综合大实验(1)

1、基因工程实验设计 成员：潘嘉立，危威，刘礼彪， 张睿，谭娟，邓文静基因工程实验设计一、 目的基因的获取Arabis hirsuta isolate Ahirs2-1 alcohol dehydrogenase gene, complete cdsGenBank AF110444.1硬毛南芥Ahirs2-1酒精脱氢酶ORIGIN1 ATGATTACCA CCGGACAGAT TATTCGATGC AAAGCTGCTG TGGCATTTGA AGCCGGAAAA61 CCACTGGTTA TGGAGGAAGT AGAGGTTGCT CCGCCGCAAA AAAATGAAGT TCGTATCAAG1

2、21 ATCCTCTTCA CTTCTCTTTG TCACACCGAT GTTTACTTCT GGGAGGCAAA GGGACAAACA181 CCGTTGTTTC CTCGTATCTT CGGTCATGAA GCTGGAGGGA TTGTGGAGAG TGTTGGAGAA241 GGTGTGACTG ATCTTGCACC AGGAGATCAT GTGTTACCGA TCTTCACCGG AGAATGTGGT301 GATTGTCCTC ATTGTCACTC TGAGGAATCA AACATGTGTG ATCTTCTCAG GATCAACACC361 GAACGAGGAG TGATGATAAA

3、 CGACGGTGAA TCGAGGTTCT CTATTGATGG GAAACCGATT421 TATCATTTTG TTGGGACATC AACGTTTAGT GAATACACTG TGGTTCACTC TGGTCAAGTC481 GCTAAGATCA ATCCTGATGC TCCTCTTGAT AAAGTCTGCA TTGTTAGTTG TGGTTTATCT541 ACTGGGNTAG GAGCTACTTT GAATGTTGCT AAACCGAAAA AGGGTCAAAG TGTTGCGATT601 TTCGGACTCG GTGCTGTTGG TTTAGCCGCT GCTGAAGGTG C

4、TAGAATCGC TGGTGCTTCT661 AGGATCATTG GTGTTGATCT CAACTCGAAG AGATTCGATG AAGCTAAGAA ATTCGGTGTG721 ACCGAGTTTG TGAACCCGAA AGACCATGAC AAACCTGTTC AACAGGTGAT CGCTGAGATG781 ACGGATGGTG GAGTTGACCG GAGTGTGGAG TGTACTGGAA GCGTTCAGGC CATGATTCAA841 GCATTTGAAT GTGTTCACGA TGGTTGGGGT GTTGCGGTGC TTGTTGGTGT GCCAAGCAAA901

5、GACGATGCCT ACAAGACTCA TCCAATGAAT TTCCTGAATG AGAGAACTCT CAAGGGTACT961 TTCTTTGGGA ACTACAAACC AAAAACTGAC ATTCCCGGGC TTGTCGAAAA GTACATGAAC1021 AAGGAGCTGG AGATTGAGAA ATTCATCACT CACACAGTGC CATTCTCGGA GATCAACAGG1081 GCCTTTGATT ACATGTTGAA GGGAGAGGGT ATCCANTGCA AAATCACCAT GGGTGCTTGA二、引物设计正向引物: 5'-CCCAAGC

6、TTATGATTACCACCGGACAGAT -3' (66.7 ) 反向引物： 5'-CGCGGATCCTCAAGCACCCATGGTG-3' (70) 三、强碱法提取pUC-19 质粒DNA试剂：1、溶液1（GTE）：50mmol/l 葡萄糖、10mmol/l EDTA-Na2、 25mmol/l Tris-Cl（pH8.0）、4mg/ml 溶菌酶溶液2：200mmol/l NaoH、1%SDS溶液3：5mol/l KAC 60ml、冰乙酸 11.5ml、ddH2O 28.5ml2、 苯酚-氯仿3、 异丙醇（或95%乙醇，100%乙醇）4、 70%乙醇5、 TE（p

7、H8.0）：10mmol/l Tris-Cl（pH8.0）、1mmol/l EDTA-Na26、 RNase 1mg/ml 、Amp 100ug/ml实验步骤：1、挑取一单菌落的Ecoli InvaF（pUC-19）菌种接种到含Amp100ug/ml的LB液体培养基中，37振荡培养过夜。2、 吸1.4ml菌液至Ep管中，在高速台式离心机上5000r离心2min，倒去培养基。3、 重复一次，尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上，以吸干管壁上残留的培养基，收集细菌。4、 将细菌悬于500ul冰冷的溶液1中，于离心机上5000r离心2min.5、 倒去溶液1，再悬于200ul冰冷的溶液1中。6、 加入

