荧光的猝灭解析课件

溶液荧光的猝灭1溶液荧光的猝灭1荧光猝灭，广义地说包括了任何可使荧光强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。相互作用所引起的荧光降低的现象，这些会引起荧光的猝灭的物质称为荧光猝灭剂。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的过程。动态猝灭：猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间的相互作用静态猝灭：猝灭剂与荧光物质的基态分子之间的相互作用2荧光猝灭，广义地说包括了任何可使荧光强度降低的§4.1动态猝灭在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移的机制或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态。3§4.1动态猝灭在动态猝灭过程中，荧光物质的

溶液中荧光物质分子M和猝灭剂Q相碰撞而引起荧光熄灭。比较速率M＋hυ→M*(吸光)1

M*M＋hυ

(发生荧光)kf[M*]M*+QM+Q+热(猝灭过程）kq[M*][Q]

44根据恒定态的假设，在连续的照射下，激发态荧光体1M*会达到一个恒定值，即其生成速率与衰变速率相等，1M*浓度保持不变，即：在没有猝灭剂的情况下：1M*表示为：[1M*]0，根据以上反应式可得：5根据恒定态的假设，在连续的照射下，激发态荧光体在猝灭剂存在的情况下：1M*表示为：[1M*]，同理可得：式中kq为双分子猝灭过程的速率常数。6在猝灭剂存在的情况下：1M*表示为：[1M*]，同理可得：在猝灭剂不存在和存在的情况下，荧光量子产率分别为：7在猝灭剂不存在和存在的情况下，荧光量子产率分于是，没有猝灭剂存在时荧光强度F0与存在猝灭剂时的荧光强度F的比值为：该式为Stern－Volmmer方程。t0为没有猝灭剂时测得的荧光寿命；Ksv为Stern－Volmer猝灭常数，是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比值。8于是，没有猝灭剂存在时荧光强度F0与存在猝灭根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同，可得Stern－Volmer方程式的另一种表示形式：式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。直观的看，1/Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可根据kqt0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。*对有效的猝灭剂，KSV≈102－103L/mol.9根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同，可得

某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后，溶液的荧光强度显著降低，溶液的吸收光谱有了明显的变化;其荧光强度随着温度的升高而增强。这种现象可能是由于荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物的结果。这种现象称为静态猝灭。§4.2静态猝灭10某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后荧光分子和猝灭剂之间形成的不发光的基态配合物，可表示为：配合物的形成常数为：11荧光分子和猝灭剂之间形成的不发光的基态配合物，荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可推倒如下：上式中[M]0为荧光分子的总浓度；F0与F分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的荧光强度。12荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可推倒如下：上式区分动态猝灭与静态猝灭：（1）最确切的方法是测量荧光体寿命；对静态猝灭，猝灭剂的存在并没有改变荧光分子激发态的寿命，因此t0/t=1;对动态猝灭，猝灭剂的使荧光分子寿命缩短，t0/t=F0/F（2）动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下降，同时双分子的运动加速，其结果使扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的常数。（3）此外，由于碰撞猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光分子的吸收光谱。相反，基态配合物的生成往往引起荧光分子吸收光谱的改变。13区分动态猝灭与静态猝灭：（1）最确切的方法是测量荧光体寿命；结合常数:7.9×106Chem.Commun.,2005,3189–3191.Cu2+14结合常数:7.9×106Chem.Commun.,24。§4.3电荷转移猝灭某些猝灭剂与荧光物质分子相互作用时，发生了电荷转移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。由于激发态分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，也就是说，激发态分子是比基态分子更强的电子给体和电子受体，因此激发态分子更容易发生与其他物质的分子发生电荷转移作用。某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。154。§4.3电荷转移猝灭某些猝灭剂与荧光物质在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为实际的激态电荷转移配合物：M＋Q＋KT在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处于更长的波长范围，且无精细结构。16在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂在极性溶剂中，1M*的荧光被猝灭剂猝灭时，通常并不伴随由基态电荷转移配合物所产生的荧光，代之而发生的是遭遇配合物形成离子对，再经溶剂化作用转变为游离的溶剂化离子。17在极性溶剂中，1M*的荧光被猝灭剂猝灭时，通常具有重原子的猝灭剂分子，它们与荧光物质的激发态分子所形成的电荷转移配合物，有利于电子自旋的改变，以致发生电荷转移配合物的离解并伴随着经由三重态的能量降低：18具有重原子的猝灭剂分子，它们与荧光物质的激发态例：甲基蓝荧光溶液被Fe2+离子熄灭D+hυ→D*D*→D+hυ＇D*+Fe2+→D－+Fe3+D－+H→DH（半醌）2DH→D+DH2（无色染料）某些染料如甲基蓝的荧光可被Fe2＋猝灭，这是由于甲基蓝的激发态分子与Fe2＋发生氧化还原反应：19例：甲基蓝荧光溶液被Fe2+离子熄灭某些染料如甲

