产酶微生物的分离与应用

1、产酶微生物的分离与应用摘要：介绍了环境中产酶微生物尤其是产纤维素酶和漆酶的真菌和细菌种类，并将产酶细菌和真菌的做了对比，阐述了从环境中分离产酶微生物的方法及菌株和产物的鉴定方法。以及特别罗列了纤维素酶在制浆造纸、饲料工业、污水治理、纺织洗涤、食品和堆肥等领域的应用情况。最后，展望了酶的应用领域和未来研究方向。关键词：产纤维素酶微生物；纤维素酶；菌株分离；菌株鉴定；酶活测定；纤维素酶应用领域SeparationandapplicationofenzymeproducingmicroorganismsYangFeng-ping(Collegeoflifescience,NanjingNormalU

2、niversity)Abstract:Thispaperintroducestheenzymeproducingmicroorganismintheenvironmentespeciallyspeciesoffungiandbacteriaproducingcellulaseandlaccase,andtheenzymeproducingbacteriaandfungiwerecompared,expoundsthemethodofisolationandidentificationmethodsofenzymeproducingmicrofloraandstrainsfromtheenvir

3、onmentandproduct.Andspecialliststheapplicationofcellulaseinpulpingandpapermaking,feedindustry,sewagetreatment,textilewashing,foodandcompostetc.Finally,prospectsofthefieldofenzymeandfutureresearch.Keywords:cellulaseproducingmicroorganisms;cellulase;Strainsisolated;strainidentificatio-n;enzymeactivity

4、determination;cellulaseapplicationfield自然界中蕴藏着巨大的微生物资源，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌株。土壤和海水这两大类资源宝库的开发具有重要意义。我们可以从土壤、腐木筛选相应的产酶微生物，从污水中筛选各种能够产生分解糖类、脂类、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香物质、有机磷农

5、药、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物1。在极端环境可筛选嗜热微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、耐高压微生物等，并开发极端微生物酶品种。进入21世纪以来，各国已在生物产业研究中投入了巨大的财力和科研力量。随着能源、资源和环境问题的日趋严重，生物资源利用已被全球广泛重视，成为世界各国的战略性研究重点。在自然界中，纤维素类物质是最廉价、最丰富的一类可再生资源，是人类社会赖以生存的基本物质来源。全世界植物体生成量每年高达1500亿t干物质，其中有50%以上为纤维素和半纤维素2。采用生物酶催化技术可将农作物、树木和其他植物及其残体、畜禽粪便、有机废弃物等生物质转化为工业原料，达到合理、可

6、循环利用自然生物资源的目的。担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝抱纲(Hyphomycets)和子囊菌亚门(Ascomycotina)的部分真菌都具有很强的产生纤维素酶和漆酶的能力，备受生化工业领域的关注。其中，白腐菌、褐腐菌和软腐菌是自然界中降解木材的主要真菌3。在过去的30多年里，有关白腐菌的研究主要集中在木素降解酶系方面；有关软腐菌的研究则集中在纤维素降解酶系方面；而有关褐腐菌的研究主要集中在降解木质纤维素机制方面。其中，研究最多的为黄抱原毛平革菌(Phanerochaetechrysospo

7、rium)及其所产生的木素过氧化物酶(Ligninperoxidase，简称LiP)和锰过氧化(Mn-dependentperoxidase，简称MnP)及漆酶对芳香化合物的降解能力4。纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸等众多工业领域具有广泛的应用价值。按照酶的作用特性可将纤维素酶分为碱性纤维素酶和酸性纤维素酶2大类5。目前，很多能够产生纤维素酶和漆酶的生物资源尚未得到充分的开发和利用，鉴于此，笔者简述了自然界中的产酶微生物及其应用领域。1 产酶微生物1.1 产酶真菌担子菌、子囊菌和半知菌是产生纤维素酶和漆酶的主要菌种，虽然不同菌种产生的酶和作用底物具有差异，使用目的也不同，但其所

