分子生物学复制

1、目录目录第三篇第三篇基因信息的传递基因信息的传递生物化学与分子生物学教研室孔丽君生物化学与分子生物学教研室孔丽君目录目录目录目录目录目录第十章第十章DNA的生物合成的生物合成( (复制复制) )DNA Biosynthesis，Replication 目录目录复制复制( (replication)是指遗传物质的传代，以母链是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板为模板合成子链合成子链DNA的过程。的过程。复制复制亲代亲代DNA子代子代DNA目录目录目录目录生物化学与分子生物学教研室孔丽君生物化学与分子生物学教研室孔丽君复制的基本规律复制的基本规律Basic Rules of DNA Replic

2、ation 第一节第一节目录目录复制的方式复制的方式半保留复制半保留复制(semi-conservative replication)双向复制双向复制(bidirectional replication)半不连续复制半不连续复制(semi-discontinuous replication) 复制的高保真性复制的高保真性(high fidelity) 目录目录一、半保留复制的实验依据和意义一、半保留复制的实验依据和意义 DNA生物合成时，母链生物合成时，母链DNA解开为两解开为两股单链，各自作为模板股单链，各自作为模板(template)按碱基配对按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞

3、的规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制碱基序列一致。这种复制方式称为方式称为半保留复制。半保留复制。半保留复制的概念半保留复制的概念目录目录AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGG

4、TGACC+母链母链DNA 复制过程中形成复制过程中形成的复制叉的复制叉子代子代DNA 目录目录子链继承母链遗传信息的几种可能方式子链继承母链遗传信息的几种可能方式 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 目录目录半保留复制的证明半保留复制的证明密度梯度实验密度梯度实验细菌可以利用细菌可以利用NH4Cl作氮源合成作氮源合成DNA轻链14N-DNA重链15N-DNA轻、重链DNA混合半保留复制第一代DNA半保留复制第二代DNA半保留复制第三代DNA目录目录按半保留复制方式，子代按半保留复制方式，子代DNA与亲代与亲代DNA A的的碱基序列一致碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗，即子

5、代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的传信息，体现了遗传的保守性保守性。半保留复制的意义半保留复制的意义遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但但不是绝对的不是绝对的。目录目录1、原核生物复制时，、原核生物复制时，DNA从从起始点起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为向相反的复制叉，称为双向复制双向复制。 二、双向复制二、双向复制复制中的放射复制中的放射自显影图象自显影图象目录目录terA环状双链环状双链DNA及复制起始点及复制起始点（ origin）B复制中的两个复制叉复制中的两个复制叉（

6、replication fork）C复制接近终止点复制接近终止点(termination, ter)复制叉复制叉指的是指的是DNA双链分成两双链分成两股各自作为模板，子链沿模板延长形股各自作为模板，子链沿模板延长形成的成的Y字形结构字形结构E.coliorigin目录目录2、真核生物每个染色体有多个起始、真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。点，是多复制子的复制。从一个从一个DNA复制起始点起始的复制起始点起始的DNA复复制区域称为制区域称为复制子复制子(replicon) 。复制子是独立完成复制的功能单位。复制子是独立完成复制的功能单位。 目录目录53oriorioriori53

7、5533553复制子复制子3目录目录真核生物的多复制子复制电镜图真核生物的多复制子复制电镜图目录目录三、复制的半不连续性三、复制的半不连续性3 5 3 5 解链方向解链方向3 5 3 5 领头链领头链(leading strand)随从链随从链(lagging strand)3 目录目录冈崎片段：冈崎片段： (okazaki fragment) 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到射自显影技术，观察到DNA复制中出复制中出现一些现一些不连续的片段不连续的片段，将这些不连续的，将这些不连续的片段称为片段称为冈崎片段冈崎片段。 原核生物原核生物: :

8、 10002000个核苷酸个核苷酸 真核生物真核生物: : 100200个核苷酸个核苷酸目录目录顺着解链方向生成的子链，复制是连续顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为进行的，这股链称为领头链领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为连续复制的链称为随从链随从链。领头链连续复。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的制而随从链不连续复制，就是复制的半不半不连续性连续性。 目录目录第第 二二 节节DNADNA复制的酶学和复制的酶学和拓扑学变化拓扑学变化The