发生电子转移反应的猝灭剂并不限于金属离子，I-，Br-，CNS-，S2O32-等易于给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生猝灭作用。I->CNS->Br->Cl->C2O42->SO42->NO3->F-这一顺序与电力势的增大相关联，表明这些离子对染料荧光的猝灭效率与它们给出电子的难易程度有关。20发生电子转移反应的猝灭剂并不限于金属离子，I-，光诱导电荷转移（photo-inducedchargetransfer)Excitationofafluorophoreinducesthemotionofanelectronfromoneorbitaltoanother.Iftheinitialandfinalorbitalsareseparatedinspace,theelectronictransitionisaccompaniedbyanalmostinstantaneouschangeinthedipolemomentofthefluorophore.Whenthelatterpossessesanelectron-donatinggroup(e.g.-NH2,-NMe2,-CH3O)conjugatedtoanelectron-withdrawinggroup(e.g.-C=O,-CN),theincreaseindipolemomentcanbequitelarge.Consequently,theexcitedstatereacheduponexcitation(calledtheFranck–Condonstateorlocallyexcitedstate,LE)isnotinequilibriumwiththesurroundingsolventmoleculesifthelatterarepolar.Inamediumthatissufficientlyfluid,thesolventmoleculesrotateduringthelifetimeoftheexcitedstateuntilthesolvationshellisinthermodynamicequilibriumwiththefluorophore.Arelaxedintramolecularchargetransfer(ICT)stateisthenreached.21光诱导电荷转移（photo-inducedchargeInlow-polaritysolventsFPPemitsatshortwavelengthsfromtheLEstate(toptwopanels).Asthesolventpolarityincreasesanewlongerwavelengthemissionappears.Thislonger-wavelengthemission(lowerpanel)isduetoaninternalcharge-transfer(ICT)state,whichformsrapidlyfollowingexcitation.Inthiscasethetwoendsofthefluorophoreareheldrigidlybythemethylenebridge,sothatformationoftheICTstatedoesnotdependonthetwisting.例1.22Inlow-polaritysolveFigure.EmissionspectraofFPPinseveralsolvents.23Figure.EmissionspectraofFP例2.Figure.EmissionspectraofLaurdaninethanolat–50°C(1),–60°C(2),–70°C(3),–80°C(4),–85°C(5),–90°C(6),–100°C(7),–110°C(8),and–190°C(9).24例2.Figure.Emissionspectra例3.dimethylamino-substitutedBodipyfluorophore25例3.dimethylamino-substitutedFigure.Emissionspectraofadimethylamino-substitutedBodipyindifferentsolvents.26Figure.Emissionspectraofa27272828Anal.Chim.Acta2008,627,254–257.Aselectivecolorimetricchemosensorforthiolsbasedonintramolecularchargetransfermechanism例4:29Anal.Chim.Acta2008,627,23030例5:ARatiometricFluorescentProbeforCysteineandHomocysteineDisplayingaLargeEmissionShiftOrg.Lett.，2008，10，5577-5580.31例5:ARatiometricFluorescentFig.1.Absorptionandfluorescencespectralchangesofprobe1uponadditionofincreasingconcentrationCys.32Fig.1.Absorptionandfluoresc例6：33例6：33FluorescentspectraofPBI(a）and4（b)b34FluorescentspectraofPBI(Fig.Absorption(left)andfluorescentemissionspectra(right)of4towarddifferentconcentrationsofbisulfite35Fig.Absorption(left)andflu§4.4能量转移猝灭根据能量转移过程中作用机理的不同，能量转移可分为辐射能量转移和非辐射能量转移两种。其中非辐射能量转移又有两种不同的机理假设，即通过偶极－偶极耦合作用的共振能量转移和通过电子交换作用的交换能量转移。36§4.4能量转移猝灭根据能量转移过程中作用机1.辐射能量转移猝灭这种能量转移过程实质上是荧光的再吸收。即荧光分子（能量供体）所发射的荧光为猝灭剂（能量受体）所吸收，从而导致后者被激发。这种能量转移过程仅仅是供体发射的荧光按照比尔定律为受体所吸收。这种能量转移过程的地效率决定于供体的发射光谱和受体的吸收光谱两者的重叠程度。重叠程度越大，能量转移的效率越高。371.辐射能量转移猝灭这种能量转移过程实质上Non-radiativetransferofexcitationenergyrequiressomeinteractionbetweenadonormoleculeandanacceptormolecule,anditcanoccuriftheemissionspectrumofthedonoroverlapstheabsorptionspectrumoftheacceptor,sothatseveralvibronictransitionsinthedonorhavepracticallythesameenergyasthecorrespondingtransitionsintheacceptor.Suchtransitionsarecoupled。2.非辐射跃迁能量转移：38Non-radiativetransferof非辐射跃迁的形式：库仑相互作用39非辐射跃迁的形式：库仑相互作用3940403.