园艺植物生物技术第二章园艺植物脱毒

1、园艺植物生物技术第二章园艺植物脱毒第一节第一节 园艺植物病毒病的危害园艺植物病毒病的危害 多数无性繁殖的园艺植物易受到病毒的侵染，病多数无性繁殖的园艺植物易受到病毒的侵染，病毒侵染可经带毒的无性繁殖材料传至下一代，并逐毒侵染可经带毒的无性繁殖材料传至下一代，并逐渐积累，导致植物种性退化，造成作物产量下降或渐积累，导致植物种性退化，造成作物产量下降或品质降低甚至死亡。品质降低甚至死亡。 由病毒引起的植物病害称为植物病毒病由病毒引起的植物病害称为植物病毒病(Plant virus disease) 一、植物病毒的概念与形态一、植物病毒的概念与形态 v早在早在 17 17 世纪初，郁金香等植物表现花

2、叶、黄化、矮缩等症状，当时世纪初，郁金香等植物表现花叶、黄化、矮缩等症状，当时人们把这些异常现象，都归诸于生理的或遗传的原因人们把这些异常现象，都归诸于生理的或遗传的原因 ，或其他毒素，或其他毒素的作用。的作用。v 1886 1886 年，德国人年，德国人MayerMayer发现，把烟草花叶病植株的汁液发现，把烟草花叶病植株的汁液 , , 接种到无病接种到无病烟草上，可以使健康植株发病，于是他断定烟草花叶病是由细菌引起烟草上，可以使健康植株发病，于是他断定烟草花叶病是由细菌引起的。的。 v1892 1892 年，伊万诺夫斯基（俄国）发现，烟草花叶病的病原物可以通过细年，伊万诺夫斯基（俄国）发现

3、，烟草花叶病的病原物可以通过细菌不能通过的微孔漏斗，因此他认为烟草花叶病的病原不是细菌，而是菌不能通过的微孔漏斗，因此他认为烟草花叶病的病原不是细菌，而是一种一种 “ 传染性活液传染性活液 ” 。v 1898 1898 年，荷兰人年，荷兰人 Beijerind Beijerind 把这种把这种 “ 传染性活液传染性活液 ” 定名为病毒定名为病毒（virus) virus) 。其后又经过近。其后又经过近 40 40 年，美国的年，美国的 Stonley(1935) Stonley(1935) 把烟草花叶病把烟草花叶病毒提纯，得到它的结晶体，证实病毒是一种含有核酸的蛋白质，毒提纯，得到它的结晶体，

4、证实病毒是一种含有核酸的蛋白质，并逐步明确病毒是由一种核酸和蛋白质衣壳组成并逐步明确病毒是由一种核酸和蛋白质衣壳组成 ，非细胞形态的，非细胞形态的分子生物。分子生物。u病毒是一种非细胞形态的专性寄生物，仅含病毒是一种非细胞形态的专性寄生物，仅含有一种核酸有一种核酸(RNA 或或DNA）和蛋白质，必须和蛋白质，必须在活细胞中才能增殖在活细胞中才能增殖 。u病毒粒体有杆状、线状、球状病毒粒体有杆状、线状、球状 3 种。种。u 不同形态的病毒其大小也不同，计量单位不同形态的病毒其大小也不同，计量单位用纳米（用纳米（nm）表示。）表示。病毒是介于生命与非生命之间的一种物质形式，因此我们说它是边缘生命。

5、病毒存在于环境之中，游离于细胞之外时，不能复制，只以一种有机物的物质形式存在。但病毒进入细胞之后，它可以控制细胞，使其听从病毒生命活动需要，表现它的生命形式。因此，病毒是由一个或几个核酸分子组成的病毒是由一个或几个核酸分子组成的基因组，有一层蛋白或脂蛋白保护性外壳，且可在基因组，有一层蛋白或脂蛋白保护性外壳，且可在一定宿主细胞中自我复制的感染性因子一定宿主细胞中自我复制的感染性因子。病毒的生命形式极其经济，因为基因组中的每个核苷酸均有用。病毒最明显的特点是病毒极其自私，复制原料和能量全部来自它所寄生的细胞，并使细胞产生病变。在进化过程中，它会与细胞和平共处，便于更好利用细胞的资源，但是病毒引起

