第4章发酵工程

1、w 第一节 发酵工程概况w 第二节 微生物工业菌种与培养基w 第三节 发酵操作方法与工艺控制w 第四节 发酵产物的后处理w 第五节 发酵工程的应用第一节 发酵工程概况w 发酵工程的定义w 发酵工程反应过程的特点w 发酵工程的内容和发展1.发酵工程的定义w 发酵：利用微生物在有氧和无养条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程w 发酵工程：w 利用生物的生命活动产生的酶，对无机或有机原料进行酶加工获得产品的工业。 是将传统的发酵与现代DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术结合并发展起来的发酵技术。是渗透工程学的微生物学。w 发酵产品：人干扰素、乙肝疫苗、心活素、红细胞生成素、血凝因

2、子、青霉素酰化酶、成纤维细胞生长因子等等2.发酵工程反应过程的特点w a.反应条件温和w b.原料来源广泛w c.反应以生命体的自动调节方式进行，若干个反应过程能够像单一反应一样，在单一反应器内很容易地进行w d.发酵产品多为小分子，但能很容易的生产出复杂的高分子化合物w e.高度选择性的进行复杂化合物在特定部位的反应w f.发酵液一般对生物体无害w g.易发生杂菌污染w h.通过菌种改良，可以利用原有设备较大幅度的提高生产水平需注意的一些问题w 1.副产物的产生，造成提取和精制的困难w 2.活细胞的反应，细胞容易发生变异，影响反应物的生成率，不易控制w 3准备工作量大，花费高w 4.底物浓度

3、不能过高，要使用较大反应器w 5废水具有较高的BOD/COD(水质生物耗氧量和化学需氧量）,需进行处理3.发酵工程的研究内容w 内容：生产菌种的选育、发酵条件的优化与控制、反应器的设计及产物的分离、提取与精致等过程w 有价值的发酵产物：微生物菌体本身；菌体代谢产物；菌体或酶系实现生物转化得到的产物第二节 微生物工业菌种与培养基w 真核生物：细胞含有具体的细胞核，细胞核有核膜、核仁和染色体，如原生动物、单细胞藻类、真菌等。w 原核生物：细胞含有不具体的细胞核，细胞核没有核膜、核仁，遗传物质(DNA)不组成典型的染色体，如细菌和立克次氏蓝绿藻类。w 非细胞微生物：病毒如噬菌体1.发酵工业对菌种的要

4、求w a.原料廉价、生长迅速、代谢产物产量高w b.培养条件易于控制，所需酶活力高w c.发酵周期短，生长速度和反应速度快w d.菌株选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株w e.菌株抗噬菌体能力强w f.菌种性能稳定，不宜变异退化w g.菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素2.工业常用的微生物菌种2.1细菌2.1.1形态和大小 球状、杆状和螺旋状 110-10110-9mg2.1.2 属原核生物 包括细胞壁、细胞膜、细胞质和核质体等 特殊结构：鞭毛、荚膜和芽孢2.1.3 细菌的繁殖方式w 裂殖方式w 芽孢：某些细菌在其生活史的一定阶段，于营养细胞内形成的一个内生

5、孢子w 一般湿热灭菌以杀死在自然界中抗热性最强的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢为标准， 规定在121 灭菌15分钟2.1.4发酵工业常用的细菌 大肠杆菌、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌等2.2 放线菌2.2.1 形态及构造w 菌落呈放射状w 属于原核生物w 由菌丝体构成，菌丝体包括基内菌丝体（营养菌丝体）和气生菌丝体 气生菌丝体发育到一定阶段形成孢子丝，然后形成孢子2.2.2 放线菌的繁殖 无性方式繁殖，菌丝断裂的片断可繁殖成新的菌体2.2.3 放线菌在微生物中的分类及地位 介于细菌和丝状真菌之间，在微生物分类位置上属于细菌w 2.2.4 发酵工业常用的放线菌主要用于生产抗生素：w 龟裂酶素：土霉素

6、w 金霉素链霉菌：四环素w 红霉素链霉菌：红霉素其中小单胞菌属产抗生素最多另外放线菌还可产生酶和维生素2.3酵母w2.3.1 酵母的形态大小w 属真菌类w 单细胞w 出芽方式进行无性繁殖w 形态：球形、椭圆形、卵圆形、柠檬形、腊肠形和菌丝状等w 大小：发酵工业用酵母一般 46m2.3.2 酵母的细胞结构w 真核细胞w 典型的细胞结构2.3.3 酵母的繁殖方式w 无性繁殖：芽殖和裂殖，酵母的主要繁殖方式w 有性繁殖：产生子囊和子囊孢子2.3.4 工业上常用的酵母w 啤酒酵母w 卡尔斯伯酵母w 啤酒酵母椭圆变种w 德巴利氏酵母属w 汉逊氏酵母w 毕赤氏酵母属w 假丝酵母属w 丝酶母属2.4 霉菌2