共振能量转移当供体分子和受体分子相隔的距离大于供体－受体的碰撞直径时，只要供体分子的基态和第一激发态两者的振动能及间的能量差相当于受体分子的基态和第一激发态两者的振动能及间的能量差，这种情况下，仍然可发生从供体到受体的非辐射能量转移（长距离能量转移）。413.共振能量转移当供体分子和受体分子相隔的距这种能量转移过程，是通过偶极－偶极耦合作用的共振能量转移过程。分子具有特征的振动能层，因而可提供许多近似的共振途径，这种共振途径越多，共振能量转移的概率越大。42这种能量转移过程，是通过偶极－偶极耦合作用的共振A,B,C和A‘，B’，C’所表示的跃迁是耦合的跃迁，当激发态的供体分子和基态的受体分子相距某一适当的距离时，供体分子跃迁衰变到基态时，同时诱发了受体分子通过A‘，B’，C’跃迁而被激发到激发态。43A,B,C和A‘，B’，C’所表示的跃迁是耦对于以固定距离r相隔的某个供体－受体对而言，其共振能量转移的速率可表示如下：式中：φD为没有受体存在的情况下供体的发射量子产率；n为介质的折射率；N为阿佛加德罗常数；r为供体偶极中心到受体偶极中心的平均距离；tD为没有受体存在下供体的辐射寿命；FD（v）为供体在v至v＋dv波数间隔内的校正荧光强度，εA为受体在波数v的摩尔吸光系数；φD/tD为供体的发射速率；K2为定向系数。44对于以固定距离r相隔的某个供体－受体对而言，其共由上式可知，共振能量转移的速率与供体－受体两者的距离、供体发射与受体吸收之间的光谱重叠程度以及它们的跃迁概率、供体发射的量子产率以及供体激发态的寿命等因素有关。45由上式可知，共振能量转移的速率与供体－受体两者的上式中的常数项通常合并在一起并定义为Forster距离（供体－受体对的临界转移距离）R0，在这一距离下，能量转移速率KT等于没有受体存在的情况下供体的衰变速率，由上述方程和KT＝tD-1，可得到：由以上两个方程联立后得：46上式中的常数项通常合并在一起并定义为Forster距离由上式可知，当R0>r时，能量转移的概率比供体分子衰变的概率大；当R0<r时，大多数的激发态供体分子将衰变到基态，而能量转移概率较小。能量转移的效率（E）可表示为：当r＝R0时，能量转移与供体的衰变概率相等。47由上式可知，当R0>r时，能量转移的概率比供体Fig.Dependenceoftheenergytransfer(E)ondistance,R0istheForsterdistance.48Fig.Dependenceoftheenergy供体和受体的浓度越大，r值便越小，共振转移的效率将越大。因此，共振转移现象与浓度有关。当受体处于比供体更低的能极时，才可能发生有效的能量转移。不同类分子之间的能量转移，比同类分子之间的能量转移更为有效。49供体和受体的浓度越大，r值便越小，共振转移的效率将越大一般最可能的共振能量转移过程是单重态－单重态和三重态-单重态能量转移过程，如下所示：50一般最可能的共振能量转移过程是单重态－单重态和三重态-单重态由于D*（S1）--D（S0）和A(S0)—*A(S1)两个跃迁的概率都高，因此单重态－单重态共振能量转移过程可发生在比较大的临界距离内，并且速率常数也比较高。单重态－单重态共振能量转移51由于D*（S1）--D（S0）和A(S0)—*A三重态－单重态共振能量转移过程，虽然因为供体分子的跃迁是自旋禁阻的，跃迁概率较小，但因为供体分子的激发三重态寿命较长，因此这种能量转移过程虽然速率比较慢，但仍可有效发生。可发生在比较大的临界距离内，并且速率常数也比较高。三重态－单重态共振能量转移52三重态－单重态共振能量转移过程，虽然因为供体分子共振能量转移过程的两个最重要的判断标准是：（1）能量转移应当发生在远大于碰撞半径的距离上发生；（2）能量转移效率与介质的粘度变化无关。53共振能量转移过程的两个最重要的判断标准是：5354545555RET的应用（2）－－分子构象变化的探测基于E和r的关系，利用R0和实验测得的E，可求得供体和受体之间的距离，该方法对于研究分子内和分子间的构象变化非常有用。其方法是在一个生物大分子或两个相互作用的分子上分别标记两个能发生RET的荧光团，通过测量E，就可确定两点间的距离。由于相对取向和光谱重叠积分的不确定因素，该方法不能准确测定绝对距离，但可通过监测供体－受体的相对距离变化，结合时间变化，可以推测出大分子在生命活动中的构象变化。56RET的应用（2）－－分子构象变化的探测基于E和r的5757ANovelHg2+SelectiveRatiometricFluorescentChemodosimeterBasedonanIntramolecularFRETMechanismJFluoresc2008，18，1187例1.58ANovelHg2+SelectiveRatiomeANovelDesignMethodofRatiometricFluorescentProbesBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferSwitchingbySpectralOverlapIntegral例2.Chem.Eur.J.2003,9,1479.59ANovelDesignMethodofRatio吸收光谱变化荧光光谱变化60吸收光谱变化荧光光谱变化603.交换能量转移猝灭交换能量转移是发生在比共振能量转移更短的距离内的能量转移现象，这种能量转移也称为短距离能量转移。其特征是：（1）只有当供体分子和受体分子两者的电子云相互接触时，这种能量转移的形式才是重要的。在这种情况下，供体分子和受体分子之间能量最高的电子可能相互交换位置，也就是说，激发态供体分子的光电子可能改变位置成为原先处于基态的受体分子的电子结构部分，而供体分子又从基态受体分子那里交换取得一个电子从而返回到基态。交换能量转移的速率是扩散控制的，因而其速率与介质的粘度有关。（2）交换作用的大小与供体及受体的跃迁概率无关。对于如单重态－三重态这样的禁阻跃迁来说，在短距离的间隔内，交换能量转移过程将占支配的地位。613.交换能量转移猝灭交换能量转移是发生在比共振能量交换能量转移过程中，必须遵守Wigner的自旋保守规则，即始态和终态的总自旋保持不变。因此，最重要的交换能量过程有如下两种形式：62交换能量转移过程中，必须遵守Wigner的自旋保4.分子内能量转移能量转移不仅能够发生在两个分子之间，也可能发生在同一分子中的两个发色团之间。634.分子内能量转移能量转移不仅能够发生在两个分64646565（photo-inducedelectrontransfer,PET)在光的作用下，激发的电子给体（或受体）可以与电子受体（或给体）间发生电子转移，分别形成阳离子自由基和阴离子自由基，再进而发生相关的后续反应。§4.5光诱导电子转移发生电子转移反应的基本条件是该过程必须在热力学上是可行的，并在电子转移发生后可分别得到阳离子自由基和阴离子自由基。有关这些电荷分离产物的进一步变化，将依赖于体系的状况。它们可以发生正、负离子间的重合，使体系回复到原来的状态，也可发生进一步的反应，从而形成其他产物。光诱导反应可以是分子内的，也可以是分子间的。66（photo-inducedelectrontransf还原型光诱导电子转移67还原型光诱导电子转移67氧化型光诱导电子转移68氧化型光诱导电子转移686969Rehm-Weller方程E（D/D+)为电子给体的氧化电位；E（A/A-)为电子受体的还原电位；ΔG为过程中自由能的变化，如ΔG为为负值，则过程可自发进行。ΔG0,0为光的参与使化合物分子被激发至激发态所提供的基态－激发态0，0能及间的激发能量；最后一项为溶液中的离子对在介电常数为ε的溶剂中被驱引至相距为d时所需要的能量（通常很小为0.0Xev）。70Rehm-Weller方程E（D/D+)为电E（D/D+),E（A/A-)可通过电化学测量或理论计算LUMO和HOMO轨道能量的方法得到。