6、的病害常常是突发性的。如人类的肿瘤，往往是多年潜伏，一旦条件适合或受到外界刺激利于病毒的增殖，病毒就会突然致病。然而病毒可以被改造和利用，如基因治疗的在基因工程中用做载体。 HIVSARS二、园艺植物病毒病的危害特点二、园艺植物病毒病的危害特点园艺植物的特点：种类和繁殖方式多样性园艺植物的特点：种类和繁殖方式多样性v蔬菜：一年生为主，种子、块茎、鳞茎；寄主蔬菜：一年生为主，种子、块茎、鳞茎；寄主复杂，媒体传播、种子传播复杂，媒体传播、种子传播v果树：一旦感染终生带毒；无性繁殖系数决定了果树：一旦感染终生带毒；无性繁殖系数决定了病毒传播速度；病毒侵染破坏正常代谢，导致树病毒传播速度；病毒侵染破坏

7、正常代谢，导致树体衰退；体衰退；v表现：削弱生长势，降低产量、品质、价值，表现：削弱生长势，降低产量、品质、价值，严重者导致死亡。严重者导致死亡。园艺植物病毒病的严重性园艺植物病毒病的严重性 据不完全统计，草莓能感染据不完全统计，草莓能感染6262种病毒和类菌质体。核果种病毒和类菌质体。核果类病毒达类病毒达9090多种。马铃薯病毒达多种。马铃薯病毒达3030余种，苹果也有余种，苹果也有3030多种病毒侵染，柑桔有多种病毒侵染，柑桔有2020多种病毒，观赏植物的病毒多种病毒，观赏植物的病毒病达病达100100多种。多种。 症状表现症状表现: 在田间，病株较健株生长矮小且衰弱，叶色淡。病株嫁接口周

8、围肿大。木质部表面产生深褐色凹陷裂沟。v症状表现症状表现: 病叶片上产生淡绿色或浅黄病叶片上产生淡绿色或浅黄色环斑，发生无规律，有时色环斑，发生无规律，有时病斑只发生在主脉或侧脉的病斑只发生在主脉或侧脉的周围。高度感病品种的病叶周围。高度感病品种的病叶往往变形或卷曲。病斑偶尔往往变形或卷曲。病斑偶尔也发生在果实上，但病果不也发生在果实上，但病果不变形果肉组织也无明显损伤。变形果肉组织也无明显损伤。有些品种无明显症状，或仅有淡绿色或黄绿色小斑点组成的轻微有些品种无明显症状，或仅有淡绿色或黄绿色小斑点组成的轻微斑纹。阳光充足的夏季症状明显，而且感病品种的叶片上常出现斑纹。阳光充足的夏季症状明显，而

9、且感病品种的叶片上常出现坏死区域。多雨季节或阳光不充足时，症状轻微。带毒梨树的干坏死区域。多雨季节或阳光不充足时，症状轻微。带毒梨树的干周生长量减少周生长量减少10%，新稍生长量和叶面积减少，新稍生长量和叶面积减少20%，树势衰弱且，树势衰弱且易遭冻害。易遭冻害。水稻矮小病毒花生矮缩病毒枣树病毒病：示病树干部皮层扭曲示皮层内的黑褐色“木刺”番茄条斑型病毒病病果大白菜病毒病又叫孤丁病、抽疯病，苗期发病心叶呈明脉或叶脉失绿，后产生浓淡不均的绿色斑驳或花叶。成株期发病早的，叶片严重皱缩，质硬而脆，常生许多褐色小斑点，叶背主脉上生褐色稍凹陷坏死条状斑，植株明显矮化畸形，不结球或结球松散。甜菜黄化病毒大

10、葱萎缩病毒三、园艺植物病毒病的传播途径及防治三、园艺植物病毒病的传播途径及防治传播途径：传播途径：介体传播：昆虫，线虫，螨虫介体传播：昆虫，线虫，螨虫接触传播：汁液，人为，嫁接接触传播：汁液，人为，嫁接防治：防治：栽培无病毒苗木；栽培无病毒苗木；加强检疫；加强检疫；防治传毒虫媒；防治传毒虫媒；抗病毒基因工程。抗病毒基因工程。四、园艺植物脱毒技术四、园艺植物脱毒技术 脱毒的意义脱毒的意义 应用植物脱毒技术培育无病毒苗可以使品种复应用植物脱毒技术培育无病毒苗可以使品种复壮，增强适应能力和抗逆能力，明显提高作物的产壮，增强适应能力和抗逆能力，明显提高作物的产量和品质。量和品质。脱毒方法脱毒方法 1.