7、.4.1 形态及构造w 属于真菌，亦称丝状真菌w 营养体由菌丝构成w 菌丝：无横膈，整个菌丝是一个单细胞，含多个细胞核；有横膈每一段就是一个细胞w2.4.2 酶菌的繁殖及生活史w 通过孢子繁殖,通过无性和有性方式形成孢子w2.4.3 工业常用霉菌w 藻状菌纲：根酶、毛酶、犁头酶w 子囊菌纲：红曲霉w 半知菌类：曲霉、青酶2.5 噬菌体2.5.1特点、形态和化学成分形态：有头尾之分化学成分：核酸和蛋白质占粒子质量90%以上，其中核酸40-50%特点w 形态微小，体积比细菌小的多w 为非细胞类型，属于病毒w 对寄主细胞有严格的专一性2.5.2 生长和繁殖w 吸附：尾部吸附侵入w 侵入w 增值w 成

8、熟w 释放2.5.3噬菌体的防治w 杜绝噬菌体生存增殖的环境条件w 选育和使用抗噬菌体菌株w 菌种轮换使用2.培养基的制备w2.1培养基的营养成分及来源 碳源：供给微生物生命活动所需的能量和构成菌体细胞以及代谢产物的物质基础氮源：构成微生物细胞中蛋白质和核酸的主要元素无机盐：参与细胞结构物质的组成，作为酶活性中心的组成部分或维持酶的活性，调节渗透压、PH值等生长因子：提供微生物细胞所需要的化学物质、辅助因子的组分和参与代谢的物质能源和水2.2 培养基的类型2.2.1 根据营养基来源划分w 天然培养基w 合成培养基w 综合培养基2.2.2 根据培养基原物质状态w 液体培养基w 固体培养基2.2.

9、3 根据培养基的用途划分w 基础培养基w 鉴别培养基w 增殖培养基：加入额外的营养物质，促进某一类菌生长w 选择培养基：加入某种具杀菌作用的物质w 活体培养基：活的动植物体或离体的生活细胞2.2.4根据生产目的划分w 种子培养基w 发酵培养基2.3 发酵培养基的选择基本原则w 提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分w 有利于减少培养基原料的消耗，增加产率w 有利于提高培养基和产物的浓度w 有利于提高产物合成的速度，缩短发酵周期w 减少副产物的形成w 原料价格低廉，质量稳定w 有利于提高氧的利用率，降低成本能耗w 有利于产品的分离纯化，减少三废的出现2.4 菌种的扩大培养2.4.1目的：为生产提

10、供相当数量的代谢旺盛的种子，以缩短发酵周期，提高发酵罐利用率，有利于减少杂菌污染的机会。w 对种子要求：纯、壮、活力旺盛、接种数量足够2.4.2.1 种子扩大培养阶段w 液体培养法：液体试管、三角瓶摇床震荡或回旋培养。通气量大小可控。w 表面培养法：茄子瓶、克氏瓶、瓷盘培养w 固体培养法：三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶和培养皿等2.4.2 工业微生物菌种培养的类型w 2.4.2.2 大规模生产阶段：浅盘固体培养、深层固体培养、浅盘液体培养、深层液体通气培养固体培养w 培养基原料：小麦麸皮等w 设备：较浅的曲盘、较深的大池、能旋转的转鼓和通风曲槽等w 特点：设备简单，生产成本低，产量较高，耗费劳动力较多

11、，占地面积达，PH、溶解氧、温度等不易控制，易污染，生产规模难以扩大液体培养按是否需氧w 静置培养：厌氧菌发酵w 通气培养：好氧菌发酵按培养罐类型w 浅盘培养：没有通气搅拌设备，劳动强度大，生产效率低，易污染w 液体深层培养：发酵罐内进行，发酵罐内有搅拌器，通入空气。w 大型发酵罐的发酵一般也分几级，进行多级培养，谷氨酸发酵二级培养，青霉素和链霉素等需三级培养第三节发酵操作方法和工艺控制w 1.发酵操作方法w 2影响发酵的主要因素w 3.发酵设备1.发酵操作方法发酵的一些指标：w 底物转化成产品的比率：控制原料对产品成本影响w 产率：单位时间，单位体积生产的成品半成品数量w 发酵产物浓度：确定