该公式是一个经验公式，它是在大量基础实验上建立起来的。有关从理论上对电子转移过程的研究是由Marcus所完成的。Marcus提出的电子转移模型认为，电子转移的速率决定于电子给体与受体间的距离，反应自由能的变化以及反应物与周围溶剂重组能的大小等。71E（D/D+),E（A/A-)可通过电化学测量或Marcus推导出一个简单的公式来联系电子转移反应活化能的变化ΔG≠反应过程的自由能变化ΔG0以及反应中总的重组能λ间的关系，如下式所示：Fig.VariationsoftherateconstantforelectrontransferversusΔG0accordingtotheMarcustheory.KET=Zexp（-ΔG*/RT）72Marcus推导出一个简单的公式来联系电子转移反它预示电子转移反应的速率随ΔG0变得越来越负,而出现一个先增大后降低的情况。即在电子转移过程会出现一个所谓的“反转区”。对于这一结论，在若干年后得到了很好的证实。Marcus因此获得1992年的诺贝尔化学奖。73它预示电子转移反应的速率随ΔG0变得越来越负,而出现一个先增74747575当对苯甲酸部分通过化学修饰，如引入给电子基团或分子时，降低了苯甲酸部分的氧化电位，因而相应升高了该部分HOMO(highestoccupiedmolecularorbital)的能量，当苯甲酸部分的HOMO能量高到一定程度时，从苯甲酸部分的HOMO到氧杂蒽环部分的HOMO光诱导电子转移可有效的进行，此时该探针的分子开关关闭，整个分子呈弱荧光。在这一过程中，苯甲酸部分作为电子的给体，氧杂蒽（荧光团）部分为电子的受体。相对荧光团而言，这一过程为可称为还原型的光诱导电子转移。当通过分子识别反应升高苯甲酸部分的氧化电位，从而降低了该部分HOMO的能量，当电子给体的HOMO能量低于受体的HOMO能量时，光诱导电子转移不能进行，探针的分子开关打开，整个分子呈强荧光。还原型的光诱导电子转移76当对苯甲酸部分通过化学修饰，如引入给电子基团或分如果通过化学修饰升高苯甲酸部分的还原电位到一定程度时，这时光诱导电子转移将反向进行，即从激发单重态的氧杂蒽部分的LUMO(lowestunoccupiedmolecularorbital)到苯甲酸部分的LUMO，这使荧光体激发单重态的能量消失，此时该探针的分子开关关闭，整个分子呈弱荧光。在该过程中，氧杂蒽环为电子的给体，苯甲酸部分作为电子的受体。相对荧光团而言，这一过程为可称为氧化型的光诱导电子转移。当通过分子识别反应降低苯甲酸部分的还原电位，从而升高了该部分LUMO的能量时，光诱导电子转移将不能进行，该探针的分子开关打开，整个分子呈强荧光。氧化型的光诱导电子转移77如果通过化学修饰升高苯甲酸部分的还原电位到一定程度7878还原型的光诱导电子转移79还原型的光诱导电子转移79氧化型的光诱导电子转移80氧化型的光诱导电子转移80818182828383848485858686测定H+及金属离子的PET原理87测定H+及金属离子的PET原理87基于PET原理测定焦磷酸的荧光传感器分子88基于PET原理测定焦磷酸的荧光传感器分子88PET-1,Itsfluorescencequantumyieldincreasesfrom0.003to0.14uponbindingofK+inmethanol.89PET-1,ItsfluorescencequantPET-2,containingawater-solublepolyazamacrocycle,wasdesignedfortherecognitionofsoftmetalionslikeZnII.ThiscompoundissensitivetopHbecauseoftheprotonabilityofthealiphaticnitrogenatoms.AtpH10,thefluorescenceintensityofthiscompoundincreases14-folduponadditionofZnII.90PET-2,containingawater-solu测定Zn2+91测定Zn2+91inPET-3aandPET-3b,thepKaisloweredandtheintensitychangesarecomparableatpH10andpH7.TheZn2+complexesarethusfluorescentatphysiologicalpH.Moreover,thePET-3aandPET-3b(containingfluoresceinanddichlorofluoresceinmoieties)areexcitableinthevisibleandarethusmoreappropriateforbiologicalapplications.92inPET-3aandPET-3b,thepKa93939494ThissensorisalsobasedonthePETprinciple,butinadifferentwaytocompoundsPET-1andPET-2.QuenchingoffluorescenceuponCu2+bindingarisesfromaphotoinducedelectrontransferfromthefluorophoretothemetalcenterandinvolvestheCu2+/Cu+couple.ThecrowncanalsoefficientlybindAg+,butcomplexationisnotsignaledbyachangeinfluorescenceintensitybecausethepoorredoxactivityofthisnon-transitioncationprecludeselectrontransfer.95Thissensorisalsobased§4.6.光诱导质子转移（photo-inducedprotontransfer)在适当的环境中，一个激发分子所含不稳定质子的酸度变化和相应基态分子相比较，可有6个数量级的变化。这种明显的pKa值的差异，为在激发态时的质子转移反应提供了驱动力。质子转移是一种重要的转移过程，它是由光的刺激而引起分子内核的运动是一种重要的光物理现象。它在生化过程中有着重大的意义。96§4.6.光诱导质子转移（photo-inducedpr97979898例1.Itisknownthattheexcited-stateintramolecularprotontransfer(ESIPT),from8-OHtothequinolinoNatom,makes8-HQ，weaklyfluorescentandmetalbindingto8-HQblockstheESIPTchannel,therebyrestoringthefluorescence.Org.Lett.，2005，7，4217-4220.99例1.Itisknowntha由于存在对氧化还原行为负责的激发态分子中电子密度的重组，所产生的驱动力也可对酸度带来影响。这种因光激发而引起的分子内电子密度的重新分布，可导致对作用分子发生自发的质子化或去质子化。例2.100由于存在对氧化还原行为负责的激发态分子中电子该分子内的质子转移的速率很快。它可在皮秒的时间尺度内发生。并导致激发态的平衡。101该分子内的质子转移的速率很快。它可在皮秒的时间尺度基于2-(2-羟基苯基)苯并咪唑的比率型荧光探针分子102基于2-(2-羟基苯基)苯并咪唑的比率型荧光探针分子102103103(1)测定F-离子的比率型荧光探针104(1)测定F-离子的比率型荧光探针104105105Scheme1.

