常用分子生物学技术 11-7 new

1、Email: Tel: 61648209Southern Medical University南方医科大学基因工程研究所生物化学与分子生物学教研室周珏宇周珏宇 常用分子生物学技术的原理及应用The popular technology in molecular biology: principle and application2一、分子杂交与印迹技术二、PCR技术的原理与应用三、核酸序列分析四、基因文库五、生物大分子相互作用研究技术六、遗传修饰动物模型的建立和应用主 要 内 容3第第 一一 节节分子杂交与印迹技术分子杂交与印迹技术Molecular hybridization & blott

2、ing technology4核酸分子杂交核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA复性过程中，如果把不同复性过程中，如果把不同DNA单链分单链分子放在同一溶液中，或把子放在同一溶液中，或把DNA与与RNA放在一起，放在一起，只要在只要在DNA或或RNA的单链分子之间有一定的的单链分子之间有一定的碱基碱基配对配对关系，就可以在不同的分子之间形成关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双杂化双链链(heteroduplex) 。一、分子杂交与印迹技术的原理5实质是核酸分子的变性与复性过程6核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术是依据是依据DNA双链碱基双链碱基互补、

3、变性和复性互补、变性和复性原理，用已知碱基序原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针检测样本中列的单链核酸片段作为探针检测样本中是否存在与其互补的同源核酸序列是否存在与其互补的同源核酸序列。7杂交分离、变性、转移、固化DNA片段标记核酸探针制备待测核酸样品制备核酸探针分子杂交操作程序预杂交加入标记核酸探针漂洗除去未参与杂交的标记探针检测杂交信号8（一）印迹技术（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因这一技术类似于用吸墨纸吸

4、收纸张上的墨迹，因此称之为此称之为“blotting”，译为印迹技术。，译为印迹技术。 9带有带有放射性核素、生物素或荧光染料放射性核素、生物素或荧光染料标记标记的，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序的，且序列已知的，与目的基因互补的核酸序列被称为列被称为“探针探针”，探针可以与固定在，探针可以与固定在NC膜膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。存在。 （二）探针技术（二）探针技术10二、印迹技术的类别及应用（一）（一）DNA印迹印迹 (Southern Blotting)（二）（二）RNA印迹印迹 (Northern Blotting)（三

5、）蛋白质的印迹（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析、重组质粒和噬菌体的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。11英国人英国人Southern (1975)发 明 ， 将 琼 脂 糖 中 的发 明 ， 将 琼 脂 糖 中 的DNA转移到硝酸纤维素转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上进行膜或尼龙膜上进行DNA分子杂交分析的方法。分子杂交分析的方法。 Southern印迹Edwin Southern12是经典的是经典的RNA分析法，用于组织细胞中总分析法，

6、用于组织细胞中总RNA或或mRNA的定性和定量分析。过程类似的定性和定量分析。过程类似于于Southern blotting。 Northern印迹13Northern印迹分析原理示意图印迹分析原理示意图14Nouthern 印迹检测印迹检测miRNA的表达的表达15蛋白质水平上检测细胞或组织中特定基因的表达活蛋白质水平上检测细胞或组织中特定基因的表达活性的最常用的方法（定性和半定量分析）。性的最常用的方法（定性和半定量分析）。Western印迹16 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS-PAGE分离分离 蛋白质转膜蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗特异抗体（即第一抗体）

7、与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交原）印迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的酶的Ig） 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息后获取免疫印迹信息Western blot基本程序171819辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗可以使加入的化学发光底物发生氧化降解，发射波长为428nm的光，并可通过X光胶片感光记录下来。 20SDS-PAGE purified recombinant human CK2(重组人酪

8、蛋白激酶2) subunit and its Western blotting用已知的特异抗体检测目的基因蛋白重组人酪蛋白激酶2 21三种印迹技术的比较22放射自显影照片23其他：斑点印迹斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交原位杂交 (in situ hybridization)DNA芯片芯片 (DNA chip)24斑点印迹 (dot blotting) 将将RNA或或DNA变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤变性后直接点在尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再用维素膜上，再用放射性或非放射性标记物标记放射性或非放射性标记物标记的寡核苷酸探针与之杂交。的寡核苷酸探针与之杂交。 用途：特定基因的定性分

