基因工程的原理和技术62754学习教案

1、会计学1基因工程基因工程(jyn gngchng)的原理和技术的原理和技术62754第一页，共61页。 遗传效应是指能转录为遗传效应是指能转录为mRNA，继而，继而(j r)翻译翻译为蛋白质，或转录为核糖体为蛋白质，或转录为核糖体RNA、转运、转运RNA的功能的功能。什么是遗传效应什么是遗传效应？第1页/共60页第二页，共61页。蛋白质蛋白质DNA基因基因(jyn)线性排列线性排列(pili)脱氧核苷酸脱氧核苷酸磷酸磷酸(ln sun)基脱氧核糖基脱氧核糖含氮碱基含氮碱基遗传物质的遗传物质的主要载体主要载体（DNADNA的基本单位）的基本单位）基因、基因、DNA、染色体、脱氧核苷酸的关系、染色

2、体、脱氧核苷酸的关系第2页/共60页第三页，共61页。RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点编码区：能转录为相应的编码区：能转录为相应的mRNA进而指导进而指导(zhdo)蛋白质蛋白质的的 合成。合成。 非编码区：不能转录为相应的非编码区：不能转录为相应的mRNA但有调控遗传但有调控遗传 信息表达的核苷酸序列，位于编码区的信息表达的核苷酸序列，位于编码区的 上游和下游。上游和下游。第3页/共60页第四页，共61页。区分：启动子与起始密码区分：启动子与起始密码(m m) 终止子与终止密码终止子与终止密码(m m)起始起始(q sh)密码密码终止终止(zhngzh)密密码码启动子启动子终止子终止子AT

3、C基因基因转录区转录区TAA转录转录ATC转录转录起始点起始点翻译翻译起始点起始点转录转录终止点终止点RNA起点起点RNA终点终点第4页/共60页第五页，共61页。RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子信使信使(xnsh)RNA成熟成熟(chngsh)的信的信使使RNA第5页/共60页第六页，共61页。第6页/共60页第七页，共61页。第7页/共60页第八页，共61页。为什么要有这一步为什么要有这一步第8页/共60页第九页，共61页。第9页/共60页第十页，共61页。基因较小）基因较小）第10页/共60页第十一页，共61页。 第11页/共60页第十二页，共61页。第12页/

4、共60页第十三页，共61页。文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小基因中有无启动子基因中有无启动子基因中有无内含子基因中有无内含子基因多少基因多少物种间的基因交流物种间的基因交流小小大大无无无无有有有有可以可以(ky)(ky)部分基因部分基因(jyn)(jyn)可以可以某种生物的某种生物的部分基因部分基因某种生物的某种生物的全部基因全部基因第13页/共60页第十四页，共61页。n就像从图书馆借一本书，要知道书名、作者、出版社或人物情节等信息一样n获取目的基因前，要对这个基因的背景有一定程度的了解，（如核苷酸序列、基因的功能、位置以及(yj)基因的表达产物的

5、特性等）然后通过恰当的技术手段将目的基因从基因文库中调取出来。第14页/共60页第十五页，共61页。获取获取(huq)目的基因方法：目的基因方法：利用利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因全称是：多聚酶链式反应，在生物体外复制特定全称是：多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNADNA片段的片段的核酸核酸(h sun)(h sun)合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。基因。第15页/共60页第十六页，共61页。 DNA DNA复制的过程涉及复制的过程涉及DNADNA双链的方向。通常将双链的方向。通常将DNADNA的羟基（的羟基（- -OHOH）末

6、端）末端(m dun)(m dun)称为称为33端，而磷酸基团的末端端，而磷酸基团的末端(m (m dun)dun)称为称为55端。端。5端端3端端3端端5端端第16页/共60页第十七页，共61页。3端端5端端5端端3端端第17页/共60页第十八页，共61页。DNADNA聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成DNADNA，只能从，只能从33端延伸端延伸DNADNA链。因此，链。因此，DNADNA复制需要引物。当引物与复制需要引物。当引物与DNADNA母链通过碱基互补母链通过碱基互补(h b)(h b)配对结合后，配对结合后，DNADNA聚合酶就聚合酶就能从引物的能从引物的33端开始延伸端