Designconceptofratiometricfluorescentprobe1forfluoride.106Scheme1.DesignconceptofraFig.1.Absorption(left)andfluorescence(right)spectraofHPBI,PBIand1.107Fig.1.Absorption(left)andfFig.Absorptionandfluorescencespectraof1afterincubationwithincreasingconcentrationsoffluorideion.108Fig.AbsorptionandfluorescenFig.3.Fluorescentemissionchanges(λex=310nm)of1uponadditionofvariousanions(4.0µM)109Fig.3.Fluorescentemissionch(2)测定ALP的比率型荧光探针110(2)测定ALP的比率型荧光探针110Exicted－StateIntramolecularProtonTransfer111Exicted－StateIntramolecularP当荧光物质的浓度超过1g/L时，常发生荧光的自猝灭现象。包括如下几种：（1）荧光辐射的自吸收假如荧光物质的吸收光谱和发射光谱有较大的重叠，由荧光物质发射的荧光，有一部分可能被自身的基态分子所吸收。随荧光物质浓度的增加，自吸收的现象会加剧。这种现象，实际上也是辐射能量转移过程，只不过能量的给体与供体为统一分子。§4.7自猝灭112当荧光物质的浓度超过1g/L时，常发生荧光的自猝灭(2)形成激发态二聚体（Excimer）荧光物质的激发态分子1M*与基态分子M形成激发态二聚体1（M*M）有的激发态二聚体并不发荧光，有的虽发荧光，但其发光特性（如光谱范围、荧光峰位置、荧光量子产率和荧光寿命等）与单体的发射特性不同，这就引起原来荧光物质的荧光猝灭。113(2)形成激发态二聚体（Excimer）荧光Excimersaredimersintheexcitedstate(thetermexcimerresultsfromthecontractionof‘exciteddimer’).Theyareformedbycollisionbetweenanexcitedmoleculeandanidenticalunexcitedmolecule:1M*+1M-----1(MM)*Manyaromatichydrocarbonssuchasnaphthaleneorpyrenecanformexcimers.Thefluorescencebandcorrespondingtoanexcimerislocatedatwavelengthshigherthanthatofthemonomeranddoesnotshowvibronicbands:114ExcimersaredimersintFig.Excimerformationwiththecorrespondingmomomerandexcimerbands.115Fig.ExcimerformationwiththFig.Fluorescencespectraofpyreneatvariousconcentrationsincyclohexane.A:10-2;B:7.75×10-3;C:5.5×10-3;D:3.25×10-3;E:10-3;G:10-4molL-1107.755.53.2510.1芘浓度（mmolL-1）116Fig.Fluorescencespectraofp例1.Asensitiveandselective“turnon”fluorescentchemosensorforHg(II)ionbasedonanewpyrene–thyminedyadAnal.Chim.Acta2005,549,10–13.117例1.AsensitiveandselectiveHg2+Fig.Fluorescencespectraofasolutionofdyad1inH2O/CH3CN(20:1,v/v)atpH7withtheadditionofHg(ClO4)118Hg2+Fig.Fluorescencespectra例2.NucleicAcid-InducedAggregationandPyreneExcimerFormationOrg.Lett.,2009,11(19),4302.119例2.NucleicAcid-InducedAggrFig2.UV-visabsorptionandfluorescenceemissionspectraof180μMofcompound1aloneandfollowingitsbindingto7.2μMofsimpleoligonucleotiderepeatsinanaqueousbuffersolution(MOPS,pH7.5).120Fig2.UV-visabsorptionandf(3)形成激基缔合物（Exciplexes）Exciplexesareexcited-statecomplexes(thetermexciplexcomesfrom‘excitedcomplex’).Theyareformedbycollisionofanexcitedmolecule(electrondonororacceptor)withanunlikeunexcitedmolecule(electronacceptorordonor):1D*+A-----1(DA)*1A*+D-----1(DA)*121(3)形成激基缔合物（Exciplexes）Fig.4.9.Fluorescencespectraofanthracene(0.3mmolL-1)inthepresenceofdiethylaniline(二乙苯胺）atvariousconcentrationsintoluene.1:0;2.5×10-3;3:2.5×10-2;4:0.10molL-250.00250二乙苯胺122Fig.4.9.Fluorescencespectra(4)基态的荧光物质分子的缔合具有可形成氢键的官能团的分子，它们在非极性和非氢键的溶剂中，在高浓度时很容易形成二聚体，甚至多聚体。这种二聚体与单体具有不同的吸收光谱，它们的生成可由吸收光谱辨认。所生成的二聚体或多聚体，往往不发荧光或所发射的荧光比单体弱，因此它们的生成能引起溶液的荧光强度的下降。123(4)基态的荧光物质分子的缔合具有可形成氢键的例1.自猝灭荧光探针法测定DNA