9、 Enzymology of DNA Replication目录目录 参与参与DNA复制的物质复制的物质 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP聚合酶聚合酶(polymerase): 依赖依赖DNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 简写为简写为 DNA-pol模板模板(template) : 解开成单链的解开成单链的DNA母链母链引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次聚合可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子其他的酶和蛋白质因子目录目录一、复制的基本化学反应一、复制的基本化学反应(dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1

10、+ PPi核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键核苷酸和核苷酸之间生成磷酸二酯键目录目录聚合反应机理聚合反应机理3 5 3 5 目录目录 聚合反应的特点聚合反应的特点: 以单链以单链DNA为模板为模板 以以dNTP为原料为原料 引物提供引物提供3-OH 聚合方向为聚合方向为5 3 遵守碱基互补规律遵守碱基互补规律目录目录二、二、DNA聚合酶聚合酶全称：全称：依赖依赖DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)简称：简称：DNA-pol活性：活性：1. 53 的聚合活性的聚合活性2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性目录目录核酸外切酶活性3 5 外切外切酶活性

11、能辨认酶活性能辨认错配的碱基对，错配的碱基对，并将其水解。并将其水解。5 3 外切酶外切酶活性能切除突变活性能切除突变的的 DNA片段，去片段，去除引物。除引物。 目录目录3 5 外切酶活外切酶活性性:能能辨认错配辨认错配的的碱基对，并将其碱基对，并将其水解水解, 即时校读。即时校读。 5 3 外切酶活外切酶活性性:能切除能切除突变突变的的 DNA片段。去除片段。去除起始起始DNA合成所合成所需的需的引物引物。 目录目录（一）原核生物的（一）原核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录功能功能：对复制中的错误进行校读，对复制和对复制中的错误进行校读，对复

12、制和修复中出现的空隙进行填补。修复中出现的空隙进行填补。DNA-pol （109kD）目录目录323个氨基酸个氨基酸小片段小片段5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性大片段大片段/Klenow 片段片段 604个氨基酸个氨基酸DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性N 端端C 端端木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶DNA-pol Klenow片段是实验室合成片段是实验室合成DNA，进行，进行分子生物学研究中常用的工具酶。分子生物学研究中常用的工具酶。 目录目录 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。基因发生突变，细菌依然能存活。 DNA-pol 对模

13、板的特异性不高，即使在已发生对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。损伤的应急状态修复。目录目录功能功能: :是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。 DNA-pol (250kD)目录目录DNA-pol 底物是底物是4种种dNTP催化两面个核苷酸之间形催化两面个核苷酸之间形成磷酸酯键成磷酸酯键不催化两面个游离核苷酸不催化两面个游离核苷酸之间形成磷酸酯键之间形成磷酸酯键以碱基互补关系与模板间以碱基互补关系与模板间形成氢键形成氢键

14、具有外切酶的活性具有外切酶的活性目录目录（二）真核生物的（二）真核生物的DNADNA聚合酶聚合酶DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制参与低保真度的复制 。在复制过程中起校读、修复和填补缺在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。口的作用。在在线粒体线粒体DNA复制中起催化作用。复制中起催化作用。DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目录目录DNADNA聚合酶聚合酶分子量分子量（kDakDa）25025036-3836-38160-300160-300170

15、170256256细胞内定位细胞内定位核核核核线粒体线粒体核核核核5353聚聚合活性合活性有有有有有有有有有有3535外外切活性切活性无无无无有有有有有有持续合成能持续合成能力力中等中等低低高高有有PCNAPCNA时高时高高高功能功能起始引发，起始引发，引物酶活引物酶活性性低保真度的低保真度的复制复制线粒体线粒体DNADNA复制复制延长子链的延长子链的主要酶，解主要酶，解旋酶活性旋酶活性填补空缺，填补空缺，切除修复，切除修复，重组重组真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶目录目录三、复制保真性的酶学依据三、复制保真性的酶学依据复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准复制按照碱基配对规律进行，是

16、遗传信息能准确传代的基本原理。确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：复制保真性的酶学机制：（一）（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读的核酸外切酶活性和及时校读 （二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择目录目录（一）核酸外切酶活性和校读（一）核酸外切酶活性和校读核酸外切酶核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。酶是有方向性的。 目录目录A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。性掺入正

17、确配对的底物。B：碱基配对正确，：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。不表现活性。DNA pol 的校读功能的校读功能目录目录（二）复制的保真性和碱基选择（二）复制的保真性和碱基选择 DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。共价（磷酸二酯键）键的有序形成。 嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型反式构型。 目录目录1. 遵守严格的碱基配对规律；遵守严格的碱基配对规律；2. 聚合酶在复制延长时对碱基的