7、开始延伸DNADNA链。链。DNADNA的合成的合成(hchng)(hchng)方向总是从子链的方向总是从子链的55端端向端端向33端端端端延伸延伸3535353535353535第18页/共60页第十九页，共61页。DNA复制复制(fzh)的过的过程程1.1.解旋解旋: :利用细胞提供的能量边解旋、边复制利用细胞提供的能量边解旋、边复制2.2.配对配对: :分别以每条单链为模板分别以每条单链为模板, ,以四种游离的脱氧核苷酸为原料以四种游离的脱氧核苷酸为原料, ,利用碱基互补配对原则利用碱基互补配对原则(yunz)(yunz)合成两条新的子链合成两条新的子链3.3.螺旋：两条子链分别与对应的

8、模板链绕成螺旋型，构成两个新的螺旋：两条子链分别与对应的模板链绕成螺旋型，构成两个新的DNADNA分子分子第19页/共60页第二十页，共61页。思考：思考： DNA复制需要哪些成分和反应复制需要哪些成分和反应(fnyng)条件？条件？ 如何在体外设置一个类似的如何在体外设置一个类似的DNA复制环境？复制环境？参与的组分参与的组分在在DNA复制中的作用复制中的作用解旋酶解旋酶打开打开DNA双链双链DNA母链（模板链）母链（模板链）提供提供DNA复制的模板复制的模板4种脱氧核糖核苷酸种脱氧核糖核苷酸合成子链的原料合成子链的原料DNA聚合酶聚合酶催化合成催化合成DNA子链子链引物引物使使DNA聚合酶

9、能够从聚合酶能够从3端开始连接脱端开始连接脱氧核苷酸氧核苷酸第20页/共60页第二十一页，共61页。 DNA DNA双链复制的原理（遵循双链复制的原理（遵循(zn xn)(zn xn)碱基互补配对原则碱基互补配对原则） 含待扩增目的基因片段的含待扩增目的基因片段的DNADNA模板；模板； 根据目的基因双链各一端序列片段合成根据目的基因双链各一端序列片段合成 与两条模板链相结合的两种引物；与两条模板链相结合的两种引物； 要有耐热要有耐热(nai r)(nai r)的的DNADNA聚合酶（聚合酶（TaqTaq酶）；酶）； 四种单核苷酸（四种单核苷酸（dCTPdCTP、dGTP dGTP 、dATP

10、 dATP 、dTTP dTTP ）。）。DNADNA热变性的原理热变性的原理前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列第21页/共60页第二十二页，共61页。55-60：目的基因以目的基因以方式扩增，即方式扩增，即第22页/共60页第二十三页，共61页。获取目的获取目的(md)基因方法基因方法DNA合成仪用化学方法直接人工合成合成仪用化学方法直接人工合成第23页/共60页第二十四页，共61页。为什么要有这一步为什么要有这一步(y (y b)b)第24页/共60页第二十五页，共61页。第25页/共60页第二十六页，共61页。目的目的(md)基因基因标记基因

11、 第26页/共60页第二十七页，共61页。质粒质粒DNADNA分子分子(fnz)(fnz)两个两个(lin )(lin )切口切口获得目的基因获得目的基因重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同种同种一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端 为什么不能将目的基因直接为什么不能将目的基因直接导入受体细胞？导入受体细胞？通过通过cDNAcDNA文库获得的目的基文库获得的目的基因有启动子和终止子吗？因有启动子和终止子吗？ 在构建表达载体（重组在构建表达载体（重组DNADNA分子）过程中需要什分子）过程中需要什么分子工具？么分子工具？ 只考虑两两结合，可产生几只考虑两两结合，可产生几种重

12、组种重组DNADNA分子？分子？第27页/共60页第二十八页，共61页。为什么要有这一步为什么要有这一步(y (y b)b)第28页/共60页第二十九页，共61页。动植物细胞和动植物细胞和、枯草杆菌、酵母、枯草杆菌、酵母菌等微生物。菌等微生物。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。第29页/共60页第三十页，共61页。v 农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染农杆菌特点：生活在土壤中，能够在自然条件下感染 双双子叶植物和裸子植物子叶植物和裸子植物(luzzhw)，受植物体伤口处的，受植物体伤口处的细胞分泌的大量酚类化合物的吸引，农杆菌中的细胞分泌的大量酚类化合物的