12、下一步提取和精制方法及费用w 残留底物量：实际转化率，防止杂菌1.1 分批发酵w 又称间歇发酵法。在一个密闭系统内一次性加入营养物和菌种进行培养，直到结束放出，中间除了空气进入和尾气排出，与外界没有物料交换。见p40图3-1分批发酵过程微生物的生长可分为四个不同的阶段迟滞期：细胞不分裂（不生长），但细胞变大，细胞内RNA含量增高，原生质呈碱性，合成代谢活跃，易合成新的诱导酶，对外界环境变化敏感。接种物中死细胞较多或培养基不丰富时延滞期较长。对数期 ：细胞分裂（生长）最快，细胞进行平衡生长，酶系活跃，代谢旺盛。生长速率由营养成分和培养条件决定。 稳定期： 新繁殖的细胞与死亡细胞数目相等，菌体产量

13、达到最高，细胞开始储藏糖原、脂肪等储藏物，产芽孢的开始形成芽孢，开始合成次生代谢产物。可能由于营养物的消耗或抑制生长的代谢产物积累，细胞停止增殖，但仍存活。 衰亡期： 死亡细胞数目超过新生细胞，细胞形态多样，细胞开始自溶，开始释放次生代谢产物。 1.2连续发酵法w 向发酵罐中连续供给新鲜培养基的同时，将含有微生物和产物的培养液以相同的速度连续放出，从而使发酵液中的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长。优点：提高设备利用率、原料利用率和便于实现自动化缺点：1）开放系统，容易杂菌污染 2）对设备、仪器要求高1.3补料分批发酵法w 指在分批培养过程中，间歇的或连续的补加新鲜培养基，但所需产物不到一定

14、时刻不放出的培养方法。又称半连续发酵，是分批发酵和连续发酵之间的一种过渡培养方法。w 优点：1）与连续发酵相比,不需要严格的无菌条件，不会产生菌种老化和变异问题，以及适用范围广 2）与分批发酵比较：可以解除底物的抑制，产物反馈抑制和葡萄糖分解阻遏根据流加方式不同，分为w 单一补料w 反复补料分批发酵：发酵过程中每隔一定时间按一定比例放出一部分发酵液，直至发酵产率明显下降。目前应用十分广泛，面包酵母、氨基酸、抗生素、单细胞蛋白质等发酵工业2.影响发酵的主要因素w 温度：根据发酵不同阶段，确定最适温度。发酵中释放发酵热，一般需要进行冷却操作w PH：PH不同产物不同，基质加缓冲性物质，生产过程中加

15、入无机酸、碱等w 通风和搅拌：可以生长和最适生长氧浓度w 染菌的控制：1）设备、管道、阀门漏损 2）设备及管道灭菌不彻底存在死角3）空气净化不彻底4）菌种不纯或培养基灭菌不彻底 5）无菌操作不严格，生产操作出错3.发酵设备3.1厌氧发酵罐w 设备简单w 主要用于酒精、乳酸及啤酒等厌氧发酵3.2好氧发酵罐3.2.1机械搅拌式发酵罐（通用式发酵罐）：大部分通风发酵采用。w 特点:溶氧速率高，气液混合效果好,结构严密，有利于避免杂菌污染w 缺点：结构较复杂，动力消耗大结构p46图3-43.2.1 通风搅拌式发酵罐w 通风目的：a)供给微生物所需要的氧b）代替搅拌器使发酵液均匀混合w 1）循环式通风发酵罐w 2）高位塔式发酵罐第四节 发酵产物的后处理1. 发酵产物的分离和纯化的目的及基本要求2.发酵液下游处理的流程和方法1.目的及基本要求w.目的：w 发酵液中杂质含量较多，代谢产物的浓度较低，低浓度的发酵产品不能直接作为工业生产的原料或为我所用 基本要求（1）操作简单费用低（2）提取率高，能够达到要求纯度，废液中最终产品含量低 （3）不影响产品质量 （4）提取所用试剂对设备腐蚀性小 （5）产生废物能够处理，对环境污染少 2.流程和方法下游技术两个阶段：（1）发酵液的预处理和固液分离（2）纯化 a 提取（初步纯