环境工程微生物学第三章污染物的生物效应检测

1、第三章 污染物的生物效应检测本章将讨论以下内容生物测试及方式一般毒性试验生物的分子和细胞水平检测生物致突变、致畸和致癌效应检测微宇宙法3.1 生物测试及方式生物测试（Bioassay）的概念： 指系统地利用生物的反应生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。 注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。 注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。 例如：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及

2、不利的浓度或强度；污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放浓度等。生物测试的方式短期生物测试（Short Term Bioassays） 主要用于测定LC50、IC50、EC50，用来快速估计污染物的毒性，评定几种不同毒物或废物对某种生物的相对毒性或评定不同生物对不同条件如温度、pH的相对敏感性等。多数采用静止式。中期生物测试（Intermediate Term Bioassays） 时间为8d到90d，多数情况下为流动式。长期生物测试（Long Term Bioassays） 包括全部生活史的生物测试（Complete Lifecycle

3、 Bioassays）和部分生活史的生物测试（ Partial Lifecycle Bioassays ） 目的是要测定出在持续情况下不造成有害效应的毒物最大浓度或最大允许毒物浓度（MATC） 只能采用流动式，要保证试验的环境条件和自然界的季节变化相符合。受试生物的选择影响生物测试结果的因素 受试生物 试验条件 实验室差异生物测试的标准化3.2 一般毒性试验基本概念毒物（Toxicant）的概念 毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒剂量时才是毒物。中毒（Intoxication） 中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。毒性（Toxicity）

4、指一种物质引起机体损伤的能力。毒性作用或毒效应（Toxic Effect） 效应（效应（Effect） 也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产也称为作用，指接触一定剂量化学物后，使机体产生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变生的生物学改变。效应是对个体而言的，这种改变可用一定的计量单位表示。可用一定的计量单位表示。反应（反应（Response） 指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一指接触一定剂量化学物后，产生某种效应并达到一定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体定强度的个体在群体中所占的比例。反应是对群体而言的，用百分率或比值来表示，如发病率、死亡而言的，用百分率或比

5、值来表示，如发病率、死亡率等。率等。剂量效应关系和剂量反应关系剂量效应关系和剂量反应关系 以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表以剂量为横坐标，以表示效应强度的计算单位或表示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到示反应的百分率或比值为纵坐标绘制散点图所得到的曲线，即为剂量效应关系和剂量反应关系曲的曲线，即为剂量效应关系和剂量反应关系曲线。线。 不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量不同的化学物或同一化学物在不同条件下，其剂量与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的与效应或反应的相关关系不同，可呈现不同类型的曲线。（见图）曲线。（见图）剂量效应关系和剂量反应关系曲线图剂量10

6、050反应强度（）图31剂量反应曲线（直线型）剂量10050死亡率（）图32 剂量反应曲线（抛物线型）对数剂量10050死亡率（）图33 剂量反应曲线（S形线型）死亡率（概率单位）对数剂量10050图34 剂量反应曲线毒性试验常用参数毒性试验常用参数致死剂量或致死浓度（致死剂量或致死浓度（Lethal Dose， Lethal Concentration） 绝对致死剂量或致死浓度（绝对致死剂量或致死浓度（LD100、LC100） 半数致死剂量或浓度（半数致死剂量或浓度（LD50、LC50） 最小致死剂量或浓度（最小致死剂量或浓度（MLD、MLC） 最大耐受剂量或浓度（最大耐受剂量或浓度（LD0

7、、LC0 ）最大无作用剂量（最大无作用剂量（Maximum Noeffect Level） 化学物在一定时间内，按一定方式与机体接触，按化学物在一定时间内，按一定方式与机体接触，按一定的检测方式或观察指标，不能观察到任何损害一定的检测方式或观察指标，不能观察到任何损害作用的最高剂量。作用的最高剂量。 每日容许摄入量（每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake） 最高容许浓度（最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）最小有作用剂量最小有作用剂量 化学物能使机体发生某种异常变化所需最小剂量，即能化学物能使机体发生某种异常变化所需最小剂量，即

8、能使机体开始出现毒性反应的最低剂量，又称中毒阈剂量。使机体开始出现毒性反应的最低剂量，又称中毒阈剂量。毒作用带毒作用带急性毒作用带急性毒作用带=半数致死量半数致死量/急性毒性最小有作用剂量急性毒性最小有作用剂量慢性毒作用带慢性毒作用带=急性毒性最小有作用剂量急性毒性最小有作用剂量/慢性毒性最慢性毒性最 小有作用剂量小有作用剂量半数效应浓度（半数效应浓度（EC50）和半数抑制浓度（）和半数抑制浓度（IC50）急性毒性试验（急性毒性试验（Acute Toxicity Test）急性毒性试验（急性毒性试验（Acute Toxicity Test） 研究化学物质大剂量一次染毒或研究化学物质大剂量一次染

