化学发光与生物发光

1、内容提纲内容提纲一、化学发光一、化学发光（一）、化学发光的基本原理（一）、化学发光的基本原理（二）、化学发光的应用（二）、化学发光的应用二、生物发光二、生物发光（一）、生物发光的原理与特点（一）、生物发光的原理与特点（二）、生物发光的分类（二）、生物发光的分类一、化学发光一、化学发光（一）化学发光的基本原理（一）化学发光的基本原理1 1、化学发光的定义、化学发光的定义 某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的反应产生的化学能化学能而被激发，从激发态返回基态时，而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的发射出一定

2、波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为过程称为化学发光化学发光( (chemiluminescence)chemiluminescence) 。 2、化学发光的过程、化学发光的过程1）、化学发光满足的条件）、化学发光满足的条件a、该化学反应必须提供足够的激发能，使电子能、该化学反应必须提供足够的激发能，使电子能从基态跃迁至激发态。从基态跃迁至激发态。b、化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生、化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。成激发态。c、处于激发态分子必须具有一定的化学发光量子、处于激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放出光子效率释放出光子, 或者能够转移它的能

3、量给另一或者能够转移它的能量给另一个分子使之处于激发态并释放出光子。个分子使之处于激发态并释放出光子。2）化学发光的基本类型）化学发光的基本类型a、直接发光、直接发光 是指被测物质为反应物直接参与化学反是指被测物质为反应物直接参与化学反应，利用自身化学反应释放的能量激发产应，利用自身化学反应释放的能量激发产物分子的光辐射。可用反应式表示为：物分子的光辐射。可用反应式表示为： A+B C*+D， C* C+hv 这类化学发光反应最多和最普遍，多数有这类化学发光反应最多和最普遍，多数有机物分子在液相中的化学反应属于这一类机物分子在液相中的化学反应属于这一类型型 。b、间接发光、间接发光 是指某些化

4、学反应中的由于激发态产是指某些化学反应中的由于激发态产物本身不发光或发光十分微弱，但通过加物本身不发光或发光十分微弱，但通过加入某种能量接受体（荧光剂）可导致发光。入某种能量接受体（荧光剂）可导致发光。反应式为：反应式为： A+B C*+D, F+C* F*+C, F* F+hv C为能量给于体，为能量给于体，F为能量接受体。为能量接受体。一、化学发光一、化学发光（二）化学发光的应用（二）化学发光的应用1 1、化学发光分析、化学发光分析 化学发光化学发光 (ChemiLuminescence (ChemiLuminescence ，简称为，简称为 CLCL) ) 分析法是分析法是分子发光光谱分

5、析法中的一类，它主要是分子发光光谱分析法中的一类，它主要是依据化学检测体系中依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理系的原理，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测，利用仪器对体系化学发光强度的检测，而确定待测物含量的物含量的一种痕量分析方法一种痕量分析方法。化学发光与其它发光分析的本质区别是体化学发光与其它发光分析的本质区别是体系产生发光系产生发光 ( ( 光辐射光辐射 ) ) 所吸收的能量来所吸收的能量来源不同。体系产生化学发光，必须具有一源不同。体系产生化学发光，必须具有一个产生可检信号的

6、光辐射反应和一个可一个产生可检信号的光辐射反应和一个可一次提供导致发光现象足够能量的单独反应次提供导致发光现象足够能量的单独反应步骤的化学反应。步骤的化学反应。第一类物质是化学发光反应中的的反应物；第一类物质是化学发光反应中的的反应物；第二类物质是化学发光反应中的催化剂，增第二类物质是化学发光反应中的催化剂，增敏剂或抑制剂敏剂或抑制剂; ;第三类是偶合反应中反应物，催化剂，增敏第三类是偶合反应中反应物，催化剂，增敏剂等。剂等。化学发光分析测定的物质对象可分为三类化学发光分析测定的物质对象可分为三类：u鲁米诺化学发光体系鲁米诺化学发光体系u 吖啶酯类化学发光体系吖啶酯类化学发光体系u过氧化草酸酯

7、类化学发光体系过氧化草酸酯类化学发光体系u无机物化学发光体系无机物化学发光体系 碱性高碘酸钾碱性高碘酸钾酸性高锰酸钾酸性高锰酸钾酸性硫酸铈酸性硫酸铈稀土配合物稀土配合物( (中性中性) )u 其他化学发光体系其他化学发光体系 主要的化学发光体系主要的化学发光体系 2 2、常见的一些化学发光体系、常见的一些化学发光体系鲁米诺（鲁米诺（ 3- 3-氨基苯二甲酰肼）其结氨基苯二甲酰肼）其结构是为构是为氧化剂氧化剂: H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 催化剂催化剂: 过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3

