人神经生长因子对大鼠中枢胆碱能神经元损伤后作用的实验研究

1、    人神经生长因子对大鼠中枢胆碱能 神经元损伤后作用的实验研究        【摘要】目的研究人神经生长因子(HNGF)对大鼠中枢胆碱能神经元轴突切断后的保护作用。方法向双侧海马伞切断所致的痴呆大鼠脑室内注入HNGF，采用穿梭箱训练，检测大鼠学习记忆功能恢复状况，对脑内隔-斜带复合体(S-DB)中隔区(MS)胆碱能神经元采用胆碱乙酰基转移酶(CHAT)免疫组化法观察其存活状态。结果HNGF组大鼠术后两周内穿梭箱回避次数高于对照组(P0.01)，回避潜伏期短于对照

2、组(P0.01)。免疫组化及像分析显示，其胆碱能神经元存活状态优于对照组。结论HNGF对大鼠中枢胆碱能神经元损伤具有短期保护作用；减缓轴突切断引起的退行性变，对痴呆大鼠学习记忆功能恢复有促进作用。【关键词】神经生长因子胆碱能神经元损伤 Experimental study for the effect of human nerve growth factor on the septal cholinergic neurons after axotomy in the adult rat brainCHENG GangGe,ZHANG Ji, WANG Jazheng,et al.Departm

3、nt of Neurosurgry, General Air Force Hospital,Beijing 100036【Abstract】ObjectiveTo study the protective effect of human nerve growth factor on the septal cholinergic neurons suffering from axotomy in adult rats.MethodsAdult rats with bilateral transections of fimbria received intra-ventricular infusi

4、on of HNGF or saline.The acquisitions of active avoidance conditioned response were investigated after frimbia lesions to examine the function on recovery of study and memory.The choline acelytransferase immunoreactive neurons in the septal complex were visualized to observe their survival state.Res

5、ultsThe rats with HNGF treatment acquired the active avoidance conditioned responses more rapidly than those suffering from the same injury but with saline(P<0.01),both in avoid numbers and latency time.The immunocyto chemistry and the image analysis showed that the survival state of cholinergic

6、neurons with HNGF was better than those with saline.ConclusionsHNGF can not only protect the lesioned neurons and significantly reduce axotomy-induced degenerative changes of these cholinergic neurons in the septal complex but also promote behavioral recovery of the lesioned dimentia rat in the shor

7、t period of postoperation.【Key words】Human nerve growth factorCholinergic neurons injury近年研究发现神经生长因子对基底前脑胆碱能神经元具有保护作用，是促进神经元存活和功能修复的重要因素。在治疗与中枢胆碱能神经元损伤或退行性变有关的疾病方面具有潜力。我们通过实验，从形态学和行为学研究其对痴呆鼠的作用，为临床提供实验依据。报告如下：材料和方法1. 动物分组：Wister 雄性大鼠80只，体重200250克。首先检测动物记忆能力，每天上午9时行主动回避穿梭箱训练1(仪器：SOF-700LS Shuttlc Box

8、 Avoidcncc 美国)，1次/天。连续5天，记录回避次数，潜伏期。灯亮为条件刺激，电击时间5S，电流1.5mA，共30次。按动物记忆力应均衡的原则随机分为3组，假手术组(Sham)组n=26,对照组(Control)组n=27，HNGF组n=27。2. 痴呆鼠模型建立2：将HNGF组和Control 组大鼠经复方氯胺酮麻醉，固定在脑立体定位仪上。剪去头皮，形成以前囟为中心，直径1.0cm的圆型头皮缺损，显露颅骨，定位海马伞切断坐标：前囟后1.9mm，中线旁1mm。将自制宽为4mm的扁刀自颅骨表面，垂直向下切入5mm，左右各一次，即完成海马伞切断。Sham组刀向下23mm，只切断相应部位皮

9、层。3. 给药与训练：海马伞切断后随即安装脑室内导管，方法参照龙大宏等2方法。HNGF组随即注入10l(10g,2.5U)HNGF(从人胎盘中提取，南京军区军事医学研究所提供。)，术后第5，10天分别再给5l。给药速度2l/min，注药后，插入内芯，以防药液外渗；Sham和Control 组同法注入生理盐水。术后肌注青霉素5天，以防感染，第5天行穿梭箱训练，一次/天，历时12天直到第16天为止。记录回避次数、潜伏期。4. 免疫细胞化学染色：所有大鼠于术后第17天处死。免疫组化法参照董新文方法3。切片头端始于胼胝体交叉的起始水平，尾端至前连合交叉前缘，片厚40m，每隔0.2mm取一张切片，作CH

10、AT免疫组化染色。从头端开始，各取一个系列切片中的5个切面，为S-DB复合体的代表平面。5. 形态计量学：3 (1)计数：对每只动物隔-斜带核(S-DB)复合体的五个代表平面中的内侧隔核(MS区)的CHAT阳性神经元计数，方法为在显微镜下记录有细胞核和至少一个突起的神经元。MS区CHAT阳性神经元相对总数是五个平面CHAT阳性神经元个数之和。(2)像分析：测定每组第3张切片中MS区CHAT阳性细胞面积、吸光度。6. 统计学处理：所有数据做t检验。结果1. HNGF对痴呆大鼠学习记忆的影响：见表1。 表1术后各组历时12天Shuttlebox总平均回避次数，潜伏期(±s)组别n回避次数