9、毒或24小时内多次染毒小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。动物所引起的毒性的试验。 其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。急性毒性试验类型急性毒性试验类型 哺乳动物急性毒性试验哺乳动物急性毒性试验 水生生物急性毒性试验水生生物急性毒性试验 蚯蚓急性毒性试验蚯蚓急性毒性试验动物急性毒性试验（动物急性毒性试验（1）按试验要求选择受试生物按试验要求选择受试生物 常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后标记编号

10、并随机分组。动物预先观察几天后标记编号并随机分组。预备试验和确定剂量组预备试验和确定剂量组 选用少量动物进行预备试验，找出引起动物选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90（或全部）死亡的剂量和引起动物（或全部）死亡的剂量和引起动物10死亡（或不死亡（或不死亡）的剂量。死亡）的剂量。 在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（一般等比级数插入若干个中间剂量（一般46组），从组），从而确定正式试验的剂量组。而确定正式试验的剂量组。染毒方式和受试物的配制染毒方式和受试物的配制 一般用灌胃法和人工熏气法。一般用灌胃法和人工熏气

11、法。 受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度。然后依次稀释到所需浓度。动物急性毒性试验（动物急性毒性试验（2）观察指标观察指标 中毒症状：一般观察中毒症状：一般观察2448小时，最好观察到绝大小时，最好观察到绝大多数动物出现典型中毒症状。多数动物出现典型中毒症状。 动物死亡数目和死亡时间动物死亡数目和死亡时间 病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。确定半数致死量（确定半数致死量（

12、LD50）试验结果分析试验结果分析 LD50值越小，毒性越大。值越小，毒性越大。 急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映其毒性。性，而不能全面反映其毒性。 由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表示毒性也不一致，故表示LD50应注释明动物种类和染应注释明动物种类和染毒方式。毒方式。亚慢性毒性试验和慢性毒性试验亚慢性毒性试验和慢性毒性试验亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验 在相当于动物生命周期的在相当于动物生命周期的1/301/20的时间内使动的时间内使动物每日或反复多

13、次接触受试物的毒性试验。物每日或反复多次接触受试物的毒性试验。慢性毒性试验慢性毒性试验 以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触观察以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触观察试验动物所产生的生物学效应的毒性试验。试验动物所产生的生物学效应的毒性试验。 低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次与机体低于中毒阈剂量的外来化合物，反复多次与机体持续接触，经一定时间后使机体呈现明显的中毒持续接触，经一定时间后使机体呈现明显的中毒表现，即为蓄积毒性作用。表现，即为蓄积毒性作用。 蓄积系数法（蓄积系数法（Cumulative Coefficient Method）：）：用来评价环境污染物蓄积作用的方法。用来评价

14、环境污染物蓄积作用的方法。 蓄积系数蓄积系数K生物半减期生物半减期T50(1)50(n)LDLD21212lglglg)(yytt蓄积毒性试验蓄积毒性试验3.3 生物的分子和细胞水平检测生物的分子和细胞水平检测加合物的测定加合物的测定 DNA加合物的测定加合物的测定 蛋白加合物的测定蛋白加合物的测定一般代谢酶的活性测定一般代谢酶的活性测定 乙酰胆碱酯酶乙酰胆碱酯酶 腺三磷酶腺三磷酶解毒系统酶类诱导作用的检测解毒系统酶类诱导作用的检测 混合功能氧化酶的诱导作用混合功能氧化酶的诱导作用 谷胱甘肽硫转移酶谷胱甘肽硫转移酶抗氧化防御系统检测抗氧化防御系统检测 过氧化氢酶过氧化氢酶 谷胱甘肽过氧化酶谷胱

15、甘肽过氧化酶3.4 生物致突变、致畸和致癌效应检测生物致突变、致畸和致癌效应检测3.4.1致突变试验致突变试验致突变试验的目的致突变试验的目的 致突变试验的目的是为了检查受试物对机体遗传过致突变试验的目的是为了检查受试物对机体遗传过程有无影响的方法。程有无影响的方法。致突变试验方法致突变试验方法 基因突变试验，例如基因突变试验，例如Ames试验，下文以鼠伤寒沙试验，下文以鼠伤寒沙门氏菌门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法为例介绍。哺乳动物微粒体酶试验法为例介绍。 染色体畸变试验染色体畸变试验 DNA损伤试验损伤试验Ames试验试验Ames试验原理试验原理 同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接