11、 1.茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒 2.2.微体嫁接脱毒微体嫁接脱毒 3.3.热处理脱毒热处理脱毒 4.4.热处理结合茎尖培养脱毒热处理结合茎尖培养脱毒 5. 5.抗病毒药剂脱毒抗病毒药剂脱毒 1.茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒又称为分生组织培养（又称为分生组织培养（meristem culture） v1934年，年，White发现发现TMV在烟草根中的分布是不均匀的，越在烟草根中的分布是不均匀的，越靠根尖区病毒含量越低，在根尖的顶端不含病毒。靠根尖区病毒含量越低，在根尖的顶端不含病毒。v1949年，年，Limasset和和Cornuet茎尖分生组织叶不带病毒。茎尖分生组织叶不带病毒。v1952年，年

12、，Morel和和Martin首先利用茎尖分生组织培养获得了大首先利用茎尖分生组织培养获得了大丽花和马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技丽花和马铃薯无病毒苗，同时建立了茎尖脱毒的组织培养技术体系。术体系。v2001年，年，Ayabe和和Sumi报道利用大蒜茎片生长点培养脱除病报道利用大蒜茎片生长点培养脱除病毒的方法。毒的方法。病毒在植物体内分布不均匀的机理目前还不十分清楚，但根据病病毒在植物体内分布不均匀的机理目前还不十分清楚，但根据病毒及分生组织的特性，学者们提出了一些假说，主要有以下几种：毒及分生组织的特性，学者们提出了一些假说，主要有以下几种：v能量竞争能量竞争 病毒核酸和植物细

13、胞分裂时，DNA合成均需要消耗大量的能量。v传导抑制传导抑制 1966年Quak：病毒传播主要是通过微管束，但分生组织中胞间连丝和微管组织还不健全。v激素抑制激素抑制 1977年，Quak：分生组织中高浓度的生长素和细胞分裂素阻滞了病毒的侵入或抑制了病毒活性。v酶缺乏酶缺乏 1969年StaceSmith认为病毒合成可能需要酶的参与。v抑制因子抑制因子 1976年MartinTanguy认为分生组织中自然存在某种抑制因子。茎尖脱毒培养繁育程序茎尖脱毒培养繁育程序通常茎尖培养脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负相关，而通常茎尖培养脱毒效果的好坏与茎尖大小呈负相关，而培养茎尖成活率的高低则与茎尖的大小呈正

14、相关。培养茎尖成活率的高低则与茎尖的大小呈正相关。 一般切取一般切取 0.20.5mm，带一两个叶原基的茎尖作为，带一两个叶原基的茎尖作为培养材料较好培养材料较好 。 2.微体嫁接脱毒微体嫁接脱毒（micrografting of shoot tip）v微体嫁接是组织培养与嫁接方法相结合来获得无病微体嫁接是组织培养与嫁接方法相结合来获得无病毒苗木的一种新技术。它是将毒苗木的一种新技术。它是将 极小（极小（0.10.2mm)的的茎尖作为接穗茎尖作为接穗 ，嫁接到由试管中培养出来的无菌实，嫁接到由试管中培养出来的无菌实生砧木上生砧木上 ，继续进行试管培养，继续进行试管培养 ，愈合成为完整的植，愈合

15、成为完整的植株株 而达到脱毒的效果。而达到脱毒的效果。 2.微体嫁接脱毒微体嫁接脱毒（micrografting of shoot tip）v影响微体嫁接成活的因素主要是接穗的大小和取样时间。影响微体嫁接成活的因素主要是接穗的大小和取样时间。一般春天从新梢上取材嫁接的成活率显著高于其他季节取一般春天从新梢上取材嫁接的成活率显著高于其他季节取材的成活率。材的成活率。v微体嫁接技术难度较大，不易掌握微体嫁接技术难度较大，不易掌握 ，与实际应用还有，与实际应用还有相当距离。但随着新技术的发展与完善，相当距离。但随着新技术的发展与完善， 微体嫁接技微体嫁接技术也会有很大发展。术也会有很大发展。3、热处

16、理脱毒、热处理脱毒发现：发现：1889 年，印度尼西亚爪哇将患枯萎病的甘蔗放年，印度尼西亚爪哇将患枯萎病的甘蔗放在在 5052 热水中热水中30min，甘蔗就可去病生长良好，甘蔗就可去病生长良好通过热处理（通过热处理（heat treatment），又称温热疗法），又称温热疗法（thermotherapy），可由受侵染的个体得到无病毒植株。），可由受侵染的个体得到无病毒植株。利用植物和病毒的耐热性不同，在高于正常温度的环境条利用植物和病毒的耐热性不同，在高于正常温度的环境条件下，植物组织中的很多病毒受热后可被部分或全部钝化件下，植物组织中的很多病毒受热后可被部分或全部钝化或失去活性，而寄主植物