11、潜伏期(S)SHAM2622±43.68±0.56HNGF 2719±4?4.14±0.85?CONTROL276±4?6.02±0.40?*P0.01，*P0.01 2. HNGF对胆碱能神经元形态学的影响：见表2。 Sham组和HNGF组S-DB复合体CHAT阳性神经元分布范围较广，左右两侧大致相等。MS两侧CHAT阳性神经元结合形成倒“V”形，靠近中线细胞中等大小，中线外侧的细胞较小，细胞多呈椭圆形，突起较小。Control组S-DB复合体CHAT阳性神经元数量分布明显减少，细胞呈现萎缩状态，突起明显减少，出现轴突的断裂。讨论1

12、. NGF是神经细胞生长调节因子，由靶细胞分泌，被神经元末梢吸取，对维持神经元的生长、发育起重要作用。中枢神经系统中(CNS)NGF 的效应神经元是隔区、斜束核和基底核的胆碱能神经元，其轴突投射到皮层和海马，构成胆碱能通路，其功能与学习和记忆关系密切。实验证实CNS中注入NGF后，可由海马逆行运输到内侧隔区和斜束核，从新皮层逆行到基底核，使这些脑区的胆碱能神经元的cAMP、胆碱乙酰基转移酶(CHAT)活性均增高，表明NGF对脑胆碱能神经元的正常发育和功能维持有明显的效应。海马伞切断后造成隔区胆碱能神经元NGF来源丧失，胆碱能神经元变性坏死，此时向脑内输注外源性NGF能减少胆碱能神经元的丧失2，

13、4。本实验证实HNGF对双侧海马伞切断的大鼠脑内S-DB复合体中胆碱能神经元表2HNGF对MS区CHAT阳性神经元计数、面积、吸光度的影响(±s)组别n计数面积(m2)吸光度SHAM26743±57120.81±42.530.19 ±0.03HNGF 27716±30(96%)?118.29±44.870.18±0.02CONTROL27314±41(43%)?81.56±40.310.09±0.02*P0.01，?*P0.01，*P0.01 具有保护作用；对大鼠学习记忆行为的改善有促进作用。在

14、术后516天连续Shuttlebox 训练中HNGF组的平均回避次数高于对照组，且随训练次数的增加，HNGF组平均回避次数上升快于对照组，平均潜伏期下降快于对照组，且较之缩短。说明HNGF对痴呆鼠的学习获取能力和记忆保持能力的提高有促作用。从细胞形态学来看，HNGF组CHAT阳性细胞数量明显高于对照组，为Sham组的96%；而Control组仅为43%。HNGF组胆碱能神经元的面积明显大于对照组，Control组细胞明显萎缩，突起减少，吸光度小于HNGF和Sham组，表明HNGF可减少胆碱能神经元的CHAT含量的下降，其细胞存活质量优于对照组。从行为学和形态学方面为HNGF的临床应用提供了实验

15、依据。2. 学习与记忆是动物和人赖以生存所不可缺少的重要脑功能，而突触起着至关重要的作用，学习和记忆过程中有关的突触发生了某些变化，导致突触连接的增强和传递效应的提高。隔-海马通路与学习记忆关系密切，切断后造成动物痴呆1，2，4。有人2将NGF注入痴呆鼠脑内，可使痴呆鼠损伤侧海马齿状回分子层内突触的数量和形成得到修复，从而促进了大鼠学习和记忆功能的恢复。推测这种作用是由于NGF促进去神经支配区的胆碱能纤维数量增加，使新的突触不断形成的结果。此外NGF还能促进单个轴突末梢形成较多的突触，这有助于神经元损伤后功能的迅速恢复。在突触传递过程中递质起着关键作用，本实验证实HNGF可减少损伤后胆碱能神经

16、元CHAT含量的下降，有助于合成和释放乙酰胆碱(ACH)，可能与痴呆鼠记忆功能的改善有关2，4，5。Tuszynski等6报道了重组人NGF注入灵长类动物脑室可防止单侧穹窿横切造成的胆碱能神经元变性，促进轴突生长，且MS区CHAT、NGF受体标记的强度增加。3. NGF在治疗神经损伤动物模型中获得的成功，预示临床应用具有广阔前景。我们认为在加强基础研究的同时，应逐步扩大临床应用。目前NGF临床主要用于治疗脑脊髓外伤和基底前脑胆碱能神经元退行性变所致的早老性痴呆(Alzheimer's disease)，并取得了一些成果 。Olson7首次报道NGF早老性痴呆的临床实验，一位69岁的痴呆

17、患者经3个月的脑室内输注NGF后，皮层脑血流量、脑电和语言记忆测试都明显改善。但是，也应看到NGF的临床仍有许多问题待解决。首先，人的NGF来源甚少，不能满足临床需要，因此，利用基因工程大规模的生产成为开展应用的必要前提。其次，NGF不能透过血脑屏障，故设计合理的给药途径，解决通过血脑屏障和长期稳定释放是一关键课题。近年来进行了基因工程化细胞移植和聚合物胶囊化细胞移植有望解决这一难题。本实验仅从形态学及行为学就HNGF对受损的中枢胆碱能神经元和痴呆大鼠的短期作用进行了研究，其长期疗效及作用机制有待进一步探讨。作者单位：100036北京空军总医院神经外科(程钢戈)；北京解放军总医院神经外科(张纪

18、、段国升、周定标、雪梅、朱萍)；北京解放军军事医学科学院三所(汪家政、赵楠)参考文献1Casamenti F,Dipatre PL,Bartolini L,et al.Unilateral and bilateral nucleus basalis lesions:differences in neurochemical and behavoural recovery. Neuroscience,1988,24:209-215.2龙大宏，姚志彬，何蕴韶, 等.神经生长因子促进老年痴呆鼠学习记忆恢复和海马突触重建.神经解剖学杂志，1996，12：131-136.3董新文.大鼠隔-斜带复合体中含小白蛋白和含胆碱乙酰化酶的神经元.解剖学报，1994，25：6-11.4Heftei F.