个酶分子，这称为本底表达。但是，如果在无葡萄糖的培养基中称为本底表达。但是，如果在无葡萄糖的培养基中加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的加入乳糖，酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的67%，每个细胞中可有超过，每个细胞中可有超过105个酶分子。个酶分子。 乳糖操纵子的表达调控半衰期长半衰期长半衰期长半衰期长乳糖操纵子的人工诱导物和底物 实际研究中，很少使用乳糖作为诱导剂，因实际研究中，很少使用乳糖作为诱导剂，因为培

23、养基中的乳糖会被诱导产生的为培养基中的乳糖会被诱导产生的半乳糖苷半乳糖苷酶降解，使乳糖的浓度不断下降。实验室里常常酶降解，使乳糖的浓度不断下降。实验室里常常使用两种含硫的乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷使用两种含硫的乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）或甲基硫代半乳糖苷（）或甲基硫代半乳糖苷（TMG）作为诱）作为诱导剂。在酶活性分析中常用导剂。在酶活性分析中常用O硝基苯半乳糖苷硝基苯半乳糖苷（ONPG）作为生色底物。）作为生色底物。 乳糖操纵子的人工诱导物和活性测定底物 诱导物诱导物 诱导物诱导物 生色底物生色底物O-硝基苯半乳糖苷硝基苯半乳糖苷(ONPG)乳糖操纵子的发现 1940年，年，J

24、acques Monod 等开始研究大肠杆菌中等开始研究大肠杆菌中乳糖代谢的可诱导性。他们发现乳糖或其他半乳糖苷乳糖代谢的可诱导性。他们发现乳糖或其他半乳糖苷能够诱导能够诱导半乳糖苷酶半乳糖苷酶（galactosidase）的表达。）的表达。可是，有些突变体能够被诱导出可是，有些突变体能够被诱导出半乳糖苷酶，但仍半乳糖苷酶，但仍不能在仅含乳糖的培养基中生长。他们将放射性标记不能在仅含乳糖的培养基中生长。他们将放射性标记的半乳糖苷加到野生型和突变型的大肠杆菌中，并分的半乳糖苷加到野生型和突变型的大肠杆菌中，并分别进行诱导和非诱导，发现在诱导条件下，野生型可别进行诱导和非诱导，发现在诱导条件下，野

25、生型可以吸收半乳糖苷，而突变型（以吸收半乳糖苷，而突变型（Y）不能吸收半乳糖苷。）不能吸收半乳糖苷。Effect of Cryptic Mutant （lzcY）on Accumulation of GalactosideGenotypeInducerAccumulation of GalactosideZ+Y+Z+Y+Z+YZ+Y对突变体的生物化学研究 Monod认为有一种物质负责将半乳糖苷运入细认为有一种物质负责将半乳糖苷运入细胞，胞，Y突变型产生这种物质的基因有缺陷。他将这突变型产生这种物质的基因有缺陷。他将这种物质命名为种物质命名为半乳糖苷透过酶半乳糖苷透过酶（galactoside

26、permease）。在纯化半乳糖苷透过酶时，）。在纯化半乳糖苷透过酶时，Monod等等又发现了又发现了半乳糖苷转乙酰基酶半乳糖苷转乙酰基酶（galactoside transacetylase） 到上世纪到上世纪50年代末期，年代末期，Monod 发现这三种酶被发现这三种酶被半乳糖苷同时诱导出来，因此至少有三个基因被同半乳糖苷同时诱导出来，因此至少有三个基因被同时诱导表达。时诱导表达。 他还发现了一些突变体，这些突变体不需要诱他还发现了一些突变体，这些突变体不需要诱导就能持续表达这三种酶。这些突变体称为组成型导就能持续表达这三种酶。这些突变体称为组成型突变体（突变体（constitutive

27、mutants）。）。对突变体的遗传学研究 Monod认识到，遗传学分析可以大大促进研究的认识到，遗传学分析可以大大促进研究的进展，于是他请同在巴斯德研究所的进展，于是他请同在巴斯德研究所的Francois Jacob参参加到他的团队中。加到他的团队中。 在在Arthur Pardee的协助下，的协助下，Jacob和和Monod制作了制作了大肠杆菌部分二倍体（大肠杆菌部分二倍体（merodiploids），这些部分二倍），这些部分二倍体携带了野生型基因（可诱导的）和组成型突变体的体携带了野生型基因（可诱导的）和组成型突变体的等位基因。实验表明野生型基因是显性的等位基因。实验表明野生型基因是显性

