微生物18第十七章支原体

1、第十七章第十七章 支原体（支原体（Mycoplasma）第一节第一节 概述概述支原体支原体（Mycoplasma）又译作又译作霉形体霉形体，是，是一一类无细胞壁的细菌类无细胞壁的细菌，细胞柔软，高度多形性，细胞柔软，高度多形性，能通过细菌滤器能通过细菌滤器，能在无细胞的人工培养基能在无细胞的人工培养基中生长繁殖中生长繁殖，含有含有DNA和和RNA，以二分裂，以二分裂或芽生方式繁殖或芽生方式繁殖。 在固体培养基上形成特征性的在固体培养基上形成特征性的“煎荷包蛋煎荷包蛋”状菌落状菌落，基因组中核酸，基因组中核酸G+C mol%比一般比一般细菌低，细菌低，对青霉素有抵抗力对青霉素有抵抗力。支原体广泛

2、。支原体广泛分布于污水、土壤、植物、动物和人体中，分布于污水、土壤、植物、动物和人体中，腐生、共生或寄生，常污染实验室的细胞腐生、共生或寄生，常污染实验室的细胞培养及生物制品，有培养及生物制品，有30多种对人或畜禽有多种对人或畜禽有致病性。致病性。 支原体的煎荷包蛋状菌落支原体的煎荷包蛋状菌落 支原体在分类上归为柔膜体纲，下设支原体在分类上归为柔膜体纲，下设4目、目、7科、科、11个属。兽医学研究的主要对象为支原个属。兽医学研究的主要对象为支原体属体属 (Mycoplasma)及脲原体属及脲原体属(Ureaplasma)的成员。的成员。 1700年发现牛传染性胸膜肺炎的病原，年发现牛传染性胸膜

3、肺炎的病原，1898年年Nocard等用无细胞人工培养基分离培养成等用无细胞人工培养基分离培养成功，称胸膜肺炎微生物。其后不断从人体、功，称胸膜肺炎微生物。其后不断从人体、各种动物、昆虫、植物、土壤及污水中分离各种动物、昆虫、植物、土壤及污水中分离到相似的微生物，统称为类胸膜肺炎微生物。到相似的微生物，统称为类胸膜肺炎微生物。 1956年正式命名为年正式命名为Mycoplasma，并沿用至今。，并沿用至今。 由于支原体细胞外围只有柔软的胞浆膜，故具由于支原体细胞外围只有柔软的胞浆膜，故具有多形性、可塑性和滤过性。有多形性、可塑性和滤过性。常呈球状、两极状、常呈球状、两极状、环状、杆状，有些偶见

4、分枝丝状。球形细胞直径环状、杆状，有些偶见分枝丝状。球形细胞直径0.30.30.80.8m m，丝状细胞大小，丝状细胞大小0.30.30.40.4m m2 2150150m m不等。在加压情况下，能通过孔径不等。在加压情况下，能通过孔径450450220nm220nm的滤膜。无鞭毛，有些能滑动。的滤膜。无鞭毛，有些能滑动。革兰氏染革兰氏染色呈阴性色呈阴性，通常着色不良，用姬姆萨或瑞氏染色，通常着色不良，用姬姆萨或瑞氏染色良好，呈淡紫色。良好，呈淡紫色。 形态及染色特性形态及染色特性姬姆萨染色姬姆萨染色革兰氏染色革兰氏染色培养特性培养特性 支原体的核质与细菌一样，是一个环形双股支原体的核质与细菌

5、一样，是一个环形双股DNA，但分子量比细菌小，仅有大肠杆菌的，但分子量比细菌小，仅有大肠杆菌的1/5，生物合成能力较弱，营养要求较高生物合成能力较弱，营养要求较高，培，培养支原体的人工培养基中养支原体的人工培养基中需要添加外源脂肪酸需要添加外源脂肪酸和淄醇和淄醇。为抑制细菌生长，常加入青霉素、醋。为抑制细菌生长，常加入青霉素、醋酸坨、叠氮钠等药物。酸坨、叠氮钠等药物。多数在有氧条件下生长良好，但用固体培养基分离培养时，在多数在有氧条件下生长良好，但用固体培养基分离培养时，在5%CO2和和95%N2的环境中，生长为佳，琼脂浓度则以的环境中，生长为佳，琼脂浓度则以1%1.5%为宜。适合生长的为宜。