18、选择功能；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3. 复制出错时复制出错时DNA-pol的及时校读功能。的及时校读功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制复制的保真性至少要依赖三种机制 目录目录四、复制中的分子解链及四、复制中的分子解链及DNA 分子分子拓扑学变化拓扑学变化 DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。解成单链，它才能起模板作用。目录目录（一）多种酶参与（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态解链和稳定单链状态理顺理顺DNA链链拓扑异构酶拓扑异构酶 (gyrA, B)稳定已解开的单链稳定已解开的单链单链单链DNA结合蛋

19、白结合蛋白SSB催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG)运送和协同运送和协同DnaBDnaC (dnaC)解开解开DNA双链双链解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB)辨认起始点辨认起始点DnaA (dnaA)蛋白质（基因）蛋白质（基因）通用名通用名功能功能原核生物复制起始的相关蛋白质原核生物复制起始的相关蛋白质目录目录E. Coli 基因图基因图目目 录录目录目录 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于氢键，使供能，作用于氢键，使DNA双链双链解开成为两条单链解开成为两条单链 引物酶引物酶(primase)复制起始时催化生成复制起始时催化生成RN

20、A引物的酶引物的酶 单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整链的完整 目录目录1010 8 8 局部解链后局部解链后（二）（二）DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA topoisomerase) 改变改变DNA超螺旋状态、理顺超螺旋状态、理顺DNA链链复制过程正超螺旋的形成复制过程正超螺旋的形成目录目录解链过程中正超螺旋的形成解链过程中正超螺旋的形成目目 录录解链过程中解链过程中，DNA分子会过度拧分子会过度拧紧打结缠绕、连环等现象。紧打结缠绕

21、、连环等现象。目录目录拓扑异构酶作用特点拓扑异构酶作用特点既能水解既能水解 、又能连接磷酸二酯键、又能连接磷酸二酯键 拓扑异构酶拓扑异构酶( Topo( Topo ) )拓扑异构酶拓扑异构酶( Topo )分分 类类目录目录拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA双链中双链中一股一股链，使链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，闭切口，DNA变为松弛状态变为松弛状态。反应反应不需不需ATP。拓扑异拓扑异构酶构酶切断切断DNA分子分子两股两股链，断端通过链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。切口旋转使超螺旋松弛。利用利用ATP供能，连接断端，供能，连接断端， DNA分子

22、进入负超螺旋状态。分子进入负超螺旋状态。作用机制作用机制 目录目录五、五、DNA连接酶连接酶连接连接DNA链链3 -OH末端和相邻末端和相邻DNA链链5 -P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的邻的DNA链连接成一条完整的链。链连接成一条完整的链。 DNA连接酶连接酶(DNA ligase)作用方式作用方式连接连接DNA双链中的单链缺口双链中的单链缺口目录目录DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。

23、也是基因工程的重要工具酶之一。DNADNA连接酶的功能：连接酶的功能：目录目录POO-O-OHO5POO-O-O335DNA连接酶连接酶ATPADP5353目目 录录目录目录冈崎片断的连接5 5 DNA Pol-RNA酶水解水解RNA引物留下空隙引物留下空隙填补引物水解后留下的空隙，保留缺口填补引物水解后留下的空隙，保留缺口DNA连接酶连接酶DNA连接酶连接酶ATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶5 5 P形成磷酸二酯键连接片段之间缺口形成磷酸二酯键连接片段之间缺口目录目录提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -P结果结果DNA聚合酶聚合酶引物或延长中的引物或延长中的新链新链游离游离d

24、NTP去去PPi(dNTP)n+1连接酶连接酶复制中不连续的两条单链复制中不连续的两条单链不连续不连续连续链连续链拓扑酶拓扑酶切断、整理后的两链切断、整理后的两链改变拓扑状态改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3 ,5 -磷酸二酯键生成的比较磷酸二酯键生成的比较目录目录第第 三三 节节DNA生物合成过程生物合成过程The Process of DNA Replication目录目录（一）复制的起始（一）复制的起始需要解决两个问题：需要解决两个问题：1. DNA解开成单链解开成单链，提供模板。，提供模板。2. 合成合成引物引物，提供，提供3 -OH末端。末端。一