高等学校化学学报,1997,18,1456.124例1.自猝灭荧光探针法测定DNA124125125(5)转入三重态的猝灭溴化物及碘化物通常是高效率的猝灭剂。如在荧光物质的分子中引入Br或I原子，其荧光量子产率会下降。含溴或碘的化合物，由于溴或碘原子的重原子效应，增强了自旋－轨函的耦合作用，从而大大增加激发态分子的S1－－T1间的系间窜跃效率，使得荧光的量子产率减小，磷光的量子产率增大。126(5)转入三重态的猝灭溴化物及碘化物通常是高效率(6)氧的猝灭氧分子是最普遍存在的荧光和磷光猝灭剂。在溶液中，氧分子是十分有效的磷光猝灭剂。而对溶液的荧光而言，不同的荧光分子对氧的敏感性不同。氧分子对溶液溶液荧光产生猝灭作用的原因比较复杂，激发单重态受氧猝灭的机理有如下几种：127(6)氧的猝灭氧分子是最普遍存在的荧光和磷光（1）激发单重态的氧化作用（2）能量从1M*转移到O2（3）增强在1M*中的体系间窜跃（4）增强在1M*中的内转化（5）O2和基态分子M形成配合物1M*+O2A++O2-1M*+3O2

3M*+1O2*1M*+3O2M+1O2*1M*+3O2

3M*+3O21M*+3O2M+3O2128（1）激发单重态的氧化作用（2）能量从1M*转移到O2（3）(7)内滤效应(innerfiltereffect)内滤作用：当溶液中存在能吸收荧光物质的激发光或发射光的物质时，也会使体系的荧光减弱，这种现象称为内滤作用。129(7)内滤效应(innerfiltereffect)130130

图.

络合物Ⅱ紫外可见吸收与罗丹明B荧光光谱

131图.络合物Ⅱ紫外可见吸收与罗丹明B荧光光谱1图a.加入不同浓度半胱氨酸时Ⅰ－Cu(Ⅱ)体系的紫外可见吸收光谱图图b.加入不同浓度半胱氨酸时Ⅰ－Cu(Ⅱ)－rhodamineB体系的同步荧光光谱132图a.加入不同浓度半胱氨酸时Ⅰ－Cu(Ⅱ)体系的紫外可见荧光猝灭过程总结:动态猝灭静态猝灭光诱导电子转移(photo-inducedelectrontrnsfer)能量转移(共振能量电子转移，Resonanceenergytransfer)光诱导电荷转移(photo-inducedchargetransfer)光诱导质子转移(photoinducedprotontransfer)激发态二聚体（Excimer）激基缔合物(Exciplex)内滤效应(innerfiltereffect)133荧光猝灭过程总结:动态猝灭133

溶液荧光的猝灭134溶液荧光的猝灭1荧光猝灭，广义地说包括了任何可使荧光强度降低的作用。狭义的仅仅指那些由于荧光物质分子与溶剂或溶质分子之间所发生的导致荧光强度下降的物理或化学作用过程。相互作用所引起的荧光降低的现象，这些会引起荧光的猝灭的物质称为荧光猝灭剂。猝灭过程实际上是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿命的过程。动态猝灭：猝灭剂与荧光物质的激发态分子之间的相互作用静态猝灭：猝灭剂与荧光物质的基态分子之间的相互作用135荧光猝灭，广义地说包括了任何可使荧光强度降低的§4.1动态猝灭在动态猝灭过程中，荧光物质的激发态分子通过与猝灭剂分子的碰撞作用，以能量转移的机制或电荷转移的机制丧失其激发能而返回基态。136§4.1动态猝灭在动态猝灭过程中，荧光物质的

溶液中荧光物质分子M和猝灭剂Q相碰撞而引起荧光熄灭。比较速率M＋hυ→M*(吸光)1

M*M＋hυ

(发生荧光)kf[M*]M*+QM+Q+热(猝灭过程）kq[M*][Q]