8、300ul新配制的溶液2，冰浴5min。7、 加入300ul冰冷的溶液3，中和，轻轻振荡，至冰浴5min。8、 于离心机上，10000r离心5min。9、 加入等体积的饱和酚快速抽提，10000r离心5min取上清液。10、 再加入等体积的氯仿抽提，10000r离心5min取上清液。11、 加入750ul异丙醇，沉淀质粒DNA，10000r离心10min。12、 倒去异丙醇，用70%乙醇洗涤沉淀，10000r离心5min。13、置冰箱内开盖干燥，悬浮于40ul去离子水或TE中。四、硬毛南芥植物总RNA提取实验步骤1. 称取材料0.1g，剪成约2mm长段，加入液氮研磨成细粉状。2. 加入0.2g

9、异硫氰酸胍和2ml CSB缓冲液，继续研磨成匀浆。3. 将匀浆转移至两个eppendorf管中，加入0.12ml NaAc，加盖后反复颠倒离心管20次。4. 每管加入1ml酚：氯仿：异戊醇，混匀后剧烈震动10sec，冰浴15min。5. 10，000g，4离心15min。6. 小心将上层水相转移至新管中，注意不要吸动中间层。中间层富含蛋白质和DNA。7. 加入等体积的异丙醇，混匀后置-20放置30min以沉淀RNA。8. 10，000g，4离心20min沉淀RNA。9. 弃上清，将RNA沉淀悬浮到0.5ml CSB溶液中，摇动溶液至RNA溶解。10. 加入等体积的酚:氯仿:异戊醇重新抽提一次，

10、即重复48的步骤。11. 离心后弃上清，沉淀用0.5ml预冷的75%乙醇漂洗一次。离心后弃上清，真空初步干燥沉淀。12. RNA溶解在0.2ml  DEPC水中，用紫外分光光度计测定260nm、280nm、及230nm波长的光密度，获得RNA的浓度和纯度。五、RT-PCR扩增目的基因1. cDNA的合成总RNA1ug（约5-10ul）Oligo（dT）160.5ug（也可使用特异下游引物50-100pmol）Rnasin20U5xRT缓冲液4 ul10mmol/LdNTPs1 ulAMV逆转录酶10ul加水到20ul42保温30-60分钟，冰上冷却，离心数秒钟，然后进行PCR2. P

11、CR 扩增目的基因5ml反应管中，按照以下顺序加入各种成分。使反应总体积为50ul：H2O28ul10×PCR缓冲液5 ul10×dNTPs（2.0mmol/L）5 ul扩增引物混合物（2umol/L）5 ulcDNA模板5 ulTaqDNA聚合酶（1.5U）2 ul在冰上轻轻混匀后，加石蜡油50ul，离心数秒钟，放置于冰上，准备上机扩增。2.上机先在DNA扩增仪上设置好循环程序：94预变性2分钟；94变性30秒，60退火30秒，72延伸40秒，共30个循环；72延伸5分钟。反应管放在DNA扩增仪的插孔中。按“START”键，循环开始。3.循环完毕，取出反应管，放置于4冰箱

12、备用。6、 DNA的回收与纯化试剂：低熔点琼脂糖、TE、苯酚、氯仿、EB、无水乙醇、70%乙醇、3mol/lNaAc步骤：1、配制1%的琼脂糖凝胶，加入EB至0.5ug/ml2、加样电泳一段距离，在紫外灯下检测，当DNA片段充分分开后停止电泳3、在紫外灯下用小刀在所要回收带前挖一个长方形小洞4、将1%的融化的低熔点琼脂糖凝胶（LMA）灌入洞内，凝固后继续电泳5、待目的带完全进入LMA后停止电泳，将含目的带的LMA切下装入EP管中6、加入5倍体积的TE混匀7、65水浴10min，摇晃，使胶融化8、加入等体积的苯酚抽提，10000g离心5min9、加入等体积的氯仿抽提，10000g离心5min10

13、、加入3mol/lNaAc至最终浓度为0.2mol/l，用2倍体积的无水乙醇在-20沉淀2小时11、12000g离心15min，用70%乙醇洗涤沉淀，真空干燥12、溶于适量的TE中，取少量电泳或紫外检测将Ahirs2-1构建到pUC-19上7、 将Ahirs2-1构建到pUC-19上（一）酶切Ahirs2-1DNA和质粒试剂 Hind 限制性内切酶、BamH 限制性内切酶 10×buffer：50mmol/l Nacl 10mmol/l Tris-cl 10mmol/l Mgcl2 1mmol/l DTT（二硫苏糖醇）步骤：1. 将DNA样品1ug溶解在16ul重蒸水中2. 加入2u