9、析。用途：特定基因的定性分析。2526原位杂交（in situ hybridization，ISH） 将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交，进而检测特异的DNA或RNA序列。可对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。优点：不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而更能准确地反映组织细胞的功能状态。27小鼠大脑皮层mRNA原位杂交细胞原位杂交28miRNA的原位杂交2930DNA芯片 将多种已知序列的DNA排列在一定大小的固相支持物上用于检测细胞或组织样品中的核酸种类的技术。3132叠加图：绿色代表下调；红色叠加图：绿色代表下调；红色代表上调代表上调 ；黄色无差异。；黄色无差异

10、。正常样品正常样品Cy3标记标记待测样品待测样品Cy5标记标记叠加叠加石奕武，胡维新等：多发性骨髓瘤的基因表达谱分析，石奕武，胡维新等：多发性骨髓瘤的基因表达谱分析，湖南医科大学学报，湖南医科大学学报，2003，28（3）：）：201205331. 芯片的制备 Gene probes（cDNA、DNA）substrate Ready-to-usemicroarrayOligo probesAGCTorarrayer34Sample cellsExtract RNA or DNA2) RT or PCR amplification3) Fluorescent labelingReference

11、cellsSample readycombineLabeled RNA or DNA (Sample )Labeled RNA or DNA (Reference) 2)1)3)1)2)3)2. 基因表达谱双色标记353. 分子杂交1) hybridizeApply sample2) rinse364. 检测分析Laser 1Laser 2Detector 1Detector 2Scanner375. 图 像 处 理Detector 1Detector 2False-color differential image386. 图 像 分 析394041第第 二二 节节 PCR技术的原理与应用技术

12、的原理与应用（Polymerase Chain Reaction，PCR）42聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。431971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”核酸体外扩增最早设想被遗忘原因：（1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物；（2）1970年Smith等发现了II型限制酶， 体外克

13、隆基因已成为可能。44 1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Kary Mullis发明PCR反应，Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人 -珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。4546 1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为的“分子年”，PCR为十大科技发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。

14、47 patent sold by Cetus corp. to La Roche for $300 million depends on thermo-resistant DNA polymerase (e.g. Taq polymerase) and a thermal cycler48The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael SmithLa Jolla, CA, USA Kary B. Mullis

15、 University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studies495 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5

16、 5 5 5 Template DNA一、PCR技术的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 50Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。5130次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量No. ofNo. Amplicon Cycles Copies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,82452u理论扩增率：2n递增（n为循环次数），2530循环，目标DNA可增加109倍。u实际扩增率：()n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75

17、%。u由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106107。u以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。5354PCR反应条件变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C55模板DNA引物Taq DNA聚合酶4种dNTP含Mg2+的缓冲液。PCR的反应体系56 DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、 rRNA、 病毒RNA基因组DNA质粒DNA（一）（一） 模板（模板（template ）57模板模板DNA的来源：的来源： 微生物中提取微生物中提取DNA 从细胞中提取从细胞中提取DNA：血

18、细胞、绒毛、尿样、毛：血细胞、绒毛、尿样、毛 发、精斑、口腔上皮细胞发、精斑、口腔上皮细胞 固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶固定和包埋的组织标本：脱蜡、蛋白酶K消化消化模板模板DNA的浓度：的浓度： 0.12ug/100ul体系体系 PCR产量随模板产量随模板DNA浓度的增加而显著升高浓度的增加而显著升高 模板模板DNA浓度过高导致非特异性产物增加浓度过高导致非特异性产物增加 58（二）（二） 引物（引物（primers） 人工合成的两段寡核人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的与感兴趣区域一端的一条一条DNA模板链互补，模板链互补，另一个引物与感兴趣另一个

19、引物与感兴趣区域另一端的另一条区域另一端的另一条DNA模板链互补模板链互补3355Sense primerAntisense primer59 引物：决定引物：决定PCR反应的特异性反应的特异性 PCR 产物的产物的特异性特异性取决于取决于引物与模板引物与模板DNA互补的程度互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板理论上，只要知道任何一段模板DNA序序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用引物，用 PCR就可将模板就可将模板DNA在体外大在体外大量扩增量扩增60u基本原则是最大限度地提高扩增效率和特基本原则是最大限度地提高扩增效率和特异性，同时尽可能抑制非

20、特异性扩增。异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。引物设计的原则61引物长度：引物长度： 15-30bp，常用，常用20bp左右左右 引物的有效长度不能大于引物的有效长度不能大于 38 bp，否则最适，否则最适 延伸温度会超过延伸温度会超过TaqDNA聚合酶的最适温度聚合酶的最适温度 （74），不能保证），不能保证PCR扩增产物的特异性扩增产物的特异性引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以500bp为宜为宜 特定条件下可扩增长至特定条件下可扩增长至10kb的片段的片段62引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜为宜 G+C太少扩增效果不佳，太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非过多易出现非