13、吸引，农杆菌中的Ti质粒上质粒上的的T-DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体可转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的的DNA上。上。1 1）将目的基因导入植物）将目的基因导入植物(zhw)(zhw)细胞细胞a.农杆菌农杆菌(gnjn)转化法（采用最多的方转化法（采用最多的方法）法）v 原理：将原理：将插入到插入到，通过农杆菌转化，通过农杆菌转化，使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。上。使目的基因的遗传特性得以稳定的维持和表达。v 优点及应用：此法比较经济和有效，约优点及应用：此法比较经

14、济和有效，约80%的转基因植物都是通的转基因植物都是通过这种方法获得。过这种方法获得。第30页/共60页第三十一页，共61页。v 我国科学家独创我国科学家独创(dchung)的一种方的一种方法法v 实例：我国的转基因抗虫棉实例：我国的转基因抗虫棉v （1）常用于单子叶植物）常用于单子叶植物(zhw)v 的基因转化的基因转化 v （2）缺点：成本较高）缺点：成本较高基因基因(jyn)枪法枪法花粉管通道法花粉管通道法第31页/共60页第三十二页，共61页。2 2）将目的）将目的(md)(md)基因导入动物细胞基因导入动物细胞提纯提纯(tchn)基因表达基因表达载体载体体外显微注射入受精卵体外显微注

15、射入受精卵经胚胎早期培养后经胚胎早期培养后移植到雌性体内移植到雌性体内受体细胞：受体细胞：显微注射显微注射(zhsh)技术技术基本操作程序：基本操作程序：受精卵受精卵最常用的方法最常用的方法:第32页/共60页第三十三页，共61页。第33页/共60页第三十四页，共61页。思考思考(sko)4:利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗利用大肠杆菌能生产人的糖蛋白吗?n有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成.大肠杆菌是原核生物,不存在这两种细胞器,因此(ync)在大肠杆菌生产这种糖蛋白是不可能的.第34页/共60页第三十五页，共61页。1.1.将目的将目的(md)(md)基

16、因导入植物基因导入植物细胞细胞农杆菌农杆菌(gnjn)转化法转化法基因基因(jyn)枪法枪法2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞显微注射技术显微注射技术（最多、最有效）（最多、最有效）3.3.将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理处理花粉管通道法花粉管通道法第35页/共60页第三十六页，共61页。为什么要有这一步为什么要有这一步第36页/共60页第三十七页，共61页。第37页/共60页第三十八页，共61页。第38页/共60页第三十九页，共61页。第39页/共60页第四十页，共61页。探针是一小探针是一小(y xio)(y xio)段单链段单链DNADNA或

17、者或者RNARNA片段（约片段（约2020到到500bp500bp），用于检测与其互补的核酸序列。），用于检测与其互补的核酸序列。根据重组质粒上目的基因的部分根据重组质粒上目的基因的部分DNADNA序列，人工合成序列，人工合成（或（或PCRPCR技术合成）与之互补的一小技术合成）与之互补的一小(y xio)(y xio)段单链段单链DNADNA（或（或RNA) ,RNA) ,利用带有利用带有32P-32P-磷酸的磷酸的dATPdATP使其标记上放射性同位素，这一使其标记上放射性同位素，这一小小(y xio)(y xio)段与目的基因的部分序列互补的核酸分子称为段与目的基因的部分序列互补的核酸分

18、子称为DNADNA探探针。针。 互补碱基互补碱基序列的序列的DNADNA分子，可以通过碱基对之分子，可以通过碱基对之间形成氢键等，形成稳定的双链区。间形成氢键等，形成稳定的双链区。DNADNA分子杂交的双方是所使用的分子杂交的双方是所使用的和和DNADNA分子杂交的理论基础是：分子杂交的理论基础是：第40页/共60页第四十一页，共61页。基因探针基因探针(tn zhn)与目的基因杂交，观察标记有与目的基因杂交，观察标记有无杂交带无杂交带第41页/共60页第四十二页，共61页。将标记的核酸探针与细胞将标记的核酸探针与细胞(xbo)(xbo)或组织中的或组织中的核酸进行杂交核酸进行杂交第42页/共