8、+、Hg2+ etc.)OXIDANTBASEluminol*3-Aminophthalate+ h3-APA鲁米诺的发光机理是鲁米诺的发光机理是IO4 + O2 + 2 OH2 O2 + IO3 + H2O O2 + CO32CO3 + O22 (1) (2) (5)*4 O2nanogold(O2)2* + 2 H2O2 + 4 OH2 CO3(CO2)2* + O22 2 O2 ( = 490 500 nm)(O2)2*+ h+ 4 H2O2 CO2 ( = 430 450 nm)+ h (3) (4) (6)nanogold(CO2)2*q 氧分子对的发射：氧分子对的发射： 490 5

9、00 nmq CO2双分子发射：双分子发射： 430 450 nm多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用多酚类物质对该体系的化学发光有增强作用3 3）、高锰酸钾（高锰酸钾（KMnO4KMnO4）发光体系）发光体系 KMnOKMnO4 4 还原剂还原剂 CLCL体系体系KMnO4 + Red Intermediate (激发态激发态) 直接直接CL Fluorophore Fluorophore (激发态激发态) 间接间接CL还原剂还原剂：氨基酸、SO2、碘、药物、毒品等具有还原性的物质量子产率不高，可以加入强还原量子产率不高，可以加入强还原性物质增强体系灵敏度性物质增强体系灵敏度可以测定化学需

10、氧量 高价铈高价铈 Ce (IV) Ce (IV)的发光体系的发光体系 Ce Ce（）是一种）是一种强的氧化剂强的氧化剂，CeCe（）在氧化亚硫酸盐在氧化亚硫酸盐等还原性物质可产生等还原性物质可产生微弱的微弱的化学发光化学发光，因此可以利用此体系直接测定相，因此可以利用此体系直接测定相关的化合物。一般认为关的化合物。一般认为CeCe（）被还原时，）被还原时，产生激发态的产生激发态的CeCe（）* *，这个激发态同样，这个激发态同样的既可以跃迁到基态而发光，也可以将能量的既可以跃迁到基态而发光，也可以将能量转移给共存荧光而发光。荧光物质（如罗丹转移给共存荧光而发光。荧光物质（如罗丹明明B B、罗

11、丹明、罗丹明6G6G、喹啉等）、表面活性剂、喹啉等）、表面活性剂（如吐温（如吐温2020、吐温、吐温8080等）来增敏等）来增敏CeCe（）的）的化学发光。化学发光。3 3、化学发光分析仪、化学发光分析仪IFFM-EIFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）。限公司）。Flow CL cellComputerWastePMTPower Supply andAmplifierml/minCitOrganiccompoundsTween-80Ce（）H2OPeristalticpump图图1 1 柠檬酸三钠柠檬酸三钠CeCe（）-

12、-吐温吐温8080流动注射化学发光体系流流动注射化学发光体系流程程4 4、化学发光分析的特点、化学发光分析的特点局限性局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器商品化不够商品化不够 优势性：优势性：不需要外部光源：不需要外部光源：消除了入射光的干扰消除了入射光的干扰( (瑞利散射和拉曼散射瑞利散射和拉曼散射) )。克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了噪声，提高了信噪比。低了噪声，提高了信噪比。 灵敏度高灵敏度高( (通常可达通常可达ngng级或级或pgpg级级) )。线性范围宽线性范围宽( (通常可达三个数

13、量级通常可达三个数量级) )。设备简单、分析快速、易实现自动化。设备简单、分析快速、易实现自动化。5 5、化学发光法的应用、化学发光法的应用1 1）无机化合物化学发光分析）无机化合物化学发光分析a a、金属离子分析、金属离子分析b b、其他无机化合物的分析、其他无机化合物的分析2 2）有机化合物化学发光分析）有机化合物化学发光分析a a、有机酸、有机酸b b、有机碱、有机碱c c、氨基酸、氨基酸d d、糖类、糖类e e、类固醇类脂、类固醇类脂f f、药物、药物3 3）化学发光在生物领域的应用）化学发光在生物领域的应用l 血浆和血清的化学发光血浆和血清的化学发光 l血浆脂蛋白的化学发光血浆脂蛋白