21、特异条带特异条带 ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列，尤其嘧啶核苷酸的成串排列，尤其3端不应超过端不应超过3个连续个连续的的G或或C避免引物内部出现二级结构和引物间互补避免引物内部出现二级结构和引物间互补 特别避免特别避免 3端的互补，否则会形成引物二聚端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带体，产生非特异性的扩增条带 6364引物引物 3端的碱基要求严格配对（不能做任何端的碱基要求严格配对（不能做任何修饰）修饰） 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端 碱基不配对而导致碱基不配

22、对而导致PCR失败失败引物引物5端可修饰端可修饰 引物引物5端限定着端限定着PCR产物的长度，但对扩增特产物的长度，但对扩增特 异性影响不大；引物异性影响不大；引物5端碱基可不与模板端碱基可不与模板DNA 互补而呈游离状态；引物互补而呈游离状态；引物5端最多可加端最多可加10个碱个碱 基而对基而对PCR反应无影响反应无影响653限制性内切酶的识别序列限制性内切酶的识别序列启动子序列启动子序列定点突变定点突变探针标记探针标记（放射性元素或非放射性物质，如生物素、地高（放射性元素或非放射性物质，如生物素、地高辛等）。辛等）。66引物的特异性：引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列引物应与

23、核酸序列数据库的其它序列无明显无明显 同源性同源性引物量：引物量： 每条引物的浓度每条引物的浓度0.1 0.5M，以最低引物量，以最低引物量产生所需要的结果为好产生所需要的结果为好引物浓度偏高会引起引物浓度偏高会引起错配错配和和非特异性扩增非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会且可增加引物之间形成二聚体的机会67引物设计软件引物设计软件 Primer Premier 5.0 Oligo Primer express primer 3 MethPrimer68（三）（三） DNA 聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）Thermus aquaticus69n目前有两种 Taq D

24、NA 聚合酶供应 天然酶：从水生嗜热杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成n一个典型的 PCR反应约需酶量1- 2.5U/100 ul体系n浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少7071 特性：特性： 热稳定性：热稳定性：92.5、95、97.5时，半衰期时，半衰期分别为分别为130 min、40 min、5-6 min 延伸效率：延伸效率：75-80时，时，150个核苷酸个核苷酸/s 校正功能：校正功能：Taq DNA聚合酶没有聚合酶没有3-5外切酶活外切酶活性，性，Vent 、Pfu等具有等具有3-5外切酶活性外切酶活性72（四）（四） dNTP 的质量与浓度的质量与浓度 在在P

25、CR反应中，反应中，dNTP应为应为50200M，浓，浓度过低会度过低会降低降低PCR产物量产物量 注意注意4种种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制的浓度要相等（等摩尔配制 ），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（，如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配偏高或偏低），就会引起错配 高浓度的高浓度的dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响浓度下降，影响DNA聚合酶的活性聚合酶的活性 73（五）（五） PCR缓冲液（缓冲液（PCR buffer） 一般组成：一般组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-HCl（室温（室温PH8.3）

26、，），1.5mM MgCl2 附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如子去污剂（如Tween20，浓度，浓度0.05%）二甲亚砜（二甲亚砜（DMSO）74Mg2+浓度 Mg2+对对PCR扩增的扩增的特异性特异性和和产量产量有显著有显著的影响的影响 在一般的在一般的 PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度浓度为为200umol/L时，时，Mg2+浓度为浓度为1.52.0 mmol/L为宜为宜 Mg2+浓度过高，浓度过高，反应特异性降低反应特异性降低，出现，出现非特异扩增，非特异扩增， 浓度过低会浓度过低会降低降低 Taq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性

27、，使反应产物减少，使反应产物减少75二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析76 巢式PCR（nested PCR ） 逆转录PCR（RT-PCR） 原位PCR（in situ PCR） 荧光定量PCR（qPCR）三、几种重要的PCR衍生技术77其他其他PCR技术技术 名名 称称 主主 要要 用用 途途简并引物扩增法简并引物扩增法扩增未知基因片断扩增未知基因片断巢式巢式PCR提高提高PCR敏感性、特异性，可分析突变敏感性、特异性，可分析突变复合复合PCR同时检测多个突变或病原同时检测多个突变或病原反向反