17、组织很少或不会受到伤害；或在或失去活性，而寄主植物组织很少或不会受到伤害；或在高温条件下，植物的生长加快，病毒的增殖速度跟不上植高温条件下，植物的生长加快，病毒的增殖速度跟不上植物的生长速度而被抛在其后，使植物的新生部分不带病毒。物的生长速度而被抛在其后，使植物的新生部分不带病毒。 热处理的方法热处理的方法v热水浸泡热水浸泡 ： 是将剪下的接穗或种植材料，是将剪下的接穗或种植材料， 在在 5055 5055 的热水中浸泡数分的热水中浸泡数分钟或钟或35 35 温水处理温水处理30-40 h, 30-40 h, 方法简便，但易使材料受损伤，方法简便，但易使材料受损伤， 到到 55 55 时则大多

18、数植物会被杀死。时则大多数植物会被杀死。 该方法适合甘蔗、木本植物和该方法适合甘蔗、木本植物和休眠芽。休眠芽。v 高温空气高温空气 是将旺盛生长的植物在是将旺盛生长的植物在 3540 3540 条件下生长发育，条件下生长发育， 处理时间处理时间的长短，因病毒种类不同可由数分钟到数周不等，热处理之后要的长短，因病毒种类不同可由数分钟到数周不等，热处理之后要立即把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上或进行组培。立即把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上或进行组培。 该方法对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使该方法对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒，又能使寄生植物有较高的存活机会，目前热处理大多采用这

19、种方法寄生植物有较高的存活机会，目前热处理大多采用这种方法 。缺陷： 热处理只对那些球状的病毒 ( 如葡萄扇叶病毒、苹果花叶病毒 ) 或线状的病毒 ( 如马 转薯 X，Y 病毒、康乃馨病毒 ) 有效果，而对杆状病毒 ( 如牛蒡斑驳病毒、千日红病毒 ) 不起作用。v香石竹在香石竹在38384040条件下经两个月处理可除去全条件下经两个月处理可除去全部病毒。部病毒。v菊花在菊花在35353838的条件下处理的条件下处理60d60d可使病毒失可使病毒失活。活。v马铃薯在马铃薯在3737条件下处理条件下处理101020d20d能除去卷叶病能除去卷叶病毒。毒。v柑橘黄化病毒柑橘黄化病毒30304040条

20、件下处理条件下处理7 71212周。周。4 4. .热处理结合茎尖培养或微嫁接技术脱毒热处理结合茎尖培养或微嫁接技术脱毒v将热处理与茎尖分生组织培养结合起来，将热处理与茎尖分生组织培养结合起来，则可以取稍大的茎尖进行培养，这样能够则可以取稍大的茎尖进行培养，这样能够大大提高茎尖的成活率和脱毒率。大大提高茎尖的成活率和脱毒率。5.抗病毒药剂脱毒抗病毒药剂脱毒 v在茎尖培养和原生质体培养中，在茎尖培养和原生质体培养中，在培养基内加用抗在培养基内加用抗病毒醚病毒醚(ribavirin)，能抑制病毒复制。，能抑制病毒复制。v山家弘士山家弘士 (1986)发现抗病毒醚对苹果褪绿叶斑病毒发现抗病毒醚对苹果

21、褪绿叶斑病毒 (ACLSV) 和苹果茎沟病毒和苹果茎沟病毒 (ASGV)，在苹果植株体，在苹果植株体内都有抑制增殖效果。内都有抑制增殖效果。 v目前用此法也不可目前用此法也不可 能脱除所有病毒，如果使用能脱除所有病毒，如果使用不当，药害现象比较严重，不当，药害现象比较严重， 此种脱毒处理还处此种脱毒处理还处于探索阶段。于探索阶段。五五 脱毒苗的鉴定及检测技术脱毒苗的鉴定及检测技术脱毒效果的检测1 1、形态检测法、形态检测法 脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好2 2、指示植物法、指示植物法 指示植物法是利用病毒在其他植物上产生的枯斑和某些指示植物法是利用病毒在其他植

22、物上产生的枯斑和某些病理症状，作为鉴别病毒及病毒种类的标准，也叫枯斑病理症状，作为鉴别病毒及病毒种类的标准，也叫枯斑或空斑测定法。或空斑测定法。 接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物称为指示植物接种某种病毒后能快速表现特有症状的植物称为指示植物（indicator plantindicator plant），又称鉴别寄主。），又称鉴别寄主。2 2、接种方法、接种方法汁液摩擦接种法汁液摩擦接种法嫁接法：小叶嫁接法嫁接法：小叶嫁接法 双重芽嫁接法双重芽嫁接法 双重切接法双重切接法 指示植物直接嫁接法指示植物直接嫁接法v 汁液汁液摩擦接种法摩擦接种法：从被鉴定植物上取：从被鉴定植物上取13g幼叶幼