14、l 10×buffer3. 加入1-2U的限制性内切酶Hind 和BamH 4. 混合反应液后稍离使液体聚集，置37温育1小时5. 终止反应加入0.5mol/l EDTA-Na2，至终浓度为10mol/l6. 进行电泳检查酶切结果7. 切胶回收目的片段和载体（二）DNA的重组连接试剂:10T4DNA连接酶缓冲液660mmol/l Tris-HCl(pH7.5)50mmol/l MgCl250mmol/lDDT50mmol/lATP电泳试剂：电泳缓冲液5TEB pH8.0（使用浓度为0.5）54.0gTris、27.5g硼酸、20ml 500mmol/LEDTA、加800ml重蒸水，加

15、热溶解后，再加入重蒸水定容至1000ml实验步骤：1、取3只EP管，一管做重组连接，一管做pUC19未经CIP的处理的自连2、用微量进样器按下表分别取样各溶液预EP管中DNA酶切反应物10T4连接缓冲液ddH2OT4DNA连接酶总体积pUC19EcoR-CIP 5ul(100ng)5.4KbEcoR片段 5ul（约400ng）2ul7ul1ul(2U)20ulpUC19EcoR-CIP 3ul(60ng)2ul14ul1ul(2U)20ulpUC19EcoR 3ul(60ng)2ul14ul1ul(2U)20ul加样顺序为ddH2O、10T4连接缓冲液、DNA片段，最后加入T4连接酶（放于冰浴

16、中）连接酶取好立即放回-20备存3、盖紧盖子用手指弹匀EP管，于台式离心机上转2s，以集中样品4、将3管连接样品放入温度16温水浴锅中，过夜5、第二天上午各管取约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，观察连接反应效果，电泳时要加入pUC19EcoR酶切段做电泳对照8、 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化1、 实验材料：E.coli InvaF(受体) pUC-19质粒DNA2、 实验仪器、器皿及试剂仪器、器皿：平板、三角瓶、EP离心管试剂：LB培养基：酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、Nacl 10g/l 、1L水、琼脂2% 氨苄青霉素100mg/ml 、 0.1mol/lCaCl2溶液

17、X-gal 20mg/l(用甲酰胺溶液配制)使用浓度为40ug/mlIPTG 20mg/l(用无菌水配制)使用浓度为40ug/ml3、 实验步骤1、 从甘油保存菌种中接种一环E.coli InvaF至LB平板上，37道指培养过夜2、 挑取2-3mm直径的单菌落接种至50mlLB液体培养基中，37振荡培养4-6h(摇床转速200r/min)当OD600为0.6左右即可3、 吸取1.4ml菌液至离心管，5000g 2min，弃上清液，并倒置于纸帕4、 重复步骤3一次5、 将细菌悬浮液于750ul预冷的0.1mol/lCaCl2溶液，冰浴放置10min6、 5000g离心2min，收集细菌7、 将细

18、菌重悬于200ul预冷的0.1mol/lCaCl2溶液冰浴放置30min8、 每管加入质粒DNA50ng/10ul，轻轻混匀冰浴放置20min，设计一不加质粒DNA的对照9、 将管置于42水浴锅中2-3min,不要摇动10、 迅速转移至冰浴2min11、 加入700ulLB液体培养基，37培养45min，以便转化菌表达抗性12、 接种到含100ul/ml Amp的LB冷平板上13、 将平板倒置放入37恒温培养箱中培养过夜14、 确信对照无菌落时，在Amp培养基上长出的菌落即是转化子八、菌落PCR检测 1、PCR mix（PCR预混液）的制备  菌落 Taq buf

19、fer（10×）     20 L  dNTP（2.5 mmol/L）       5  L  Primer Forward（50 mmol/L）    10 L  Primer Reverse（50 mmol/L）    10 L ddH2O    

20、0;   147 L Taq（2U/L）     8  L total        200 L  将上述溶液混匀，10L每管分装于200L PCR管中。  2、常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB琼脂糖平板上轻点，做一拷贝；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR混合物的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，将平板上点的克隆标号与管子上的对应起来，以便筛选到克

21、隆后进行扩繁培养），盖紧管子。  3、将混有菌体的PCR混合物置于PCR仪中，按常规条件扩增。PCR反应程序根据具体的引物设置，参考下列程序： 95，3 min 95，30 s 56，30 s 72，50 s 30个循环 72，10 min。 4、凝胶电泳检测菌落PCR结果 5、将已经接种有菌落的平板置37培养箱培养过夜，使菌落扩增，次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。九、酶切检测 步骤：1、 将菌落PCR扩增目的带的细菌进行培养2、 提取质粒2、加入2ul 10×buffer3、加入1-2U的限制性内切酶Hind 和BamH 4、混合反应液后稍离使液体聚集，置37温育1小时5、终止反应加入0.5mol/l EDTA-Na2，至终浓度为10mol/l6、进行电泳检查酶切结果7、电泳检测是否得到目的片断。8、菌种保存10、 测序1、