14、的化学发光 l 尿液的化学发光尿液的化学发光 l红细胞的化学发光红细胞的化学发光二、生物发光二、生物发光（一）生物发光的原理与特点（一）生物发光的原理与特点1 1、生物发光的定义、生物发光的定义 生物发光生物发光 是指生物体发出的光辐射，是生物体是指生物体发出的光辐射，是生物体释放能量的一种形式，这种发光现象广泛地分散在生释放能量的一种形式，这种发光现象广泛地分散在生物界中。它不依赖于有机体对光的吸收，而是物界中。它不依赖于有机体对光的吸收，而是一种特一种特殊类型的化学发光殊类型的化学发光，也是氧化发光的一种。，也是氧化发光的一种。2 2、生物发光的特点、生物发光的特点 生物发光的一般机制是：

15、生物发光的一般机制是：由细胞合成的化学物质，由细胞合成的化学物质，在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。在一种特殊酶的作用下，使化学能转化为光能。 生物发光的颜色范围很宽，可从红光到深蓝光； 氧是几乎所有生物发光系统中必须的因素； 生物发光是由“荧光素酶”与“荧光素”的化学反应所引起的； 所有的生物发光反应似乎都是酶-底物类型的反应，但复杂程度不同，某些生物发光反应涉及3 种或4种底物，而另一些生物发光反应甚至需要3个或4个酶的体系。二、生物发光二、生物发光（二）生物发光的分类（二）生物发光的分类1 1、据发光的机理不同将生物发光分为：、据发光的机理不同将生物发光分为：u受激荧光受激荧光u

16、发光生物发光发光生物发光u化学发光化学发光u超微弱发光超微弱发光a、受激荧光、受激荧光 受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的受激荧光是指生物体在受到外界光辐射的作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧作用时，体内固有的荧光物质或吸收的荧光标记物发光的现象。光标记物发光的现象。 在生物学领域中，由于分析物质荧光的方在生物学领域中，由于分析物质荧光的方法敏感性极高，而且几乎所有的有机分子法敏感性极高，而且几乎所有的有机分子都能够直接或经过适当的化学处理后发生都能够直接或经过适当的化学处理后发生荧光，故很早就受到重视，并逐渐发展成荧光，故很早就受到重视，并逐渐发展成为生物学和医学中的荧光分析。为生物学和

17、医学中的荧光分析。b b、发光生物发光、发光生物发光 发光生物发光生物是指自身具有发光器官、细胞是指自身具有发光器官、细胞( (包括发包括发光的共生细菌光的共生细菌) )，或具有能分泌发光物体腺体的海洋，或具有能分泌发光物体腺体的海洋生物的统称。生物的统称。 在生物世界里说到发光，人们首先会想到萤火在生物世界里说到发光，人们首先会想到萤火虫，但除了这种昆虫外还有许多生物也能发光，如虫，但除了这种昆虫外还有许多生物也能发光，如一些生活在深海里的鱼类，光是一种谋生的手段。一些生活在深海里的鱼类，光是一种谋生的手段。夜晚常在近海作业的渔民甚至是长住海边的人经常夜晚常在近海作业的渔民甚至是长住海边的人

18、经常能看到海面上有光带，这是一些藻类发出的，当它能看到海面上有光带，这是一些藻类发出的，当它们受到惊扰时或者是在大量繁殖时，似乎海洋都开们受到惊扰时或者是在大量繁殖时，似乎海洋都开始燃烧了起来。晚上在海滩上戏耍的孩子们能从海始燃烧了起来。晚上在海滩上戏耍的孩子们能从海滩上找到沙蚕，这也是一种能发光的动物，除此之滩上找到沙蚕，这也是一种能发光的动物，除此之外，能发光的还有水母、珊瑚、某些贝类和蠕虫等。外，能发光的还有水母、珊瑚、某些贝类和蠕虫等。c c、化学发光、化学发光 生物发光是一种特殊的化学发光，它是一生物发光是一种特殊的化学发光，它是一类与生命过程有光的化学发光，是在化学类与生命过程有光

19、的化学发光，是在化学反应过程中反应过程中(主要为氧化还原反应主要为氧化还原反应)发出可发出可见光的现象。见光的现象。 由两个关键步骤组成：由两个关键步骤组成：激发和发射激发和发射。 许多化学反应进行时能释放足够的自由能许多化学反应进行时能释放足够的自由能而把参加反应的物质之一激发到能发射光而把参加反应的物质之一激发到能发射光的电子激发态，生成一种激发态产物，在的电子激发态，生成一种激发态产物，在它回到基态时，剩余能量转变成光子能量它回到基态时，剩余能量转变成光子能量产生发光现象。产生发光现象。将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测将化学发光与免疫反应结合起来建立的化学发光免疫测定法。