28、的( (即组成型突即组成型突变基因也不表达变基因也不表达) )，说明野生型细胞可以产生一种物质，说明野生型细胞可以产生一种物质，它使得基因关闭，除非被诱导。这种物质被称为阻遏它使得基因关闭，除非被诱导。这种物质被称为阻遏蛋白（蛋白（repressor），组成型突变体不能产生这种阻遏），组成型突变体不能产生这种阻遏蛋白，野生型基因产生的阻遏蛋白可以抑制组成型突蛋白，野生型基因产生的阻遏蛋白可以抑制组成型突变基因的表达。这些组成型突变体记为变基因的表达。这些组成型突变体记为lacI 。Mutant repressor gene（I）No lac products in absence of lac

29、toseNo lac products in absence of lactoseBoth lac operons repressible；mutation is recessive.（In merodiploid cells）对突变体的遗传学研究 阻遏蛋白要发挥作用，应该结合到阻遏蛋白要发挥作用，应该结合到DNA的特殊序列的特殊序列上，上，Jacob和和Monod将这种特殊序列称为操纵区将这种特殊序列称为操纵区（operator）。可以想象，即使有阻遏蛋白，操纵区突）。可以想象，即使有阻遏蛋白，操纵区突变，阻遏蛋白无法与操纵区结合，也会使得三种酶组成变，阻遏蛋白无法与操纵区结合，也会使得三种

30、酶组成型表达。型表达。 区分这两种突变的方法是：在部分二倍体细胞中，区分这两种突变的方法是：在部分二倍体细胞中，如果是阻遏蛋白基因突变（如果是阻遏蛋白基因突变（I ），不产生阻遏蛋白，表），不产生阻遏蛋白，表型是隐性的（型是隐性的（recessive）；如果是操纵区突变（）；如果是操纵区突变（Oc），），突变基因成为组成型表达，表型是显性的，这种显性称突变基因成为组成型表达，表型是显性的，这种显性称为顺式显性（为顺式显性（cis-dominant），而野生型基因仍须诱导），而野生型基因仍须诱导才能表达。才能表达。Mutant operator（O c）No lac products in ab

31、sence of lactoselac products in absence of lactoseOne lac operon nonrepressible；mutation is cis-dominant.（In merodiploid cells）对突变体的遗传学研究 有一种阻遏蛋白突变，突变的阻遏蛋白不能与有一种阻遏蛋白突变，突变的阻遏蛋白不能与诱导物结合，因此结构基因经诱导也不能表达。这诱导物结合，因此结构基因经诱导也不能表达。这种突变称为种突变称为I s，这种突变是顺反都显性的，这种突变是顺反都显性的。No lac products in presence or absence o

32、f lactoseNo lac products in presence or absence of lactose Both lac operons uninducible；mutation is cis- and trans-dominant.对突变体的遗传学研究 还有一种阻遏蛋白突变，突变的阻遏蛋白不能还有一种阻遏蛋白突变，突变的阻遏蛋白不能与操纵区结合，结构基因组成型表达，这种突变称与操纵区结合，结构基因组成型表达，这种突变称为为I Id d，这种突变叫显性阴性（，这种突变叫显性阴性（dominant negative）。）。lac products in absence of lac

33、toselac products in absence of lactose Both operons nonrepressible；mutation is dominant negative.乳糖操纵子概念的提出 通过熟练的遗传学分析，通过熟练的遗传学分析，Jacob和和Monod提出提出了操纵子的概念。他们预言有两个关键的控制元了操纵子的概念。他们预言有两个关键的控制元件存在：阻遏蛋白基因和操纵区。缺失突变揭示件存在：阻遏蛋白基因和操纵区。缺失突变揭示了第三个元件了第三个元件启动子，它对三个结构基因的启动子，它对三个结构基因的表达是必需的。他们得出结论，三个结构基因是表达是必需的。他们得出