25、、原核生物的一、原核生物的DNA生物合成生物合成 目录目录E.coli复制起始点复制起始点 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 TGTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串联重复序列串联重复序列 反向重复序列反向重复序列5 3 5 3 1. DNA解链解链目录目录 Dna A Dna B、 Dna CDNA拓扑异构酶拓扑

26、异构酶引物引物酶酶SSB3 5 3 5 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。复制起始区域的复合结构称为引发体。 2. 引发体和引物引发体和引物目录目录目录目录3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短链引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。分子。 引物引物3 HO5引物引物酶酶目录目录（二）复制的延长（二）复制的延长复制的延长指在复制的延长指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。其化学本质是磷酸二酯键的不断

27、生成。 领头链连续复制，随从链不连续复制领头链连续复制，随从链不连续复制目录目录 5 5 3 35 5dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH 33 3DNA-pol目目 录录目录目录目录目录领头链的合成领头链的合成目目 录录领头链的延长领头链的延长目录目录随从链的合成随从链的合成随从链的延长随从链的延长目录目录DNA-polDNA-pol同时合成领头链和随从链同时合成领头链和随从链 目录目录目目 录录目录目录目录目录阶段二阶段二目录目录阶段三阶段三阶段四阶段四目录目录阶段一阶段一阶段二阶段二阶段三阶段三阶段四阶段四目录目录复复制制过过程程简简图图目目 录录目录目录

28、目录目录 原核生物基因是环状原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制，双向复制的复制片段在复制的终止点片段在复制的终止点(ter)处汇合。处汇合。（三）复制的终止：（三）复制的终止：切除引物、填补空缺、连接切口切除引物、填补空缺、连接切口目录目录5 5 5 RNA酶酶OHP5 DNA-pol dNTP5 5 PATP ADP+Pi5 5 DNA连接酶连接酶 随从链上不连续性片段的连接随从链上不连续性片段的连接目录目录目目 录录目录目录目录目录目录目录哺乳动物的哺乳动物的细胞周期细胞周期DNA合成期合成期G1G2SM二、真核生物的二、真核生物的DNA生物合成生物合成 细胞周期（细胞周期（Cell

29、 cycle）指细胞分裂的时相变化。指细胞分裂的时相变化。 体内活细胞周期长短相差悬殊，关键在体内活细胞周期长短相差悬殊，关键在G1进入进入S期。营养良好的培养细胞周期期。营养良好的培养细胞周期约约24小时。小时。目录目录 典型的细胞周期分为典型的细胞周期分为4期：期：G1期（期（DNA合成前期）合成前期）S期（细胞分裂的合成期），合成期（细胞分裂的合成期），合成DNAG2期（期（ G2期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形期主要合成一些与有丝分裂中新细胞形成所必需的物质）成所必需的物质）M期（细胞染色体形成并发生细胞分裂，新细胞在期（细胞染色体形成并发生细胞分裂，新细胞在此期形成）此期形成）一个

30、细胞周期一个细胞周期DNA只复制一次只复制一次,而且是半保留而且是半保留复制复制.目录目录 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制。复制有时序性复制有时序性，即复制子以分组方式激活，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。而不是同步起动。 复制的起始需要复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replication factor, RF)。 增殖细胞核抗原增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear ant

31、igen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。在复制起始和延长中起关键作用。 （一）真核生物复制的起始（一）真核生物复制的起始与原核相似与原核相似目录目录增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在复制起始和延长中起关键作在复制起始和延长中起关键作用。用。PCNA为同源三聚体，具有与为同源三聚体，具有与E.coli DNA 聚聚合酶合酶的的亚基相同的功能和相似的构象，即形亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动成闭合环形的可滑动DNA夹子，在夹子，在RFC的作用下的作用下PCNA结合于引物模板链；并且结合于引

32、物模板链；并且PCNA使使pol获得持续合成能力。获得持续合成能力。PCNA水平也是检验细胞增水平也是检验细胞增殖的重要指标。殖的重要指标。目录目录细胞能否分裂，决定于进入细胞能否分裂，决定于进入S期及期及M期这两个关键点。期这两个关键点。G1S及及G2M的调节，与蛋白激酶活性的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。相制各种复制因子而实施调控作用。相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白(cyclin)，和催化亚基即细胞周期蛋白依，和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶赖激酶(cyclin de