16、同一种微生物的营养缺陷型突变型菌株与受试物接触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生触，若此化学物质具有致突变性，可使突变型微生物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种物再发生一次突变，重新成为野生型微生物。这种突变叫做回复突变。突变叫做回复突变。鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法哺乳动物微粒体酶试验法 方法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活方法原理：在动物体外将待测物经肝微粒体酶系活化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由化后，检测其所诱发的沙门氏菌回变菌落数，即由不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（不能自行合成组氨酸的营养缺陷型突变菌株（his），回

17、复为能自行合成组氨酸的（），回复为能自行合成组氨酸的（his）菌落数。）菌落数。 突变率诱发回复突变菌落数突变率诱发回复突变菌落数 / 自发回复突变的菌自发回复突变的菌落数（对照）落数（对照） 当突变率大于当突变率大于2.0时，为阳性结果。时，为阳性结果。染色体畸变实验染色体畸变实验试验原理试验原理 利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作用后，染色体发生数目和结构改变的情况。可在体细用后，染色体发生数目和结构改变的情况。可在体细胞，亦可在生殖细胞中进行；体内体外皆可进行。胞，亦可在生殖细胞中进行；体内体外皆可进行。具体方法见教材具体方法见教

18、材微核试验微核试验微核是由染色单体或染色体的无着丝点片段或因仿锤微核是由染色单体或染色体的无着丝点片段或因仿锤体受伤而失去的整个染色体，在分裂后期，仍留在细体受伤而失去的整个染色体，在分裂后期，仍留在细胞质中，或因核膜受损后和物质向外突出延伸形成的胞质中，或因核膜受损后和物质向外突出延伸形成的小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小而称微核。小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小而称微核。一切进行分裂的细胞，在染色体断裂剂的作用下均能一切进行分裂的细胞，在染色体断裂剂的作用下均能产生微核，因此可用微核率的变化来检测诱变物。产生微核，因此可用微核率的变化来检测诱变物。3.4.2 致畸效应致畸效应致畸作

19、用的毒理学特点致畸作用的毒理学特点 胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而呈现不同的敏感性。呈现不同的敏感性。 种属差异较为明显。种属差异较为明显。化学致畸作用机理化学致畸作用机理 突变引起胚胎发育异常；突变引起胚胎发育异常； 对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制； 母体正常代谢过程被破坏；母体正常代谢过程被破坏； 细胞分裂过程的障碍细胞分裂过程的障碍致畸试验致畸试验 致畸试验的目的检测环境污染物能否通过妊娠母体引致畸试验的目的检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。起胚胎畸形。 一般试验动物要求其

20、对化学物质的代谢过程与人相似，一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。如家兔、大鼠、小鼠等。致畸作用的评价致畸作用的评价 注意与自然变异区分；注意与自然变异区分； 注意种属差异；注意种属差异； 注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。3.4.3 致癌效应致癌效应细胞癌变学说细胞癌变学说体细胞突变、分化障碍、癌基因体细胞突变、分化障碍、癌基因癌变过程癌变过程 引发阶段引发阶段 促进阶段促进阶段 浸润和转移阶段浸润和转

21、移阶段致癌试验致癌试验 致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。 短期筛检方法短期筛检方法 长期动物诱癌试验长期动物诱癌试验3.5 微宇宙法微宇宙法微宇宙（微宇宙（Microcosm） 是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系统法。可分为自然微宇宙和人工微宇宙或分为水生统法。可分为自然微宇宙和人工微宇宙或分为水生微宇宙和陆生微宇宙。微宇宙和陆

22、生微宇宙。标准化水生微宇宙标准化水生微宇宙 用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。态系统的影响。 试验时间试验时间64天，容器为天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验生物的玻璃广口瓶，试验生物包括包括10种藻、种藻、4种无脊椎动物、种无脊椎动物、1种细菌。对温度、种细菌。对温度、光照强度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。值等理化参数均有具体要求。烧杯水生微宇宙烧杯水生微宇宙 试验时间试验时间1214周，容器为周，容器为1L的玻璃广口瓶，试验的玻璃广口瓶，试验生物包括生物包括4种藻、种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、光照强度、动物。对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具值等