1374根据恒定态的假设，在连续的照射下，激发态荧光体1M*会达到一个恒定值，即其生成速率与衰变速率相等，1M*浓度保持不变，即：在没有猝灭剂的情况下：1M*表示为：[1M*]0，根据以上反应式可得：138根据恒定态的假设，在连续的照射下，激发态荧光体在猝灭剂存在的情况下：1M*表示为：[1M*]，同理可得：式中kq为双分子猝灭过程的速率常数。139在猝灭剂存在的情况下：1M*表示为：[1M*]，同理可得：在猝灭剂不存在和存在的情况下，荧光量子产率分别为：140在猝灭剂不存在和存在的情况下，荧光量子产率分于是，没有猝灭剂存在时荧光强度F0与存在猝灭剂时的荧光强度F的比值为：该式为Stern－Volmmer方程。t0为没有猝灭剂时测得的荧光寿命；Ksv为Stern－Volmer猝灭常数，是双分子猝灭速率常数与单分子衰变速率常数的比值。141于是，没有猝灭剂存在时荧光强度F0与存在猝灭根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同，可得Stern－Volmer方程式的另一种表示形式：式中：t为猝灭剂存在时测得的荧光寿命。由上所述，若以F0/F对[Q]作图得一直线，斜率为Ksv。直观的看，1/Ksv的数值等于50％的荧光强度被猝灭时猝灭剂的浓度。假如测定了猝灭剂不存在时的荧光寿命t0，便可根据kqt0=Ksv的关系求得双分子猝灭过程的速率常数kq。*对有效的猝灭剂，KSV≈102－103L/mol.142根据没有猝灭剂与存在猝灭剂时荧光寿命的不同，可得

某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后，溶液的荧光强度显著降低，溶液的吸收光谱有了明显的变化;其荧光强度随着温度的升高而增强。这种现象可能是由于荧光分子和猝灭剂之间形成不发光的基态配合物的结果。这种现象称为静态猝灭。§4.2静态猝灭143某些荧光物质溶液在加入一些猝灭剂之后荧光分子和猝灭剂之间形成的不发光的基态配合物，可表示为：配合物的形成常数为：144荧光分子和猝灭剂之间形成的不发光的基态配合物，荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可推倒如下：上式中[M]0为荧光分子的总浓度；F0与F分别为猝灭剂加入之前和加入之后所测得的荧光强度。145荧光强度和猝灭剂浓度之间的关系，可推倒如下：上式区分动态猝灭与静态猝灭：（1）最确切的方法是测量荧光体寿命；对静态猝灭，猝灭剂的存在并没有改变荧光分子激发态的寿命，因此t0/t=1;对动态猝灭，猝灭剂的使荧光分子寿命缩短，t0/t=F0/F（2）动态猝灭由于与扩散有关，而温度升高时溶液的粘度下降，同时双分子的运动加速，其结果使扩散系数增大，从而增大双分子猝灭常数。反之，温度升高可能引起配合物的稳定度下降，从而减小静态猝灭的常数。（3）此外，由于碰撞猝灭只影响到荧光分子的激发态，因而并不改变荧光分子的吸收光谱。相反，基态配合物的生成往往引起荧光分子吸收光谱的改变。146区分动态猝灭与静态猝灭：（1）最确切的方法是测量荧光体寿命；结合常数:7.9×106Chem.Commun.,2005,3189–3191.Cu2+147结合常数:7.9×106Chem.Commun.,24。§4.3电荷转移猝灭某些猝灭剂与荧光物质分子相互作用时，发生了电荷转移反应，即氧化还原反应，即引起荧光的熄灭。由于激发态分子往往比基态分子具有更强的氧化还原能力，也就是说，激发态分子是比基态分子更强的电子给体和电子受体，因此激发态分子更容易发生与其他物质的分子发生电荷转移作用。某些强的电子受体的物质，往往是有效的荧光猝灭剂。1484。§4.3电荷转移猝灭某些猝灭剂与荧光物质在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂分子相互碰撞时，最初形成了“遭遇配合物”，而后成为实际的激态电荷转移配合物：M＋Q＋KT在介电常数小于10的非极性溶剂中，可观察到有激发态转移配合物所产生的荧光。但其荧光与1M*的相比，光谱处于更长的波长范围，且无精细结构。149在电荷转移猝灭中，荧光物质的激发态分子与猝灭剂在极性溶剂中，1M*的荧光被猝灭剂猝灭时，通常并不伴随由基态电荷转移配合物所产生的荧光，代之而发生的是遭遇配合物形成离子对，再经溶剂化作用转变为游离的溶剂化离子。150在极性溶剂中，1M*的荧光被猝灭剂猝灭时，通常具有重原子的猝灭剂分子，它们与荧光物质的激发态分子所形成的电荷转移配合物，有利于电子自旋的改变，以致发生电荷转移配合物的离解并伴随着经由三重态的能量降低：151具有重原子的猝灭剂分子，它们与荧光物质的激发态例：甲基蓝荧光溶液被Fe2+离子熄灭D+hυ→D*D*→D+hυ＇D*+Fe2+→D－+Fe3+D－+H→DH（半醌）2DH→D+DH2（无色染料）某些染料如甲基蓝的荧光可被Fe2＋猝灭，这是由于甲基蓝的激发态分子与Fe2＋发生氧化还原反应：152例：甲基蓝荧光溶液被Fe2+离子熄灭某些染料如甲