33、pendent kinase，CDK)。 目录目录CDK相匹配的周期蛋白相匹配的周期蛋白作用点作用点CDK2Cyclin D1, D2, D3G1期期Cyclin EG1S期期Cyclin AS期期CDK3和和CDK4Cyclin D1, D2, D3G2期期CDK1（CDC2）Cyclin A, BG2M期期哺乳类动物的周期蛋白和哺乳类动物的周期蛋白和CDK目录目录哺乳类动物细胞内还发现天然抑制哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的的蛋白质，例如锚蛋白蛋白质，例如锚蛋白(ankynin)是是CDK4的特异的特异性抑制物，性抑制物，P21蛋白能抑制多种蛋白能抑制多种CDK。锚蛋白。锚蛋白和和P

34、21蛋白的抑制蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放活化可使细胞周期开放/关闭，关闭，因此被形容为细胞周期的检查点因此被形容为细胞周期的检查点(check point)蛋白。蛋白。 目录目录真核生物复制的特点：真核生物复制的特点：1、不同染色体各自进行复制、不同染色体各自进行复制2、复制速度：是原核的、复制速度：是原核的1/10，但复制起始，但复制起始点多点多,每个染色体有上千个复制子每个染色体有上千个复制子3、引物和冈琦片段小于原核，引物为、引物和冈琦片段小于原核，引物为10个，个，片段片段100200；原核引物十几；原核引物十几几十，几十，片段片段10002000。4、复制起始需要、复制起始需要

35、DNA-Pol （引物酶）、（引物酶）、（解螺旋酶）、拓扑酶、复制因子（解螺旋酶）、拓扑酶、复制因子（ replication factor, RF）、增殖细胞核）、增殖细胞核抗原（抗原（ proliferation cell nuclear antigen, PCNA）参与。）参与。目录目录 5、 DNA复制位于细胞周期的复制位于细胞周期的S期。期。 6、复制有时序性、复制有时序性复制子以分组方式激活而不是同步启动复制子以分组方式激活而不是同步启动转录活性高的转录活性高的DNA在在S期早期就开始复制期早期就开始复制卫星卫星DNA（高度重复序列）、中心体（高度重复序列）、中心体（连接染色体双倍

36、体的部位）、端粒（线（连接染色体双倍体的部位）、端粒（线性染色体两端）在性染色体两端）在S期最后复制期最后复制 7、复制起始点比大肠杆菌起始点、复制起始点比大肠杆菌起始点OriC短短 8、 pol 为线粒体复制酶。为线粒体复制酶。目录目录3 5 5 3 领头链领头链3 5 3 5 亲代亲代DNA随从链随从链引物引物核小体核小体（二）复制的延长（二）复制的延长目录目录 DNA-pol 和和pol 分别兼有解螺旋酶和引物分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。在复制叉及引物生成后，酶活性。在复制叉及引物生成后，DNA-pol 通通过过PCNA的协同作用，逐步取代的协同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引引

37、物的物的3 -OH基础上连续合成领头链。随从链引物基础上连续合成领头链。随从链引物也由也由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA协同，协同，pol 置置换换pol ，继续合成，继续合成DNA子链。子链。 真核生物复制的延长发生真核生物复制的延长发生DNA聚聚合酶合酶/转换转换目录目录 染色体染色体DNA呈线状，复制在末端停止。呈线状，复制在末端停止。 复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。 染色体两端染色体两端DNA子链上最后复制的子链上最后复制的RNA引物，引物，去除后留下空隙。去除后留下空隙。（三）复制的终止：（三）复制的终止：目录目录目

38、录目录目录目录5 3 3 5 5 3 3 5 +5 3 3 3 3 5 5 目录目录 端粒端粒(telomere)指真核生物染色体线性指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。分子末端的结构。功能功能 维持染色体的稳定性维持染色体的稳定性 维持维持DNA复制的完整性复制的完整性结构特点结构特点 由末端单链由末端单链DNA序列和蛋白质构成。序列和蛋白质构成。 末端末端DNA序列是多次重复的富含序列是多次重复的富含G、T碱基碱基的短的短 序列。序列。TTTTGGGGTTTTGGGG目录目录目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)线性线性DNA在复制完成后，其末在复制完成后，其末端由于引物端由于