34、结论，三个结构基因是成簇排列，并处于一个控制单位的控制之下，即成簇排列，并处于一个控制单位的控制之下，即乳糖操纵子。随后的生化研究证实了他们完美的乳糖操纵子。随后的生化研究证实了他们完美的假说。假说。lac repressor的纯化 20世纪世纪60年代，年代，Gilbert和和Muller-Hill成功地成功地部分纯化了部分纯化了lac阻遏蛋白。开始时采用标记的阻遏蛋白。开始时采用标记的IPTG与阻遏蛋白结合的方法来检测阻遏蛋白，但因与阻遏蛋白结合的方法来检测阻遏蛋白，但因Lac阻遏蛋白含量非常低，无法检测到。后来从一个阻遏蛋白含量非常低，无法检测到。后来从一个突变体突变体lacI t中纯化

35、出了阻遏蛋白，这种阻遏蛋白中纯化出了阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与与IPTG结合非常紧密，这样就能从粗提物中检测结合非常紧密，这样就能从粗提物中检测到阻遏蛋白。到阻遏蛋白。lac repressor与operator的结合 Cohn和他的同事用纯化的阻遏蛋白进行与和他的同事用纯化的阻遏蛋白进行与operator的结合实验。他们将含有的结合实验。他们将含有lac operator的标的标记记DNA片段加到固定有不同量的片段加到固定有不同量的repressor的硝酸的硝酸纤维素滤膜上，然后测定滤膜上结合的纤维素滤膜上，然后测定滤膜上结合的DNA的量，的量，并在加和不加并在加和不加IPTG两种情况下实验，

36、得到如下结两种情况下实验，得到如下结果：果： Assaying the binding between lac operator and lac repressor不加不加IPTG加加IPTGThe Oc lac operator binds repressor with lower affinity than does the wild-type operator含正常含正常 operator 的的DNA片段片段含含Oc 突变突变 operator 的的DNA片段片段80 DNA片段（对照）片段（对照）Pastan等的实验 早在早在1971年，年，Pastan及其同事就通过实验证明：及其同事

37、就通过实验证明：即使即使repressor存在，存在，RNA聚合酶也能够紧密地结合聚合酶也能够紧密地结合到到promoter上。他们的实验是：在上。他们的实验是：在repressor存在下，存在下，将含有将含有operator的的DNA片段与片段与RNA聚合酶保温，然聚合酶保温，然后同时加入诱导剂后同时加入诱导剂IPTG和利福平。利福平能够抑制和利福平。利福平能够抑制转录，除非已经形成了开放的启动子复合物。结果转录，除非已经形成了开放的启动子复合物。结果转录发生了，说明转录发生了，说明repressor没有阻止开放启动子复没有阻止开放启动子复合物的形成。即使有了这个实验结果，人们还是合物的形成

38、。即使有了这个实验结果，人们还是认认为为repressor与与operator的结合阻碍了的结合阻碍了RNA聚合酶与启聚合酶与启动子结合，从而抑制转录。动子结合，从而抑制转录。转录起始开放复合物的形成Straney和Crothers的实验 1987年，年，Straney和和Crothers用实验强化了这用实验强化了这个观点：个观点：RNA聚合酶和阻遏蛋白可以同时结合到聚合酶和阻遏蛋白可以同时结合到lac启动子上。他们提出，尽管阻遏蛋白不影响启动子上。他们提出，尽管阻遏蛋白不影响RNA聚合酶与启动子的结合，但阻止开放复合物聚合酶与启动子的结合，但阻止开放复合物的形成。的形成。 这个观点与这个观点

39、与Pastan等人的实验结果不符。等人的实验结果不符。Krummel和Chamberlin的观点 Krummel 和和Chamberlin提出另外一种解释：提出另外一种解释：阻遏蛋白阻止从起始转录复合物状态转变成延伸阻遏蛋白阻止从起始转录复合物状态转变成延伸状态。换句话说，阻遏蛋白可以合成短的状态。换句话说，阻遏蛋白可以合成短的RNA，但不能继续合成但不能继续合成RNA。Lee和Goldfarb的实验 Lee和和Goldfarb提出了实验证据支持了提出了实验证据支持了Krummel和和Chamberlin的观点。他们用的观点。他们用run-off转录分析法证转录分析法证明，即使在阻遏蛋白存在下