28、向PCR扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变扩增已知序列两侧的未知序列，致产物突变单一特异引物单一特异引物PCR扩增未知基因组扩增未知基因组DNA单侧引物单侧引物PCR通过已知序列扩增未知通过已知序列扩增未知cDNA锚定锚定PCR分析具有不同末端的序列分析具有不同末端的序列增效增效PCR减少引物二聚体，提高减少引物二聚体，提高PCR特异性特异性固着固着PCR有利于产物的分离有利于产物的分离cDNA末端快速扩增末端快速扩增扩增扩增cDNA末端末端定量定量PCR定量定量mRNA或染色体基因或染色体基因原位原位PCR研究表达基因的细胞比例研究表达基因的细胞比例臆断臆断PCR鉴定细菌或遗传作用鉴定细

29、菌或遗传作用通用引物通用引物PCR扩增相关基因或检测相关病原扩增相关基因或检测相关病原78（一）巢式PCR（nested PCR） Two sets of primers are used in two successive PCRs.79原理：先在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA（complementary DNA），再以cDNA为模板进行PCR反应。是一种快速、简便、敏感性极高的检测mRNA表达的方法。（二）逆转录PCR（RT-PCR）808182（三）原位PCR技术 (in situ PCR) 原位PCR技术就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而

30、在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。 保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。是细胞学诊断中一种崭新的检测技术。83细胞或组织固定：经固定和乙醇通透化处理后适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入；PCR扩增细胞内目的片段；原位杂交检测扩增产物。84multidrug resistance associated-protein (mrp) genemultidrugresistanceassociatedprotein85（四）实时PCR技术 (real time PCR) 实时PCR(real-time PCR)技术通过动态监测反应过程中的产物量，消除了产物堆积对

31、定量分析的干扰，亦被称为定量PCR。 两种方法：SYBR green（荧光染料掺入法）和Taqman probe （探针法）。 86p 实时荧光定量PCR常规定量PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行定量 重复性差 半定量实时定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一轮循环的产物进行定量87同一个样品重复同一个样品重复96次次p起点定量与终点定量终点定量起点定量l 起始DNA量是样本中本来的量，更有意义；终点DNA量经过PCR “加工”，不是所需要的数据l 起点定量误差小，终点定量误差大88PCR方程只在指数期成立方程只在指数期成立循环数循环数线性增长期平台期y = x(1+e)n指数增长期

32、指数增长期89p荧光定量PCR技术基本原理 荧光扩增曲线图 Ct值 阈值 标准定量曲线 90 荧光扩增曲线：每个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到荧光扩增曲线。91什么是CT值荧光信号有统计学意义显著增长（即穿过阈值线）时的循环次数从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数半对数图谱半对数图谱线性图谱线性图谱92什么是阈值（threshold）基线范围阈 值标准偏差标准偏差基线信号的标准偏差基线信号的标准偏差 x 10 荧光域值是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 SDcycle 3-15 前15个循环的荧光信号为荧光本底

33、信号93标准定量曲线CT值与值与起始起始DNA浓度的关系浓度的关系CT值lg 起始DNA浓度CT = - k lgX0 + b94与与DNA结合时发光结合时发光游离时不发光游离时不发光 1. SYBR Green I染料法染料法SYBR Green I 是是一种一种DNA小小沟结合染料沟结合染料95在在PCR过程中染料与过程中染料与DNA结合发光结合发光聚合完成聚合完成聚合开始聚合开始96熔解曲线熔解曲线(Dissociation curve) 导数图谱导数图谱 原始数据原始数据 只有染料法才需要做熔解曲线只有染料法才需要做熔解曲线探针法没有必要探针法没有必要总的DNA双螺旋结构降解一半的温度

34、称为熔解温度（Tm），不同序列的DNA，Tm值不同。97染料法小结染料法小结成本低：不需要探针适合初步筛查：先用SYBR筛查，再用探针法熔解曲线：鉴定PCR有无杂带、引物二聚体无模板特异性：不能分辨主带与杂带，是总信号不能做多重检测：每孔只能检测一个目标基因灵敏度低：适合于5000 拷贝以上的基因定量98 TaqMan探针的结构探针的结构 35RQ33553552. 荧光标记探针法荧光标记探针法99TaqMan探针定量原理探针定量原理reverse primerRQforward primer33553551. 聚合probeRQ33553552. 链取代Q33553553. 探针被切断R35

35、53554. 聚合完成QRR = 报告基团报告基团ReporterQ = 淬灭基团淬灭基团Quencher3100当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个两个基团距离足够近基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。 Frster resonance e