39、引物RNA的水解而可能出的水解而可能出现缩短。需要在现缩短。需要在端粒酶端粒酶的催化下，的催化下，进行延长反应。进行延长反应。端粒酶参与解决染色体末端复制问题端粒酶参与解决染色体末端复制问题目录目录端粒酶端粒酶(telomerase)端粒酶是一种端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以蛋白质复合体，它可以其其RNA为模板，通过逆为模板，通过逆转录过程对末端转录过程对末端DNA链链进行延长。进行延长。端粒酶的分子结构端粒酶的分子结构目录目录端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) 端粒酶协同蛋白端粒酶协同蛋白(human t

40、elomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) 组成组成目录目录端粒酶端粒酶脱氧核苷酸脱氧核苷酸端粒酶端粒酶RNA目录目录目录目录端粒酶的催端粒酶的催化延长作用化延长作用爬爬行行模模型型目目 录录目录目录端粒酶的爬行模型（动画演示）端粒酶的爬行模型（动画演示）目录目录DNADNA聚合酶复制子链聚合酶复制子链进一步加工进一步加工目目 录录目录目录5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353GTTTTGGGTTTTGG

41、3OH端粒端粒DNA末端末端TGGTTTG3OH1 1、端粒酶靠、端粒酶靠hTRhTR（AnCnAnCn）x x与母链与母链DNADNA端粒结合端粒结合内在模板RNA2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA为模版，逆转录，延长为模版，逆转录，延长DNADNA母链母链3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延长母链，同时模板，再次延长母链，同时DNADNA母链反摺利于下游复制延伸。母链反摺利于下游复制延伸。TGGTTTGG5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353TTTT3OHTGGTTTGGGGGGGGGTTTTGGTTTT4 4、延伸足

42、够长度后端粒酶脱离母链，代之以、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol DNA-Pol 。此时。此时母链母链3 3-OH-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCAAAACAAACCGAC33OH53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGn3HO53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGnnCCCCAAAACCCCAAAAAAAADNA-Pol目录目录5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353GTTTTG

43、GGTTTTGG3OH端粒端粒DNA末端末端TGGTTTG3OH内在模板RNATGGTTTGG5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCA AAACAAACCGAC353TTTT3OHTGGTTTGGGGGGGGGTTTTGGTTTT1 1、端粒酶靠、端粒酶靠hTRhTR（AnCnAnCn）x x与母链与母链DNADNA端粒结合端粒结合2 2、以端粒酶、以端粒酶RNARNA为模版，逆转录，延长为模版，逆转录，延长DNADNA母链母链3 3、端粒酶移位、空出、端粒酶移位、空出RNARNA模板，再次延长母链，同时模板，再次延长母链，同时DNADNA母链反摺利于下游复制延伸。母链反摺利于下游复制延伸

44、。4 4、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以、延伸足够长度后端粒酶脱离母链，代之以DNA-Pol DNA-Pol 。此时。此时母链母链3 3-OH-OH反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。反折，同时作为引物和模板，完成末端双链复制。5端粒酶的端粒酶的RNAACUAAACCCAAAACAAACCGAC33OH53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGn3HO53TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGnnCCCCAAAACCCCAAAAAAAADNA-Pol目录目录目录目录目录目录目录目录目录目录染色体DNA端粒端粒目录目录 “目录目录

45、真核和原核真核和原核DNA细胞复制比较细胞复制比较目录目录第第 四四 节节逆转录和其他复制方式逆转录和其他复制方式Reverse Transcription and Other DNA Replication Ways目录目录 双链双链DNA是大多数生物的遗传物质。某些是大多数生物的遗传物质。某些病毒的遗传物质是病毒的遗传物质是RNA。少数低等生物如。少数低等生物如M13噬菌体，它的感染型只含单链噬菌体，它的感染型只含单链DNA。原。原核生物的质粒，真核生物的线粒体核生物的质粒，真核生物的线粒体DNA，都是染色体外存在的都是染色体外存在的DNA。这些非染色体。这些非染色体基因组，采用特殊的方式

46、进行复制。基因组，采用特殊的方式进行复制。目录目录（一）（一）逆转录逆转录(reverse transcription) 逆转录逆转录酶酶一、逆转录病毒和逆转录酶一、逆转录病毒和逆转录酶 目录目录 RNA病毒在细胞内复制成双链病毒在细胞内复制成双链DNA的的前病毒前病毒(provirus)。前病毒保留了。前病毒保留了RNA病毒全部遗传病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下信息，并可在细胞内独立繁殖。在某些情况下，前病毒基因组通过，前病毒基因组通过基因重组基因重组(recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制 和 表