6、适合生长的pH7.08.0，脲原体属较低，脲原体属较低，pH6.0士士0.5，适宜温度为，适宜温度为36。 支原体生长缓慢支原体生长缓慢，在琼脂培养基上孵育，在琼脂培养基上孵育2 26d6d，才长出必须用低倍显微镜才能观察到的，才长出必须用低倍显微镜才能观察到的微小菌落，直径从微小菌落，直径从1010600600m m不等，圆形、不等，圆形、透明、露滴状，溶脲脲原体的菌落仅透明、露滴状，溶脲脲原体的菌落仅l0l04040m m，故称，故称T”T”株。株。支原体的典型菌落呈支原体的典型菌落呈 煎荷包蛋状煎荷包蛋状 ，菌落中心深入培养基中、至菌落中心深入培养基中、至密、色暗，周围长在培养基表面、较

7、透明。密、色暗，周围长在培养基表面、较透明。 猪肺炎支原体和肺支原体等的菌落则不典型，猪肺炎支原体和肺支原体等的菌落则不典型，无中心生长点。无中心生长点。 支原体的支原体的“煎蛋样煎蛋样”菌菌落落 支原体在液体培养基中生长数量较少，不支原体在液体培养基中生长数量较少，不易见到浑浊易见到浑浊，有时见到小颗粒黏于管壁或，有时见到小颗粒黏于管壁或沉管底。可在鸡胚的卵黄囊或绒毛尿囊膜沉管底。可在鸡胚的卵黄囊或绒毛尿囊膜上生长，有些菌株可致鸡胚死亡。也能在上生长，有些菌株可致鸡胚死亡。也能在细胞培养中生长，不一定引起细胞病变，细胞培养中生长，不一定引起细胞病变，但可但可妨碍病毒的细胞培养妨碍病毒的细胞培

8、养。 支原体与细菌支原体与细菌L型的主要区别型的主要区别支原体支原体为：为：1、发生在自然界的固有生命形态、发生在自然界的固有生命形态;2、在无抗生素等诱导物的培养基中生长、在无抗生素等诱导物的培养基中生长无返祖现象无返祖现象;3、生长需要甾醇、生长需要甾醇;4、抗体能抑制生长、抗体能抑制生长;5、DNA中中G+C mol%低于细菌低于细菌;6、对洋地黄苷的溶解作用敏感。、对洋地黄苷的溶解作用敏感。细菌细菌L型型为：为：1、细菌变异形态，常常是实验室形成的（与人为因素有关）；、细菌变异形态，常常是实验室形成的（与人为因素有关）；2、去除诱导物时、去除诱导物时易返祖易返祖成母菌形态成母菌形态;3

9、、一般不需要甾醇、一般不需要甾醇;4、抗体不能抑制生长、抗体不能抑制生长;5、DNA中中G+C mol%与细菌相同与细菌相同;6、对洋地黄苷的溶解作用有抵抗力。、对洋地黄苷的溶解作用有抵抗力。 生理生化特性生理生化特性 一般根据对糖类分解利用能力不同，分为两群。一般根据对糖类分解利用能力不同，分为两群。一群能分解葡萄糖及其他多种糖类产酸不产气，一群能分解葡萄糖及其他多种糖类产酸不产气，称发酵型称发酵型；另一群不能分解糖，称为非发酵型，另一群不能分解糖，称为非发酵型，但能利用精氨酸作为碳素和能量来源但能利用精氨酸作为碳素和能量来源。仅有少。仅有少数几种支原体例外，二者兼而有之，或均不能数几种支原

10、体例外，二者兼而有之，或均不能利用。某些糖发酵株能产生利用。某些糖发酵株能产生H2O2H2O2，在含血液的，在含血液的培养基中其菌落周围可形成培养基中其菌落周围可形成B B型或型或a a型溶血。少型溶血。少数株能液化明胶、消化凝固血清或酪蛋白。数株能液化明胶、消化凝固血清或酪蛋白。 抗原结构抗原结构抗原结构：细胞膜上的蛋白质和糖脂抗原结构：细胞膜上的蛋白质和糖脂 各型交叉少各型交叉少补体结合试验：糖脂补体结合试验：糖脂ELISA试验：蛋白质试验：蛋白质生长抑制试验（生长抑制试验（GIT）代谢抑制试验（代谢抑制试验（MIT） 血清抗体血清抗体抵抗力抵抗力比细菌敏感，易被消毒剂灭活比细菌敏感，易被