40、，明，即使在阻遏蛋白存在下，RNA聚合酶也已经与聚合酶也已经与DNA模板发生了相互作用。实验方法如下：模板发生了相互作用。实验方法如下： 将将阻遏蛋白阻遏蛋白与含有与含有lac控制区域及控制区域及lacZ N端部分序端部分序列的列的123bp的的DNA片段片段保温保温10分钟，使阻遏蛋白与分钟，使阻遏蛋白与operator结合，然后加入结合，然后加入RNA聚合酶聚合酶，再加入，再加入肝素肝素及及RNA聚合酶反应所需的聚合酶反应所需的其他全部成分（除其他全部成分（除CTP外）外）。肝素结合到游离的或与肝素结合到游离的或与DNA松散结合的松散结合的RNA聚合酶聚合酶上，阻止这些上，阻止这些RNA聚

41、合酶与聚合酶与DNA紧密结合，但并不紧密结合，但并不影响已经与影响已经与DNA紧密结合的紧密结合的RNA聚合酶。最后加入聚合酶。最后加入标记的标记的CTP，同时，同时加加和和不加不加IPTG。Lee和Goldfarb的实验结果- -run offrun offlacR + +IPTG +Run-off：合成一小合成一小段结构基段结构基因的因的RNA 结果表明，阻遏蛋白不能结果表明，阻遏蛋白不能阻止阻止RNA聚合酶与启动子形成聚合酶与启动子形成开放复合物。开放复合物。 Lee和和Goldfarb还还注意到，在阻遏蛋白存在时，有注意到，在阻遏蛋白存在时，有一个仅一个仅6个核苷酸长的不全转录个核苷酸

42、长的不全转录物（物（abortive transcripts）产生。）产生。这说明阻遏蛋白实际上是抑制了这说明阻遏蛋白实际上是抑制了从产生不全转录物的从产生不全转录物的无效转录无效转录到到连续转录连续转录这个转变过程。这个转变过程。The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1965for their discoveries concerning genetic control of enzyme and virus synthesisFranois JacobAndr LwoffJacques MonodInstitut Pasteur, Paris,

43、 France乳糖操纵子的阻遏调控 lacI的表达产物是四聚体的阻遏蛋白的表达产物是四聚体的阻遏蛋白（repressor），它结合到乳糖操纵子的操纵区），它结合到乳糖操纵子的操纵区（operator），使转录不能进行。当有诱导物），使转录不能进行。当有诱导物（inducer）存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，）存在时，诱导物与阻遏蛋白结合，结合的复合物不能与操纵区结合，转录得以进结合的复合物不能与操纵区结合，转录得以进行。行。乳糖操纵子的阻遏调控 实际上，以乳糖为诱导物时，并不是乳糖和阻实际上，以乳糖为诱导物时，并不是乳糖和阻遏蛋白结合，而是由乳糖（半乳糖遏蛋白结合，而是由乳糖（半乳糖1,4葡萄葡

44、萄糖）的异构体异构乳糖（半乳糖糖）的异构体异构乳糖（半乳糖 1,6葡萄葡萄糖）与阻遏蛋白结合。由乳糖转变成异构乳糖是由糖）与阻遏蛋白结合。由乳糖转变成异构乳糖是由半乳糖苷酶催化的。在半乳糖苷酶催化的。在半乳糖苷酶催化下，半乳糖苷酶催化下，多数乳糖降解成葡萄糖和半乳糖，也生成一些异构多数乳糖降解成葡萄糖和半乳糖，也生成一些异构乳糖，使得操纵子处于开放状态。乳糖，使得操纵子处于开放状态。 乳糖操纵子的阻遏调控Operator 的结构-5 +21乳糖操纵子的三个OperatorMajor operatorAuxiliary operatorAuxiliary operator乳糖操纵子的三个Oper

45、ator缺失对基因表达的影响右边的数字是右边的数字是加加inducer与与不加不加inducer时时半乳糖半乳糖苷酶活性之比苷酶活性之比阻遏蛋白四聚体结合到两个operator上使DNA成环DNA弯曲成环提高了阻遏的效率弯曲成环提高了阻遏的效率乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应 当培养基中有葡萄糖存在时，细胞吸收葡萄当培养基中有葡萄糖存在时，细胞吸收葡萄糖，葡萄糖与半乳糖苷透过酶结合，阻止乳糖吸糖，葡萄糖与半乳糖苷透过酶结合，阻止乳糖吸收。这叫诱导物排斥（收。这叫诱导物排斥（inducer exclusion）。）。Inducer ExclusionThe key molecular compone