发生电子转移反应的猝灭剂并不限于金属离子，I-，Br-，CNS-，S2O32-等易于给出电子的阴离子对奎宁，罗丹明及荧光素钠等有机荧光物质也会发生猝灭作用。I->CNS->Br->Cl->C2O42->SO42->NO3->F-这一顺序与电力势的增大相关联，表明这些离子对染料荧光的猝灭效率与它们给出电子的难易程度有关。153发生电子转移反应的猝灭剂并不限于金属离子，I-，光诱导电荷转移（photo-inducedchargetransfer)Excitationofafluorophoreinducesthemotionofanelectronfromoneorbitaltoanother.Iftheinitialandfinalorbitalsareseparatedinspace,theelectronictransitionisaccompaniedbyanalmostinstantaneouschangeinthedipolemomentofthefluorophore.Whenthelatterpossessesanelectron-donatinggroup(e.g.-NH2,-NMe2,-CH3O)conjugatedtoanelectron-withdrawinggroup(e.g.-C=O,-CN),theincreaseindipolemomentcanbequitelarge.Consequently,theexcitedstatereacheduponexcitation(calledtheFranck–Condonstateorlocallyexcitedstate,LE)isnotinequilibriumwiththesurroundingsolventmoleculesifthelatterarepolar.Inamediumthatissufficientlyfluid,thesolventmoleculesrotateduringthelifetimeoftheexcitedstateuntilthesolvationshellisinthermodynamicequilibriumwiththefluorophore.Arelaxedintramolecularchargetransfer(ICT)stateisthenreached.154光诱导电荷转移（photo-inducedchargeInlow-polaritysolventsFPPemitsatshortwavelengthsfromtheLEstate(toptwopanels).Asthesolventpolarityincreasesanewlongerwavelengthemissionappears.Thislonger-wavelengthemission(lowerpanel)isduetoaninternalcharge-transfer(ICT)state,whichformsrapidlyfollowingexcitation.Inthiscasethetwoendsofthefluorophoreareheldrigidlybythemethylenebridge,sothatformationoftheICTstatedoesnotdependonthetwisting.例1.155Inlow-polaritysolveFigure.EmissionspectraofFPPinseveralsolvents.156Figure.EmissionspectraofFP例2.Figure.EmissionspectraofLaurdaninethanolat–50°C(1),–60°C(2),–70°C(3),–80°C(4),–85°C(5),–90°C(6),–100°C(7),–110°C(8),and–190°C(9).157例2.Figure.Emissionspectra例3.dimethylamino-substitutedBodipyfluorophore158例3.dimethylamino-substitutedFigure.Emissionspectraofadimethylamino-substitutedBodipyindifferentsolvents.159Figure.Emissionspectraofa1602716128Anal.Chim.Acta2008,627,254–257.Aselectivecolorimetricchemosensorforthiolsbasedonintramolecularchargetransfermechanism例4:162Anal.Chim.Acta2008,627,216330例5:ARatiometricFluorescentProbeforCysteineandHomocysteineDisplayingaLargeEmissionShiftOrg.Lett.，2008，10，5577-5580.164例5:ARatiometricFluorescentFig.1.Absorptionandfluorescencespectralchangesofprobe1uponadditionofincreasingconcentrationCys.165Fig.1.Absorptionandfluoresc例6：166例6：33FluorescentspectraofPBI(a）and4（b)b167FluorescentspectraofPBI(Fig.Absorption(left)andfluorescentemissionspectra(right)of4towarddifferentconcentrationsofbisulfite168Fig.Absorption(left)andflu§4.4能量转移猝灭根据能量转移过程中作用机理的不同，能量转移可分为辐射能量转移和非辐射能量转移两种。其中非辐射能量转移又有两种不同的机理假设，即通过偶极－偶极耦合作用的共振能量转移和通过电子交换作用的交换能量转移。169§4.4能量转移猝灭根据能量转移过程中作用机1.辐射能量转移猝灭这种能量转移过程实质上是荧光的再吸收。即荧光分子（能量供体）所发射的荧光为猝灭剂（能量受体）所吸收，从而导致后者被激发。这种能量转移过程仅仅是供体发射的荧光按照比尔定律为受体所吸收。这种能量转移过程的地效率决定于供体的发射光谱和受体的吸收光谱两者的重叠程度。重叠程度越大，能量转移的效率越高。1701.辐射能量转移猝灭这种能量转移过程实质上Non-radiativetransferofexcitationenergyrequiressomeinteractionbetweenadonormoleculeandanacceptormolecule,anditcanoccuriftheemissionspectrumofthedonoroverlapstheabsorptionspectrumoftheacceptor,sothatseveralvibronictransitionsinthedonorhavepracticallythesameenergyasthecorrespondingtransitionsintheacceptor.Suchtransitionsarecoupled。2.非辐射跃迁能量转移：171Non-radiativetransferof非辐射跃迁的形式：库仑相互作用172非辐射跃迁的形式：库仑相互作用39173403.共振能量转移当供体分子和受体分子相隔的距离大于供体－受体的碰撞直径时，只要供体分子的基态和第一激发态两者的振动能及间的能量差相当于受体分子的基态和第一激发态两者的振动能及间的能量差，这种情况下，仍然可发生从供体到受体的非辐射能量转移（长距离能量转移）。1743.共振能量转移当供体分子和受体分子相隔的距这种能量转移过程，是通过偶极－偶极耦合作用的共振能量转移过程。分子具有特征的振动能层，因而可提供许多近似的共振途径，这种共振途径越多，共振能量转移的概率越大。175这种能量转移过程，是通过偶极－偶极耦合作用的共振A,B,C和A‘，B’，C’所表示的跃迁是耦合的跃迁，当激发态的供体分子和基态的受体分子相距某一适当的距离时，供体分子跃迁衰变到基态时，同时诱发了受体分子通过A‘，B’，C’跃迁而被激发到激发态。176A,B,C和A‘，B’，C’所表示的跃迁是耦对于以固定距离r相隔的某个供体－受体对而言，其共振能量转移的速率可表示如下：式中：φD为没有受体存在的情况下供体的发射量子产率；n为介质的折射率；N为阿佛加德罗常数；r为供体偶极中心到受体偶极中心的平均距离；tD为没有受体存在下供体的辐射寿命；FD（v）为供体在v至v＋dv波数间隔内的校正荧光强度，εA为受体在波数