47、 达 。 这 种 重 组 方 式 称 为制 和 表 达 。 这 种 重 组 方 式 称 为 整 合整 合(integration)。前病毒独立繁殖或整合，都可。前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因。成为致病的原因。 目录目录（二）（二）逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase) 依赖依赖RNA的的DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶为多功能酶，有为多功能酶，有3种活性：种活性：1、以、以RNA为模板的为模板的dNTP聚合活性聚合活性2、水解杂化链上的、水解杂化链上的RNA活性活性RNase活性活性3、以、以DNA为模板的为模板的dNTP聚合活性聚合活性辅助因子：辅助因子

48、：Zn 病毒自身的病毒自身的tRNA为复制的引物为复制的引物+目录目录逆转录的发现发展了中心法则逆转录的发现发展了中心法则逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。中的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同同样兼有遗传信息传代与表达功能。样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注世纪初已注意到的病毒致癌理论。意到的病毒致癌理论。 目录目录逆转录病毒细胞内的逆转录现象逆转录病毒细胞内的逆转录现象RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂杂化双

49、链化双链RNA酶酶单链单链DNA逆转录酶逆转录酶双链双链DNA目录目录逆转录酶逆转录酶 A AA A T T T TAAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解 T T T T分子生物学研究可应用逆分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法的基因的重要方法之一，此法称为称为cDNA法。法。 以以mRNA为模板，经逆转为模板，经逆转录合成的与录合成的与mRNA碱基序列互碱基序列互补的补的DNA链。链。 试管内合成试管内合成cDNAcDNA complementary DNA 目录目录艾艾滋滋病病病病毒毒HIV目录目录目录目

50、录目录目录爱滋病病毒的感染过程目录目录二、逆转录研究的意义二、逆转录研究的意义 逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。的重大发现。 逆转录现象说明：至少在某些生物，逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样同样兼有遗传信息传代与表达功能。兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意世纪初已注意到的病毒致癌理论。到的病毒致癌理论。 目录目录 滚环复制滚环复制(rolling circle replication)三、滚环复制和三、滚环复制和D环复制环复制 是某些低等生物的复制形式，如是某些低

51、等生物的复制形式，如 X174和和M13噬菌体等。噬菌体等。目录目录3 -OH5 -P5 5 5 3 3 3 3 5滚环复制滚环复制5 5 3 3 5 目目 录录目录目录dNTPDNA-pol D环复制环复制(D-loop replication) 是线粒体是线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制的复制形式形式需引物、复制的起始点不在双链需引物、复制的起始点不在双链DNA同一位点同一位点内外环复制有时序差别、内外环复制有时序差别、DNA-polDNA-pol 是催化复制的聚合酶是催化复制的聚合酶目录目录 D-环复制时需合成引物。环复制时需合成引物。mtDNA为双

52、链，第为双链，第一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制一个引物以内环为模板延伸。至第二个复制起始点时，又合成另一个反向引物，以外环起始点时，又合成另一个反向引物，以外环为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链为模板进行反向的延伸。最后完成两个双链环状环状DNA的复制。复制中呈字母的复制。复制中呈字母D形状而得形状而得名。名。 D环复制的特点是复制起始点不在双链环复制的特点是复制起始点不在双链DNA同一位点，内、外环复制有时序差别。同一位点，内、外环复制有时序差别。目录目录第第 五五 节节DNA损伤（突变）与修复损伤（突变）与修复DNA Damage (Mutation) and Repair目录

53、目录 DNA突变具体指个别突变具体指个别dNMP残基以至片段残基以至片段DNA在构成、复制或表型功能的异常变化，在构成、复制或表型功能的异常变化，也称为也称为DNA损伤损伤(DNA damage)。 从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基分子上碱基的改变。的改变。 目录目录遗传物质的结构改变而引起的遗传信息遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为改变，均可称为突变（突变（mutation)。在复制过程中发生的在复制过程中发生的DNA突变称为突变称为DNA损伤损伤(DNA damage)。从分子水平来看，突变就是从分子水平来看，突变就是DNA分子上分子上碱基的改

54、变。碱基的改变。 目录目录一、突变的意义一、突变的意义（一）突变是进化、分化的分子基础（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（二）突变导致基因型改变( (没有表型改变）没有表型改变）（三）突变导致死亡：发生在对生命过程至关（三）突变导致死亡：发生在对生命过程至关重要的基因上重要的基因上（四）突变是某些疾病的发病基础，如血友病（四）突变是某些疾病的发病基础，如血友病凝血因子凝血因子3 3基因突变基因突变 目录目录突变是进化、分化的分子基础突变是进化、分化的分子基础 从长远的生物史看，进化过程是突变的不断从长远的生物史看，进化过程是突变的不断发生所造成的。发生所造成的。 大量的突