46、nt in inducer exclusion is the PTS (phosphoenolpyruvate:glucose phosphotransfer-ase system), a complex of proteins in the bacterial membrane, which simultaneously phosphorylates and transports sugars into the cell. One of the proteins of this complex (II AGlc, which is code d by the crr gene) become

47、s dephosphorylated as a result of glucose transport. It then binds to the Lac permease and prevents it from importing lactose into the cell.葡萄糖抑制乳糖输入乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应 除了抑制乳糖吸收外，葡萄糖还通过另一种机除了抑制乳糖吸收外，葡萄糖还通过另一种机制阻止乳糖操纵子表达。制阻止乳糖操纵子表达。PTS中的中的II AGlc在磷酸化状在磷酸化状态时刺激腺苷酸环化酶的活性，使态时刺激腺苷酸环化酶的活性，使ATP转变成转变成cAMP，当介质中有葡

48、萄糖时，当介质中有葡萄糖时，II AGlc在输入葡萄糖的过程中，在输入葡萄糖的过程中，本身被脱磷酸化，脱磷酸化的本身被脱磷酸化，脱磷酸化的II AGlc降低腺苷酸环化降低腺苷酸环化酶的活性，使酶的活性，使cAMP减少。而减少。而cAMP也是乳糖操纵子也是乳糖操纵子表达的必需因子。这是乳糖操纵子表达的另一种调表达的必需因子。这是乳糖操纵子表达的另一种调控机制。控机制。乳糖操纵子表达中的葡萄糖效应 cAMP可与其受体蛋白可与其受体蛋白CAP（catabolite activator protein，也叫，也叫cyclic AMP receptor protein，CRP）结）结合，形成复合物，结合

49、到乳糖操纵子的启动子区域，合，形成复合物，结合到乳糖操纵子的启动子区域，从而使得从而使得RNA聚合酶能够与启动子结合，转录得以进聚合酶能够与启动子结合，转录得以进行。没有行。没有cAMPCAP复合物与启动子的结合，复合物与启动子的结合，RNA聚合酶不能结合到启动子上。聚合酶不能结合到启动子上。 很多操纵子的转录需要很多操纵子的转录需要cAMPCAP复合物的参复合物的参与，尤其是那些与，尤其是那些10和和35序列保守性不强的启动子。序列保守性不强的启动子。乳糖操纵子启动子上CAP与RNA聚合酶的顺序结合乳糖操纵子启动子上的CAP结合位点CAP与结合位点结合后使DNA发生弯曲负调控和正调控 In

50、negative regulation a repressor protein binds to an operator to prevent a gene from being expressed. In positive regulation a transcription factor is required to bind at the promoter in order to enable RNA polymerase to initiate transcription.调节蛋白的几种作用方式调节蛋白的几种作用方式色氨酸操纵子 色氨酸操纵子负责色氨酸的生物合成，色氨酸操纵子负责色氨酸

51、的生物合成，它的表达与否根据培养基中有无色氨酸而定。它的表达与否根据培养基中有无色氨酸而定。当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子打开。自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子打开。 色氨酸操纵子的组成 色氨酸的合成分色氨酸的合成分5步完成。每一步需要一个步完成。每一步需要一个酶，编码这酶，编码这5种酶的基因是紧密连锁在一起的，种酶的基因是紧密连锁在一起的，这这5个基因被转录在一条多顺反子个基因被转录在一条多顺反子mRNA上。这上。这5个基因分别称为个基因分别称为trpE、trpD、trpC、trpB、trpA，它们分别编码了邻氨基苯甲酸合

52、成酶、邻氨基苯它们分别编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油酸合成酶和吲哚甘油3磷酸合成酶。另外，磷酸合成酶。另外，前导区和衰减子（前导区和衰减子（attenuator，也叫弱化子）区，也叫弱化子）区分别称为分别称为trpL和和trpa。为。为trp操纵子调控合成阻遏操纵子调控合成阻遏物的基因是物的基因是trpR，该基因离，该基因离trp操纵子很远。操纵子很远。 色氨酸操纵子的结构色氨酸操纵子的调控机制 色氨酸操纵子有两个表达控制机制，一色氨酸操纵子有两个表达控制机制，一个是阻遏系统控制，另一个是衰减子控制。个是阻遏系统控制，另一个是衰减子控制。 色氨酸操纵子的阻遏系统控制 在细胞内缺少色氨酸时，在细胞内缺少色氨酸时，trpR合成的