23、叶 研碎研碎过滤过滤取滤液涂抹于指示植物的叶面上（金刚取滤液涂抹于指示植物的叶面上（金刚砂）砂）保温保温1525 接种后接种后26d 可见症状出现可见症状出现 。 血清学鉴定v植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白( (抗原抗原 antigen)antigen)， 给动物注射后会产生一种相应的免疫球蛋给动物注射后会产生一种相应的免疫球蛋白，称为抗体（白，称为抗体（antibodyantibody）v抗体是动物在外来抗原的剌激下产生的一种免疫球抗体是动物在外来抗原的剌激下产生的一种免疫球蛋白，抗体主要存在于血清中，故含有抗体的血清蛋白，抗体主要存在于血清中，故含

24、有抗体的血清即称为抗血清即称为抗血清 (antiserum) (antiserum) 。v 这种抗原和抗体所引起的凝集或沉淀反应就叫做血清这种抗原和抗体所引起的凝集或沉淀反应就叫做血清反应。反应。v因此，利用已知的抗体与未知的抗原能否特异结合因此，利用已知的抗体与未知的抗原能否特异结合形成抗原形成抗原- -抗体复合物（血清学反应）的情况可以判抗体复合物（血清学反应）的情况可以判断病毒的有无。断病毒的有无。常用血清学鉴定方法常用血清学鉴定方法（1）免疫电镜技术）免疫电镜技术（2）酶联免疫吸附分析）酶联免疫吸附分析（3）直接组织免疫杂交分析）直接组织免疫杂交分析抗原吸附抗原吸附免疫修饰（加入抗体）

25、免疫修饰（加入抗体）反应（染色，酶促反应）反应（染色，酶促反应）洗脱洗脱观察观察电子显微镜鉴定法电子显微镜鉴定法 v现代电子显微镜现代电子显微镜 (electron microscope) (electron microscope) 的分的分辨能力可辨能力可 达达 0.5nm 0.5nm， 因此利用电子显微镜观因此利用电子显微镜观察，察， 比生物学鉴定更直观，而且速度更快。比生物学鉴定更直观，而且速度更快。v对不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法对不表现可见症状的潜伏病毒来说，血清法和电镜法则是惟一可行的鉴定方法和电镜法则是惟一可行的鉴定方法 。v能否观察到病毒，还取决于病毒浓度的高低，能否观

26、察到病毒，还取决于病毒浓度的高低， 浓度低则不易观察到。浓度低则不易观察到。 分子生物学检测法核酸杂交技术（人工标记的病原互补核酸杂交技术（人工标记的病原互补DNA，杂交，显影），杂交，显影）PCR技术技术双链核糖核酸分析双链核糖核酸分析 病毒复制时以单链病毒复制时以单链RNA为模板合成双链为模板合成双链RNA，一般不易被降解。，一般不易被降解。所以一旦植物感染病毒，体内就会存在双链所以一旦植物感染病毒，体内就会存在双链RNA。所以提取待检。所以提取待检测样本的总测样本的总RNA，将，将DNA和单链和单链RNA降解后，凝胶电泳分析样品降解后，凝胶电泳分析样品中是否有双链中是否有双链RNA脱毒苗

27、的保存与繁殖脱毒苗的保存与繁殖原原种原原种：脱毒试管苗出瓶移栽后的苗木被称作原原种脱毒试管苗出瓶移栽后的苗木被称作原原种 (initail stocks)，一般多在科研单位的隔离网室内保一般多在科研单位的隔离网室内保存存 。脱毒原原种苗每年应进行一次病毒检测，发现问脱毒原原种苗每年应进行一次病毒检测，发现问题即淘汰。检测机构要将病毒检测结果报告有关部门。题即淘汰。检测机构要将病毒检测结果报告有关部门。 原种原种：脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无病源和脱毒原原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，分株繁殖的第一代植株为脱毒原种防虫隔离区内，分株繁殖的第一代植株为脱毒原种苗苗 由脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，由脱毒原种苗定植于无土壤线虫、无病源和防虫隔离区内，分株繁殖后代为脱毒生产用苗。分株繁殖后代为脱毒生产用苗。脱毒苗的保存脱毒苗的保存 离体保存离体保存 防虫纱网棚室防虫纱网棚室 隔离区种植隔离区