8、产酶服务人类的目的是相同的，即提高自然界现有资源的利用率。目前，已研究过的产酶微生物有6：1.1.11担子菌黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、毛云芝菌、粗毛盖菌、三色革裥菌、射脉菌、凤尾菇、糙皮侧耳、朱红密孔菌、血红栓菌、多孔菌、冬拟多孔菌、层孔菌、豹斑革耳、偏肿拟栓菌、密粘褶、硫色绚孔菌、茯苓、卧孔菌、灵芝、蜜环菌、双孢菇、从孢薪菇、灰盖鬼伞、金针菇、平菇、糙皮侧耳、茶薪菇、洁丽香菇、香菇。1.1.2半知菌腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、黑曲霉、构巢曲霉、绳状青霉、变幻青霉、灰腐质霉、细粘束孢霉。1.1.3子囊菌长喙壳、嗜热毛壳菌、疣孢漆斑菌、嗜热子囊菌。真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性

9、偏酸条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常为胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法可较容易地得到无细胞酶制品。目前，木霉、里氏木霉和黑曲霉，是生产饲用纤维素酶的主要真菌，也是公认的安全微生物，不产生毒素、产量高、酶系全、活性高、较稳定，是应用最广的纤维素酶生产菌。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，均属于蓝色多铜氧化酶家族。漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌，少数昆虫和细菌中分泌漆酶的真菌主要为担子菌亚门的白腐真菌。1.2 产酶细菌纤维素分解性细菌广泛存在于腐植土、木材、枯枝落叶和草、木本植物体内，又分为好氧性细菌和厌氧性细菌。好氧性细菌如纤维单胞菌

10、属、纤维弧菌属、噬胞菌属等可分解纤维素；而厌氧条件下纤维素分解过程中，一些厌氧性的芽孢梭菌属的细菌起到了重要作用。此外，枯草杆菌、假单孢杆菌和纤维单孢菌可产生胞外内切纤维素酶7。2 真菌和细菌产生酶的差异细菌的纤维素酶存在于细胞内，当纤维素与细胞接触时才能被分解，这种酶不易从培养基中提取出来。真菌的纤维素酶为胞外酶，可分泌到细胞体外进入培养介质中，容易被提取，可制成酶制剂，在各种酶解生产中广泛使用。真菌和细菌纤维素酶的纤维素结合结构域(CelluloseBindingDomain简称CBD)的三维结构不同，真菌CBD由3336个氨基酸组成，具有高度同源性,而细菌CBD由100T10个氨基酸组成

11、，同源性较低。真菌外切酶的CBD结构形状呈/楔型0，一面亲水，另一面疏水。真菌纤维素酶合成后分泌到胞外，其对纤维素的降解是内、外切酶之间的协同作用。而细菌(枯草杆菌、假单孢杆菌、纤维单孢菌)可产生胞外内切纤维素酶，但无外切纤维素酶的形成。通常，细菌纤维素酶的降解效率低于真菌。细菌纤维素酶产量少、活性低、酶系单一，不能分泌到胞外。丝状真菌具有诸多优点：1产生纤维素酶为胞外酶，便于分离和提取；产酶效率高，产生纤维素酶的酶系结构较合理，相互间可发生强烈的协同作用；可同时产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。大部分真菌产酸性纤维素酶，有利于在畜禽胃肠道内发挥作用，所以目前饲用纤维素酶大多来源于真菌9。

12、试验结果表明，由真菌和细菌组成的混合菌分解纤维素的能力明显强于其中任何一种单一菌株。3 产酶微生物的分离鉴定3.1采样用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取525cm处的土样1025g,装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在1030cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件10。一般样品取回后应马上分离，如果不能及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。3.1.1 土壤有机质含量和通气状况525cm土层，适合微生物生长，每克土中含菌数约几十万到几十亿个。酵母菌分布土层最浅，约510cm，霉菌和好氧芽抱杆菌也分布在浅土层。3.1.2 地理

13、条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。3.1.3 土壤酸碱度和植被状况偏碱土壤环境，适合于细菌、放线菌生长。偏酸的土壤环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。植物根部的分泌物有所不同，即植被对微生物分布也有一定的影响。如葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多11。3.1.4 季节条件不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。由于气候条件在南方秋季采土样最为理想。3.1.5 根据微生物营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。微生物的营养需

14、求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。森林土富含纤维素，适合纤维素酶产生菌的生长。3.1.6 根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火上爆发处及北方的堆肥中采样；3.2 富集培养富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制12。富集产纤维