11、消毒剂灭活对醋酸铊、结晶紫抵抗力强对醋酸铊、结晶紫抵抗力强对青霉素等耐药对青霉素等耐药对干扰蛋白质合成的抗生素敏感对干扰蛋白质合成的抗生素敏感致病性与免疫性致病性与免疫性 病原性支原体常常定居于多种动物呼吸道、病原性支原体常常定居于多种动物呼吸道、泌尿生殖道、消化道黏膜表面、乳腺及眼泌尿生殖道、消化道黏膜表面、乳腺及眼等，并对胸腺、腹膜、关节滑液囊膜的间等，并对胸腺、腹膜、关节滑液囊膜的间质细胞以及中枢神经系统的亲和力较强。质细胞以及中枢神经系统的亲和力较强。主要营寄生生活，部分营腐生生活，单独主要营寄生生活，部分营腐生生活，单独感染时常常是症状轻微或无临床表现，当感染时常常是症状轻微或无临床

12、表现，当细菌或病毒等继发感染或受外界不利因素细菌或病毒等继发感染或受外界不利因素的作用，引起疾病。的作用，引起疾病。 特点是潜伏期长，呈慢性经过，地方性流特点是潜伏期长，呈慢性经过，地方性流行，多具有种的特性。除实验动物的支原行，多具有种的特性。除实验动物的支原体外，一般不引起实验动物病变。致猪疾体外，一般不引起实验动物病变。致猪疾病的支原体主要有猪肺炎支原体等病的支原体主要有猪肺炎支原体等3 3种，种，致禽疾病有禽败血支原体、滑液囊支原体致禽疾病有禽败血支原体、滑液囊支原体等等3 3种，致牛、羊疾病的分别有种，致牛、羊疾病的分别有8 8和和7 7种。种。 喘气病喘气病猪呼吸猪呼吸困难困难喘气

13、病猪喘气病猪肺脏实变肺脏实变免疫力：免疫力： 动物自然发生支原体病后具有免疫力，动物自然发生支原体病后具有免疫力，很少发生再次感染很少发生再次感染，例如猪发生支原体肺，例如猪发生支原体肺炎后保护期至少炎后保护期至少6060周，牛患传染性胸膜肺周，牛患传染性胸膜肺炎以后免疫保护达炎以后免疫保护达12123030个月。支原体感个月。支原体感染后，机体主要引起体液免疫应答，可产染后，机体主要引起体液免疫应答，可产生生IgMIgM、IgGIgG和和IgAIgA。支原体的疫苗研究比。支原体的疫苗研究比较困难。较困难。微生物学诊断微生物学诊断 支原体形态多样，直接镜检意义不大，应支原体形态多样，直接镜检意

14、义不大，应取病料进行分离培养和形态学、生理生化取病料进行分离培养和形态学、生理生化及血清学鉴定。及血清学鉴定。 将无菌病料用液体培养基稀释成乳剂，再将无菌病料用液体培养基稀释成乳剂，再10倍倍比倍倍比稀释至稀释至10-510-6，37培养培养27d。污染的病料可。污染的病料可过滤除菌后接种。初代培养末发生颜色变化时可过滤除菌后接种。初代培养末发生颜色变化时可盲目传代盲目传代23次。多种支原体初代分离时在含有次。多种支原体初代分离时在含有5%10%CO2或或5%CO2加加95%N2的环境中生长的环境中生长更佳。更佳。固体培养基接种后必须置于高湿环境培养。新分离固体培养基接种后必须置于高湿环境培养

15、。新分离菌株在鉴定前必须先进行细菌菌株在鉴定前必须先进行细菌L型鉴定和型鉴定和23次克次克隆、纯化。隆、纯化。1 分离培养：分离培养： 先作毛地黄苷敏感性测定，以确定分离物先作毛地黄苷敏感性测定，以确定分离物是支原体或无胆淄原体，再作葡萄糖、精是支原体或无胆淄原体，再作葡萄糖、精氨酸分解试验将其分为发酵葡萄糖和水解氨酸分解试验将其分为发酵葡萄糖和水解精氨酸两类，以缩小选用抗血清的范围。精氨酸两类，以缩小选用抗血清的范围。但种的鉴定必须用血清学方法最后确定，但种的鉴定必须用血清学方法最后确定，这与细菌鉴定到种只需作生理生化测定不这与细菌鉴定到种只需作生理生化测定不同。同。2 生理生化性状测定生理