55、变都是属于这种类型，只是目前还大量的突变都是属于这种类型，只是目前还未能认识其发生的真正原因，因而名为自发未能认识其发生的真正原因，因而名为自发突变或自然突变突变或自然突变(spontaneous mutation)。目录目录只有基因型改变的突变形成只有基因型改变的突变形成DNA的多态性的多态性 这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简这种突变没有可察觉的表型改变，例如在简并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功并密码子上第三位碱基的改变，蛋白质非功能区段上编码序列的改变等。这些现象也相能区段上编码序列的改变等。这些现象也相当普遍。当普遍。 多态性多态性(polymorphism)一词用来描述个体

56、之一词用来描述个体之间的基因型差别现象。间的基因型差别现象。 目录目录二、多种化学或物理因素可诱发突变二、多种化学或物理因素可诱发突变大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在大量的突变属于自发突变，发生频率只不过在10-9左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，左右。但由于生物基因组庞大，细胞繁殖速度快，因此它的作用是不可低估的。因此它的作用是不可低估的。实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变实验室用来诱发突变，也是生活环境中导致突变的因素，主要有物理和化学因素。的因素，主要有物理和化学因素。 目录目录1. 物理因素物理因素 UV紫外线紫外线(ultra violet, UV)、各种辐

57、射最常见的是胸、各种辐射最常见的是胸腺嘧啶二聚体腺嘧啶二聚体T-T，也可产生，也可产生C-C、C-T目录目录（1）化工原料、化工产品、化工副产品）化工原料、化工产品、化工副产品（2）工业排放物、汽车排放的废气）工业排放物、汽车排放的废气（3）农药、食品防腐剂或添加剂。目前已）农药、食品防腐剂或添加剂。目前已经检出经检出6万多种，而且每年增加超过千种。万多种，而且每年增加超过千种。（4）物质代谢过程中产生的自由基等因素）物质代谢过程中产生的自由基等因素能直接损伤能直接损伤DNA或干扰或干扰DNA的复制过程。的复制过程。2.化学因素化学因素化学诱变剂的来源：化学诱变剂的来源：目录目录常见的化学诱变

58、剂常见的化学诱变剂化合物类别化合物类别作作 用用 点点分子改变分子改变碱基类似物碱基类似物如：如：5-BUA 5-BU G- A - T - G - C -羟胺类（羟胺类（NH2OH）T C- T - A - C - G -亚硝酸盐（亚硝酸盐（NO2）C U- G - C - A - T -烷化剂烷化剂如：氮芥类，如：氮芥类，NitrominsG mGG mGDNA缺失缺失G目录目录三、突变的分子改变类型三、突变的分子改变类型错配错配 (mismatch)缺失缺失 (deletion)插入插入 (insertion)重排重排 (rearrangement)框移框移(frame-shift) 目

59、录目录DNA分子上的碱基错配称分子上的碱基错配称点突变点突变(point mutation)。自发突变和不少化学诱变都能引起自发突变和不少化学诱变都能引起DNA上某一碱基的置换。上某一碱基的置换。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸的改变。点突变发生在基因的编码区，可导致氨基酸的改变。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。 1. 转换转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。或嘧啶变嘌呤。 2. 颠换颠换（一）错配（一）错配目录目录与疾病有关的点突变例子与疾病有关的点突变

60、例子镰型红细胞贫血镰型红细胞贫血基因（编码链基因（编码链 GAGGTG ）HbS = 226GluVal（链）链）目录目录与疾病有关的点突变例子与疾病有关的点突变例子膀胱癌细胞膀胱癌细胞c-rasH基因（编码链基因（编码链GGCGTC）表达产物表达产物12位位GlyVal。膀胱癌细胞膀胱癌细胞c-ras H基因点突变，基因表达产物基因点突变，基因表达产物仅仅12号氨基酸的变异号氨基酸的变异目录目录1949年波林发现镰刀型细胞贫血症（病年波林发现镰刀型细胞贫血症（病人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结人的红血细胞为镰刀形）与血红蛋白结构异常相关。构异常相关。目录目录镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血