15、素酶的菌时就需要一纤维素为唯一碳源富集纤维素降解菌。3.3 初筛通常是将分离出的菌种移植在一定组分的培养基上，此培养基成分需有筛选作用，用固体或液体培养基进行培养，鉴定培养的是否为目标菌。鉴别的方法常用有四类，分别是透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑制圈法。筛选纤维素降解菌时一般在培养基中加入刚果红，这样当所培养的菌降解了培养基中的纤维素时就会在培养基上形成透明圈13。3.4 复筛为了从初筛得到的微生物中筛选高产菌株需要对每一个菌株，用接近于生产的培养条件进行复筛，再测定培养物的酶活力。复筛时一般选用1-2种培养基，在固定培养条件下对每一个菌株进行复筛。菌株多时对每一个菌株做一份实验，从中择优汰

16、劣。3.5菌株鉴定和产物鉴定3.5.1 菌落特征观察将菌株接种在适宜培养基上培养，之后连续观察上面的菌株生长过程中菌落的表面平坦或是突出，边缘粗糙或整齐，质地均均匀与否，正反面颜色是否相同，气味的有无及味道如何，菌落形状和大小及菌株个体形态等特征14。然后根据真菌鉴定手册或伯杰氏细菌鉴定手册进行分析鉴定。3.5.2分子生物学鉴定对细菌菌株的16SrRNA真菌菌株的18SrRNA序列进行测序，并同GenBank中序列进行比对.确定未知种与同属种之间的亲缘关系。3.5.3 产物酶的酶活测定酶活力测定常用的方法有终点法和动力学方法。动力学方法包括比色法、量气法、滴定法、分光光度法、放射测量法、酶偶联

17、分析。其中分光光度法最常用，几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。它是利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。纤维素酶是一组酶的总称包括：滤纸酶、0-葡聚糖苷酶、内切葡聚糖(CMC)酶、外切葡聚(CBH)酶15。所以测定纤维素酶的活力需要测定这四种酶的酶活。4.酶的应用领域以纤维素酶为例白腐菌降解机制复杂，技术难度较大。到目前为止，白腐菌的应用研究主要集中在用过氧化物酶系预处理某些原料降低工业能耗，实现清洁生产，降解污染物等方面。4.1 制浆造纸白腐菌用于生物制浆主要是直接用菌丝体或经提取后的酶降解木质素，在处理牛皮纸浆过程中取得较好效果。漆酶是潜在的生

18、物纸浆漂白剂16。传统的氯气漂白工艺可产生有毒化合物造成环境污染，而用漆酶对纸浆进行漂白可克服这些缺点。此外，漆酶还可用于造纸工业的纸浆生产。传统的纸浆是用烧碱或硫酸盐高温煮蒸原料，除去木质素制成的，这不仅使得部分纤维素和半纤维素降解，影响纸浆得率，而且严重污染环境。采用漆酶选择性降解木质素生产纸浆，可节约设备和能耗，缩短纸浆生产周期，降低生产成本，给造纸工业带来良好的经济和社会效益。近年来，研究发现白腐菌对纸浆漂白废水具有明显的脱色和消除毒性的作用，其原因在于白腐菌可进一步降解此类废水中的氯化木素降解产物，而氯化木素和氧化物则是含氯漂白废水毒性和颜色的主要来源。4.2 饲料工业利用白腐菌处理

19、饲料可提高动物对饲料的消化率；通过构建基因工程菌提高纤维素酶的产量和质量已成为推动纤维素酶广泛应用于饲料业生产的重要手段。4.3 污水治理近年来，农药和洗涤剂的过度使用，尤其是含氯芳香类化合物的使用，对环境造成了严重的污染；利用漆酶可降解氯酚类有机化合物17。彩绒革盖菌产生的木素过氧化物酶、漆酶和多酚氧化酶具有较强的分解能力。尤其是漆酶对单氯酚进行24h处理后，邻位和对位氯酚的去除率分别达98.6%和100%18。另外，利用白腐菌对煤进行解聚及增溶，避免了直接使用煤所引起的大气污染，同时白腐菌对煤和石油还具有脱硫作用。白腐菌具有非特异性的降解性能，可有效降解废水生化处理过程中很难被降解的多氯联

20、苯、多环芳烃、DDT、染料、炸药和其他化合物(氯化物、叠氮化合物)等。有人用固定化菌丝技术处理纸浆漂白废水，经过34d的处理后，COD和BOD降低60%以上，氯代有机物减少45%19。目前，人们已开始利用白腐菌对污染物堆积地及受农药污染的土壤进行生物修复。针对受石油烃污染的土壤，白腐真菌已显示出较强的降解能力，在1年内，土壤中的总石油烃降解率高达80%。此外，还可利用酶清除室内甲醛气体。4.4 纺织洗涤细菌所产生的纤维素酶一般为中性至偏碱性，水解作用较弱，长期以来研究较少，没有得到足够的重视。近10几年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶

21、制剂已显示出良好的使用性能和巨大的经济价值。白腐菌产生的漆酶具有底物专一性，黄孢原毛平革菌对染料废水具有较好的脱色效果。通过基因工程改良的黑曲霉经深层发酵制得漆酶后，对牛仔布靛蓝染料的脱色效果明显。在考古研究领域，生物酶被应用于清除2600年前的方孔纱中的腐烂物和泥土20。4.5 食品工业漆酶主要用于饮料澄清与色泽控制，该酶可氧化多酚类物质生成多酚氧化物，进而发生再聚合，形成可以被滤膜截留的大颗粒，达到净化饮料的目的21。由于这一催化反应专一性强、污染少，澄清的果汁色浅且稳定，可以解决果汁加工中的二次混浊问题。在啤酒生产中，可用漆酶进行沉淀和脱除絮凝，使酒类得到澄清。利用漆酶中铜离子的催化特性

22、，可除去色拉、蛋黄酱等食品中溶解的氧，消除食品中的亚麻酸和溶解氧反应生成的挥发性异味组分，达到改良食品感官参数的目的。此外，漆酶还可用来测定食品中抗坏血酸的总含量。研究发现邻苯二胺可被漆酶氧化成2,3-二氨基吩嗪，而L-抗坏血酸对2,3-二氨基吩嗪的生成具有抑制作用22，漆酶的酶活性与抗坏血酸含量呈反比。该方法已应用于白酒、啤酒、奶粉等食品检测中。4.6堆肥将白腐菌应用于堆肥，可加快木质纤维转化为腐殖质肥料的分解速度。白腐菌降解技术在城市垃圾堆肥中的应用，需从寻找适合的菌种和白腐真菌的最佳降解条件着手，开发出新的混合菌剂加速堆肥腐熟，同时利用白腐菌产生的多种酶降解城市垃圾中的有毒物质，研发控制

23、污染的绿色环保技术。5未来研究方向随着真菌和细菌酶技术的不断发展，酶的应用领域将不断扩大，需求量将不断增加。然而不同工业需要的酶种类不同，这些酶来自哪些真菌和细菌，它们存在于哪些基物上，如何分离、鉴定和纯化，以及它们在固、液环境下的生长条件如何，都将是今后的研究方向。参考文献1邓强香蕉秆纤维素降解菌筛选及酒精制备研究D.广州:广东工业大学,2008.熊冬梅，周红丽.纤维素降解菌群的研究进展J.酿酒科技,2011(5):94-973 SHariKrishna,KCSekharRao,JSureshBabu,DSriramiReddy,SHariKrishna.Studiesontheproduc

24、tionandapplicationofcellulasefromTrichodermareeseiQM-9414J.BioprocessEngineering,2000,22(5).4 林英，秦萍，杜志强,张蓓蓓.产纤维素酶绿色木霉F-UV_(264)产酶条件优化J.安徽农业科学,2006(11)：2312-2314.5 EsterbauerH,SteinerW,LabudovaIetal.ProductionofTrichodermacellulaseinlaboratoryandpilotscaleJ.BioresourcesTechnology,1991(36):1-65.蔡凤.黑曲霉

25、产纤维素酶的分离纯化及性质研究D.南京:南京理工大学,2006.刘娣秸秆纤维素高效降解真菌的筛选、鉴定及其纤维素酶基因克隆D.北京:中国农业科学院,2008.文少白,李勤奋,侯宪文,李光义,邓晓.微生物降解纤维素的研究概况J.中国农学通报,2010(1):231-236.马宁,王彦杰,王文旭,曹雪梅,王心湖小平.纤维素降解菌的筛选与鉴定J.西北农业学报,2012,21(8):58-6210 周俊强,邱忠平，韩云平,刘源月.纤维素降解菌的筛选及其产酶学特性J.环境工程学报,2010,4(3):705-708.11 TangnuSK,BlanchHW,WilkeCR.Enhancedproductionofcellulose,hemicellulaseand-xylosidasebyTrichodermareesei(RUT-C30)J.BiotechnologyBioengineering,1981,23(8):1837-1849.12 魏