16、生化性状测定 血清学试验方法中特异性较强、敏感性血清学试验方法中特异性较强、敏感性较高、应用较多的是生长抑制试验和代谢较高、应用较多的是生长抑制试验和代谢抑制试验以及表面免疫荧光试验。抑制试验以及表面免疫荧光试验。 生长抑制试验生长抑制试验 (GIT) 支原体在固体培养基上生长可被相应的支原体在固体培养基上生长可被相应的抗血清所抑制，常用圆纸片法。在接种被抗血清所抑制，常用圆纸片法。在接种被检支原体的平板培养基上，贴上含已知抗检支原体的平板培养基上，贴上含已知抗血清的圆纸片，培养后观察圆纸片周围有血清的圆纸片，培养后观察圆纸片周围有无菌落抑制圈的产生。抑制宽度达无菌落抑制圈的产生。抑制宽度达2

17、mm以以上时为同种，无抑制圈为异种。上时为同种，无抑制圈为异种。3血清学鉴定血清学鉴定 支原体的代谢活性可被相应的抗血清所支原体的代谢活性可被相应的抗血清所抑制。常用的有发酵抑制试验抑制。常用的有发酵抑制试验(FIT)、精氨、精氨酸代谢抑制试验酸代谢抑制试验 (AIT)以及脲酶代谢抑制试以及脲酶代谢抑制试验。验。FIT是将支原体接种于含葡萄活性是否是将支原体接种于含葡萄活性是否被抑制。可根据指示剂色调变化判定葡萄被抑制。可根据指示剂色调变化判定葡萄糖分解的抑制程度。糖分解的抑制程度。AIT是将支原体接种于是将支原体接种于含精氨酸加指示剂的液体培养基中，能分含精氨酸加指示剂的液体培养基中，能分解

18、精氨酸使培养基变碱者，可因加入相应解精氨酸使培养基变碱者，可因加入相应的抗血清所抑制。的抗血清所抑制。 代谢抑制试验代谢抑制试验 (MIT) 用已知抗血清制成用已知抗血清制成荧光抗体，直接染色琼荧光抗体，直接染色琼脂块上的支原体菌落，脂块上的支原体菌落，在入射式光源荧光显微在入射式光源荧光显微镜下观察菌落的特异性镜下观察菌落的特异性荧光。也可用抗血清与荧光。也可用抗血清与菌落反应后再用荧光标菌落反应后再用荧光标记的抗抗体染色。此法记的抗抗体染色。此法特异性和敏感性与特异性和敏感性与KIT法一样，但简单、省时。法一样，但简单、省时。 表面免疫荧光法表面免疫荧光法 (epi-IF) 上述上述3种血

19、清学方法是国际细菌分类委种血清学方法是国际细菌分类委员会支原体分类分会推荐使用的标准方法。员会支原体分类分会推荐使用的标准方法。近年来研究应用近年来研究应用PCR技术进行支原体的检技术进行支原体的检测，例如以特异性引物扩增脲酶基因。测，例如以特异性引物扩增脲酶基因。第二节第二节 猪的支原体猪的支原体对猪致病性的有对猪致病性的有猪肺炎支原体、猪猪肺炎支原体、猪鼻支原体和猪滑液支原体鼻支原体和猪滑液支原体。猪肺炎支原体（猪肺炎支原体（M. hyopneumomiae）可引起可引起猪地方流行性肺炎（猪喘气病）。猪地方流行性肺炎（猪喘气病）。猪鼻支原体（猪鼻支原体（M. hyorhinis）可引起猪的