20、定法。化学发光标记是继荧光标记，放射性核素标记，酶标记化学发光标记是继荧光标记，放射性核素标记，酶标记三大标记技术之后，发展起来的最新检测技术。三大标记技术之后，发展起来的最新检测技术。全自动电化学发光免疫分析仪全自动电化学发光免疫分析仪 d d、超微弱发光、超微弱发光 超微弱发光分析：超微弱发光分析： 任何有生命的物质人、任何有生命的物质人、动物、植物和微生物等都有一种超微弱发光，动物、植物和微生物等都有一种超微弱发光，这是生命体本身所固有的一种属性：这种发这是生命体本身所固有的一种属性：这种发光可以通过对生物分子、细胞、亚细胞组份光可以通过对生物分子、细胞、亚细胞组份(线桓体、微粒体、脂质

21、体线桓体、微粒体、脂质体)或生物活体或生物活体(小鼠、小鼠、树叶、水果、小过树叶、水果、小过)、器官及体液、器官及体液(血、尿血、尿)的的测贡探测出来。测贡探测出来。 这些有关生物超微弱发光这些有关生物超微弱发光(ultra-weak (ultra-weak bioluminescence)bioluminescence)的研究课题，构成了当前的研究课题，构成了当前生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究生命科学发展前沿中的一个极其重要的研究领域领域生命系统的超微弱光子辐射生命系统的超微弱光子辐射(ultra-(ultra-weak photon emission from living wea

22、k photon emission from living system)system)。 萤火虫发光细胞中含有萤火虫发光细胞中含有荧光素、荧光素酶两种发光荧光素、荧光素酶两种发光物质。它们与物质。它们与ATPATP（三磷酸（三磷酸腺苷）及氧一起反应，在氧腺苷）及氧一起反应，在氧与荧光素结合时发生电子转与荧光素结合时发生电子转移同时发生能量的变化释放移同时发生能量的变化释放出荧光光子而发光。出荧光光子而发光。a a、萤火虫类的发光、萤火虫类的发光2 2、据发光的生物不同将生物发光分为：、据发光的生物不同将生物发光分为：萤火虫萤火虫这类发光过程包括加氧、这类发光过程包括加氧、激发与转移，如海萤的

23、发光：激发与转移，如海萤的发光：它在自身分开的腺体中分别合它在自身分开的腺体中分别合成荧光素和荧光素酶，当把两成荧光素和荧光素酶，当把两者同时喷进水里时就会在水中者同时喷进水里时就会在水中反应而发光，波长反应而发光，波长460460纳米，纳米，光色为蓝色。光色为蓝色。 海萤海萤2 2、节足动物及鱼类的生物发光、节足动物及鱼类的生物发光鱼类鱼类包括刺丝胞亚门和栉水母亚门。这种类型包括刺丝胞亚门和栉水母亚门。这种类型发光具有各种不同的活化反应。亚门和纲不同，发光具有各种不同的活化反应。亚门和纲不同，活化反应与激发特性也不同。此类发光还可以活化反应与激发特性也不同。此类发光还可以从一个发光种传递激发

24、态能量给另一个发光种，从一个发光种传递激发态能量给另一个发光种，即有敏化生物发光现象。这种发光可发出不同即有敏化生物发光现象。这种发光可发出不同颜色的光，较多地偏向红色，波长颜色的光，较多地偏向红色，波长480480490490纳纳米。米。 3 3、腔肠动物的生物发光、腔肠动物的生物发光 栉水母栉水母 栉水母是一种发光海洋生栉水母是一种发光海洋生物，它们可以发出一种另物，它们可以发出一种另类的类的防护光防护光。这种防护光。这种防护光通常被称为通常被称为“牺牲标签牺牲标签”。当栉水母被捕食者吞到腹当栉水母被捕食者吞到腹中后，会引起某些半透明中后，会引起某些半透明捕食者身体发出光芒，这捕食者身体发出光芒，这种光芒对于捕食者来说是种光芒对于捕食者来说是非常危险，它们因此也成非常危险，它们因此也成为更上层捕食者的猎物。为更上层捕食者的猎物。所以，栉水母的防护光也所以，栉水母的防护光也被称为被称为“牺牲标签牺牲标签”。 它的反应机制与前三种不同。底物在催它的反