塑胶模具斜顶设计方案doc

1、会计学1塑胶模具斜顶设计方案塑胶模具斜顶设计方案docWestern blotting的概念的概念nWesternWestern印迹、印迹、基本步骤基本步骤将SDS-PAGE电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与特异性的一抗进行反应；洗涤去除没有结合的特异性抗体后，加入二抗（标记有酶、同位素或荧光）；反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现，也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。1 固体相上的蛋白质固体相上的蛋白质2 针对蛋白质的特异性抗体（一抗）针对蛋白质的特异性抗体（一抗）3 带上带上

2、HRP针对一抗的抗体（二抗）针对一抗的抗体（二抗）4 加入底物，在酶的作用下，分解产生加入底物，在酶的作用下，分解产生 有色物质有色物质蛋白转膜系统蛋白转膜系统转膜系统示意图转膜系统示意图阳极阳极阴极阴极滤纸滤纸凝胶凝胶膜膜多孔垫片多孔垫片免疫组织化学(Immunohistochemistry)获得基因的方法获得基因的方法1. 1. 化学合成方法化学合成方法 主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基主要用于较小基因的合成，或需改变密码子的基因因2. 2. 半化学合成法半化学合成法 mRNA mRNA cDNA cDNA 加人工接头或合成一段加人工接头或合成一段DNA DNA 与载体相连与载体

3、相连3. 3. 筛选法筛选法 用于各种方法从基因组文库或用于各种方法从基因组文库或cDNAcDNA文库中选择目文库中选择目的基因的基因1500600 400 300200100 Marker(bp)l杂交温度：l杂交时间: 基因芯片技术主要步骤基因芯片技术主要步骤n芯片制备n样本制备n杂交反应n信号检测n结果分析电泳的概念和分类电泳的概念和分类电泳：电泳：带电粒子在电场中向带有异相电荷带电粒子在电场中向带有异相电荷的电极移动的现象的电极移动的现象电泳使用电泳使用不同的支持介质不同的支持介质，早期有滤纸、，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚

4、氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（胺（PAGEPAGE）和琼脂糖凝胶。）和琼脂糖凝胶。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理SDS-PAGE电泳分类电泳分类不连续系统的特点不连续系统的特点垂直电泳系统垂直电泳系统1 SDS-PAGE凝胶的制作凝胶的制作聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套116 00066 20045 00035 00025 00018 40014 400M 1 2 3 4 5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 3 P

5、oly(A) RNA5 T12MN 3锚定引物锚定引物逆转录逆转录5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5变性变性5 MNAAAAAAAAAAAA(A)n 33M N TTTTTTTTTTTT 5退火退火5 T12MN 3锚定引物锚定引物寡核苷酸随机引物寡核苷酸随机引物3M N TTTTTTTTTTTT 5延长延长dNTP、Taq聚合酶聚合酶3M N TTTTTTTTTTTT 55MNAAAAAAAAAAA 3变性、退火、延伸变性、退火、延伸电泳电泳显示显示T12MN(M为为A、G、C，N为为A、T、G、C) 启动启动cDNA第一链合成第一链合成不同长

6、度的不同长度的PCR产物产物回收差异条带，再扩增回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对，克隆测序，同源比对随机结合到随机结合到cDNA链上链上n引物设计转化转化BL21细胞细胞筛选筛选诱导蛋白表达诱导蛋白表达pGEX-2T/E1阳性重组质粒阳性重组质粒pGEX-2T质粒质粒双酶切双酶切pGEX-2T质粒质粒ABpGEX-2T/E1重组质粒重组质粒目的基因片目的基因片断的获取断的获取连接连接双酶切双酶切外源基因在毕赤酵母中的表达外源基因在毕赤酵母中的表达在科研和临床中需要大量的蛋白质，不可能由人体组织或在科研和临床中需要大量的蛋白质，不可能由人体组织或体外细胞培养而大规模的获得，人们利用一些低

7、等生物的体外细胞培养而大规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。特点，来生成和获得这些人属蛋白质。酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及一些独特的性质，已发展成为较因

8、具有旺盛的生长力以及一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。成熟的蛋白表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素、由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素、HBsAgHBsAg、TNFTNF、EGFEGF、人血清白蛋白，以及多种抗体等。、人血清白蛋白，以及多种抗体等。常用载体的基本结构常用载体的基本结构5AOX15AOX1启动子片段含有启动子片段含有AOX1AOX1启动子，在甲醇启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达的诱导下可启动外源蛋白的表达-因子信号肽序列为约因子信号肽序列为约8989个氨基酸的信号肽个氨基酸的信号

9、肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化利于外源蛋白的纯化多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点插入提供位点TTTT序列提供有效的转录终止和序列提供有效的转录终止和polyApolyA修饰信号修饰信号HIS4HIS4为营养缺陷型筛选标志为营养缺陷型筛选标志3AOX1 3AOX1 基因片段能够与基因组基因片段能够与基因组AOX1AOX1基因属同基因属同源重组源重组抗抗Amp Amp 基因和基因和pBR322pBR322能使空载体和构建的表能使空载体和构建的表达载体在达载体在E.coliE.c

10、oli中筛选和复制中筛选和复制构建表达载体构建表达载体转化至酵母菌中转化至酵母菌中筛选阳性转化单克隆筛选阳性转化单克隆筛选高表达单克隆筛选高表达单克隆挑单克隆挑单克隆于培养液于培养液振荡培养振荡培养3 35 5天，加甲天，加甲醇诱导目的蛋白的表达醇诱导目的蛋白的表达离离心心酵母上酵母上清清FACSCalibur细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能lFSC（小角散射光) 它反映细胞的相对大小和截面积的大小90度角散射光)X轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用“通道数”表示，可以与光强度之间呈线性关系或对数关系Y轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率SDS-PAGE电泳分类电泳分类116 00066 20045 00035 0