19、60页第四十三页，共61页。第43页/共60页第四十四页，共61页。分子分子水平水平检测检测第44页/共60页第四十五页，共61页。第45页/共60页第四十六页，共61页。以上检测以上检测(jin c)是分子水平，有时还需进行个是分子水平，有时还需进行个体生物学水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特体生物学水平的鉴定，如对植物的抗虫抗病特性的鉴定等。性的鉴定等。第46页/共60页第四十七页，共61页。分子分子水平水平检测检测第47页/共60页第四十八页，共61页。基因工程基因工程(jyn gngchng)的基本操作程序的基本操作程序1 1、目的、目的(md)(md)基因的获基因的获取取2 2、形成重

20、组、形成重组(zhn z)DNA(zhn z)DNA分子；分子；3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、筛选含有目的基因的受体细胞、筛选含有目的基因的受体细胞、 目的基因表达目的基因表达1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因2、利用、利用PCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因3、化学方法人工合成、化学方法人工合成农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、抗原分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定第48页/共60页第四十九页

21、，共61页。第49页/共60页第五十页，共61页。将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，将目的基因插人土壤农杆菌的质粒，构建表达载体，通过通过(tnggu)农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，农杆菌的转化导人香蕉受体细胞，成功转化的香蕉细胞通过成功转化的香蕉细胞通过(tnggu)组织培养形成组织培养形成植株。植株。生态安全问题包括：生态安全问题包括： 外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；外源基因扩散到其他物种（外源基因漂移）；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散影响生态系统的结构和功能；转基因植株扩散对生物多样性的影响；转基因植株扩散对生物多样性的影响；转基因植物残体或

22、分泌物对环境的影响。转基因植物残体或分泌物对环境的影响。如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力提高的香如何利用目的基因，通过转基因技术获得抗寒能力提高的香蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在生态安全方面可能蕉植株？在运用转基因香蕉的过程中，在生态安全方面可能(knng)会出现什么问题？（列举两点）会出现什么问题？（列举两点）第50页/共60页第五十一页，共61页。成熟的编码成熟的编码(bin m)(bin m)蛋白的蛋白的mRNAmRNA分子分子加入逆转录酶，反转录加入逆转录酶，反转录mRNAmRNA，合成一条与其互补，合成一条与其互补(h b)(h b)的的DNADNA单链分子单链分子

23、在在DNADNA聚合酶的作用聚合酶的作用(zuyng)(zuyng)下，以第一下，以第一条条DNADNA单链为模板合成单链为模板合成第二条单链第二条单链第51页/共60页第五十二页，共61页。第52页/共60页第五十三页，共61页。RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点非编码区非编码区编码区编码区非编码区非编码区外显子外显子外显子外显子内含子内含子内含子内含子外显子外显子AB BC CD DE E真核生物基因的结构真核生物基因的结构A AB BC CD DE EA AC CE E加工加工翻译翻译初级初级RNARNAmRNAmRNA蛋白质（多肽）蛋白质（多肽）基因控制蛋白质的合成基因控制蛋白质

24、的合成转录转录第53页/共60页第五十四页，共61页。所谓文库，是指一种所谓文库，是指一种(y zhn)(y zhn)全体的全体的集合。集合。基因文库则是指某一生物全部基因的集合。基因文库则是指某一生物全部基因的集合。 构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳构建基因文库的意义不只是使生物的遗传信息以稳定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基定的重组体形式贮存起来，更重要的是它是分离克隆目的基因的主要途径。因的主要途径。对于复杂的染色体对于复杂的染色体DNADNA分子来说，单个基因所占比分子来说，单个基因所占比例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需例十分微小，要想从庞大的基因组中将其分离出来，一般需要先进行要先进行