36、nergytransfer through space(Frster Ann.Phys. 1948)荧光共振能量转移荧光共振能量转移(FRET)101Taq酶的酶的53外切活性外切活性102TaqMan MGB探针探针 MGB完全配对，有信号完全配对，有信号 MGB一个碱基不配对，没有信号一个碱基不配对，没有信号MGB探针能够分辨探针能够分辨1个碱基的差别个碱基的差别103 TaqMan MGB探针原理探针原理AGGCCTTGAGAGATATRGCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR|QQ(non-fluorescent quenc

37、her) NFQQMGB(minor groove binder)NFQMGBR报告荧光报告荧光非荧光淬灭基团非荧光淬灭基团小沟结合物小沟结合物提高探针提高探针Tm值值104降低背景荧光：MGB探针的淬灭基团NFQ，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。提高Tm值，探针设计更短：MGB修饰基团，可以将探针的Tm值提高10C左右，使MGB探针可比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了成本，也使探针设计成功率大为提高。105两种探针比较两种探针比较TAMRA0.00.20.40.60.81.01.21.40510152025303540Cycle Number RnMGBTAMRA探针：长

38、探针：长38-mer: ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAGMGB探针：长探针：长17-mer:CTGTAAGTAGATATAAC106Loop能和靶序列互补能和靶序列互补Stem是由互补序列组成是由互补序列组成分子信标分子信标（Molecular beacon）3. TaqMan探针的衍生形式探针的衍生形式工作原理工作原理 发夹形的寡聚核苷酸探针发夹形的寡聚核苷酸探针 内部淬灭的荧光团内部淬灭的荧光团107RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标技术108Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC

39、 Red 640FRET ProbesExcitationEmissionTransfer荧光能量传递杂交双探针杂交双探针109探针法小结探针法小结No Blots!No Gels!既灵敏又特异：PCR与分子杂交的结合 双倍放大：PCR放大与荧光放大的结合110111第第 三三 节节核核 酸酸 序序 列列 分分 析析Nucleic acid sequence analysis112分子生物学的三大核心技术DNA序列分析序列分析DNA测序，测序，1977聚合酶链式反应聚合酶链式反应DNA扩增，扩增，1985DNA重组技术重组技术基因克隆，基因克隆，1973113核酸序列分析的基本原理化学裂解法

40、(Maxam-Gilbert法)末端合成终止法 (Sanger法)DNA序列测定是基因诊断最确切的方法。序列测定是基因诊断最确切的方法。114一、化学裂解法(Maxam-Gilbert法)基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。115Maxam-Gilbert化学降解测序法化学降解测序法 116 (Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法)HO P O

41、 P O P O CH2OOOOHOHOHOA, C, G or T13 OH5 双脱氧核苷三磷酸脱去脱去二、DNA链末端合成终止法117117DNA单链模板 末端终止118119120双脱氧末端终止法 读出模板互读出模板互补序列补序列dNTP 凝胶电泳凝胶电泳 较大片段较大片段 较小片段较小片段ddGTPddATPddCTP ddTTP 反应混合物反应混合物Klenow酶酶 未知序列的单链未知序列的单链DNA 读出待测读出待测序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性标记的引物放射性标记的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTG

42、ACTTCGACAA5 3 121122123The Nobel Prize in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA for their contributions concerning the determination of base sequences in nucleic acids Paul BergWalter GilbertFrederick Sanger1/2 of th

43、e prize1/4 of the prize1/4 of the prizeStanford University Stanford, CA, USAHarvard University, Biological Laboratories Cambridge, MA, USAMRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom 124DNA自动测序法设计原理：以Sanger法为基础荧光标记物：不同颜色的荧光分别代表A、G、C、T电泳 电信号 显示125同位素标记到荧光标记，平板电泳到毛细管电泳多色荧光标记毛细管电泳 单色荧光

44、标记平板电泳同位素标记平板电泳A C G TA C GT测序图谱测序图谱T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T126ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP5 TG A A T G A 3ACG CT127ABI 3730 DNA测序仪测序仪128DNA自动测序结果举例129表示一个表示一个SNP位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分位点，该位点出现了双峰，对应的核苷酸分别为别为C和和T，因此该位点为，因此该位点为CT杂合型，如果该位点只有一个杂合型，如果该位点只有一个峰峰C或者或者T，则该位点基因型为，则该位点基因型为CC或或TT纯合型