20、肺炎、可引起猪的肺炎、伴发多发性浆膜炎和关节炎。伴发多发性浆膜炎和关节炎。猪滑液支原体（猪滑液支原体（M. hyosynoviae）可引起猪的可引起猪的急性滑膜炎和关节炎。急性滑膜炎和关节炎。支原体引起的猪喘气病症状及病理变化支原体引起的猪喘气病症状及病理变化支原体引起的猪关节炎症状及病理变化支原体引起的猪关节炎症状及病理变化第三节第三节 禽的支原体禽的支原体对禽致病性的有对禽致病性的有鸡毒支原体、火鸡鸡毒支原体、火鸡支原体和滑液囊支原体支原体和滑液囊支原体。鸡毒支原体（鸡毒支原体（M. gallispticum）可引起呼吸道可引起呼吸道症 状 为 主 的症 状 为 主 的 慢慢 性性 呼呼

21、吸 道 病 （吸 道 病 （ c h ro n i c respiratory disease, CRD）。）。滑液囊支原体（滑液囊支原体（M. synoviae）可引起鸡和火可引起鸡和火鸡的传染性滑液囊炎。鸡的传染性滑液囊炎。 二者均可垂直传播二者均可垂直传播。特特 征征鸡毒支原体鸡毒支原体（M. gallispticum）滑液囊支原体滑液囊支原体 防防 制制目前认为泰乐菌素、壮观霉素、链霉素目前认为泰乐菌素、壮观霉素、链霉素和红霉素对本病有相当疗效。抗生素治和红霉素对本病有相当疗效。抗生素治疗时，停药后往往复发，因此应考虑几疗时，停药后往往复发，因此应考虑几种药轮换使用。种药轮换使用。国内

22、已研制出有效菌苗，对鸡滴鼻免疫国内已研制出有效菌苗，对鸡滴鼻免疫后，安全有效，能抵抗强毒败血支原体后，安全有效，能抵抗强毒败血支原体的侵害。的侵害。第四节第四节 牛羊的支原体牛羊的支原体对牛羊致病性的对牛羊致病性的支原体主要是丝状支原体（支原体主要是丝状支原体（M. mycoides cluster）。丝状支原体丝状亚种（丝状支原体丝状亚种（M. mycoides ssp. Mycoides，Mmm）可引起可引起牛肺疫牛肺疫（牛传染性胸膜肺炎，（牛传染性胸膜肺炎，CBPP）、关节炎、乳腺炎，对羊不致病。）、关节炎、乳腺炎，对羊不致病。丝状支原体山羊亚种（丝状支原体山羊亚种（M. mycoide

23、s ssp. Capri，Mmc）可引起山羊呼吸系统疾病。可引起山羊呼吸系统疾病。山羊支原体（山羊支原体（M. capricolum）肺炎亚种肺炎亚种可引起山羊可引起山羊的传染性胸膜肺炎（的传染性胸膜肺炎（CCPP）；）；山羊亚种山羊亚种引起绵引起绵羊和山羊的肺炎、乳腺炎和关节炎。羊和山羊的肺炎、乳腺炎和关节炎。牛肺疫的症状及病理变化牛肺疫的症状及病理变化我国消灭牛肺疫的历程我国消灭牛肺疫的历程 1949年后，我国通过采取免疫、隔离、扑杀等综合性年后，我国通过采取免疫、隔离、扑杀等综合性防控措施，有效地控制了牛肺疫疫情。防控措施，有效地控制了牛肺疫疫情。1996年我国自行年我国自行宣布消灭牛肺

24、疫。宣布消灭牛肺疫。2008年年9月，我国向月，我国向OIE正式提交中国正式提交中国无牛肺疫认证申请报告，此后又两次补充材料回答无牛肺疫认证申请报告，此后又两次补充材料回答OIE方方面的技术质疑。面的技术质疑。 2010年年11月，月，OIE专家来华对我国牛肺疫消灭情况进专家来华对我国牛肺疫消灭情况进行实地考察，全面评估了我国牛肺疫监测能力，核查了行实地考察，全面评估了我国牛肺疫监测能力，核查了牛肺疫监测控制工作的规范性。牛肺疫监测控制工作的规范性。 2011年年5月月24日，世界动物卫生组织（日，世界动物卫生组织（OIE）第）第79届届年会通过决议，认可我国为无牛传染性胸膜肺炎（简称年会通过决议，认可我国为无牛传染性胸膜肺炎（简称“牛肺疫牛肺疫”）国家。）国家。 此前，全世界只有美国、澳大利亚、瑞士、葡萄牙、此前，全世界只有美国、澳大利亚、瑞士、葡萄牙、博茨瓦纳和印度等博茨瓦纳和印度等6个国家获得了个国家获