45、纯合型130目前所用测序技术的缺点1、原理基于DNA链终止法，故测序长度受限，目前为1000 nt左右。2、测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。3、测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。4、测序基于PCR反应，需要引物，并且有些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。131下一代测序技术 又称为二代测序技术，其代表技术为罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer), Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和

46、ABI的SOLiD测序仪(ABI SOLiD sequencer)。132 可实现大规模并行化分析 不需电泳，设备易于微型化 样本和试剂的消耗量降低，降低了测序成本 优势： 测序策略主要基于循环芯片测序法（Cyclic-array sequencing），即制备DNA文库，单分子扩增，在固相载体上形成DNA簇阵列，并行地利用DNA聚合酶或者连接酶进行酶促反应，同时读取反应产生的特异性荧光信号，最终得到超大量的DNA序列信息。 133举例：举例：Solexa测序测序HiSeq 2000134基本流程： 将基因组DNA随机切割成为小片段DNA； 在所获小片段DNA分子的末端连上接头，然后变性得到单

47、链模板文库； 将带接头的单链小片段DNA文库固定于固体表面； 对固定片段进行克隆扩增，从而制成polony芯片。 针对芯片上的DNA，利用聚合酶或连接酶进行一系列循环反应，通过读取碱基连接到DNA链过程中释放出的光学信号而间接确定碱基序列。135 Solexa测序：在一个反应中同时加入4种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS sequencing by synthesis ）。 完成人类基因组草图不同测序仪的比较图136单分子测序技术被称为第三代测序技术单分子测序技术被称为第三代测序技术 主要策略： 通过掺入并检测荧光标记的核苷酸，来实现单分子测序，如单分子实时技术（single molecu

48、le real time technology，SMRT）； 利用DNA聚合酶在DNA合成时的天然化学方式来实现单分子测序； 直接读取单分子DNA序列信息。 137基基 因因 文文 库库Gene Library第第 四四 节节138基因组DNA文库 (genomic DNA library)cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。139一、基因组DNA文库基因组DNA文库是指生物的基因组DNA的信息（包括所有的编码区和非编码区）以DNA片段形式贮存的克隆群体。 用于构建基因组文库的载体有 噬菌体、粘粒和

49、酵母人工染色体等。140cDNA文库是包含某一组织细胞在一定条件下所表达的全部mRNA经逆转录而合成的cDNA序列的克隆群体，它以cDNA片段的形式贮存着该组织细胞的基因表达信息。 二、cDNA文库141142第五节第五节 生物大分子相互作用生物大分子相互作用研究技术研究技术The method of Protein-protein and Protein-DNA intraction143 酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等一、蛋白质相互作用研究技术144标签融合蛋白结合实验是一个基于亲和色谱原理的分析蛋白质体外直接相互作用的

50、方法。（一）标签蛋白沉淀标签融合蛋白结合实验主要用于证明两种蛋白分子是否存在直接物理结合、分析两种分子结合的具体结构部位及筛选细胞内与融合蛋白相结合的未知分子。 145标签融合蛋白沉淀实验流程示意图146（二）免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 是以抗体和抗原间专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 原理：如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 147实验流程示意图148缺点为：

51、1. 可能检测不到低亲和力和瞬间的Pr-Pr相互作用2. 两种Pr的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；3. 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 149（三）酵母双杂交技术的基本原理和用途150酵母转录因子（Gal 4）与BD-fusion -诱饵（bait）与AD-fusion -猎物或靶蛋白（prey or target protein）报告基因（reporter gene） -Lac Z（编码-半乳糖苷酶）检验这两种蛋白表达后能否激活酵母中的报告基因。151ADYADYXDNA-BDGAL4

52、UASPromoterlacZ reporter genetranscriptionGAL4 UASPromoterlacZ reporter geneGAL4 UASPromoterlacZ reporter geneXDNA-BD X-Gal是-半乳糖苷酶(-galactosidase)的显色底物，在-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物，所以可以轻易的检测出LacZ基因的表达。 152n 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“

53、诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因的表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。153或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)，最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。二、DNA-蛋白质相互作用分析技术（一）电泳迁移率变动测定（EMSA）154细胞蛋白质提取物标记的DNA片段蛋白质与DNA结合蛋白质-DNA复合物电泳迁移滞后凝胶电泳显影滞后条带表明DNA是与蛋白质结合的区域只能确定只能确定DNA序列中含有蛋序列中含有蛋白结合位点白结合位点n 凝胶迁移实验结果示意图155染 色 质 免 疫 沉 淀 技 术 ( c h r o m a t i n