矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成Ⅰ型胶原的实验研究

1、矿化诱导促进冻存骨髓基质细胞在裸鼠体内形成型胶原的实验研究         10-11-15 10:59:00     编辑：studa20                   作者：袁芳，李厚轩，金峰，郑瑜谦，闫福华【摘要】  目的 观察矿化诱导培养能否促进冻存骨髓基质细胞（BMSCs）

2、在裸鼠体内形成型胶原，为牙周组织工程中选择适宜的种子细胞的保存和培养条件提供参考。 方法 体外分离培养Beagle犬BMSCs，经冻存12个月后，在矿化诱导培养液（矿化诱导组）或基础培养液（非矿化诱导组）中形成BMSCs胶原膜支架复合物，将矿化诱导培养液处理的单纯胶原膜支架(空白对照组)、2种BMSCs胶原膜复合物分别植入裸鼠背部皮下组织中，术后第4周行组织病理学和免疫组织化学观察，分析各组标本中的型胶原形成量。 结果 空白对照组植入胶原膜后，新生胶原分布很少；非矿化诱导组胶原分布明显增多；矿化诱导组中见大量新生的胶原形成。免疫组织化学光密度测量显示，矿化诱导组(0.1963±0.0

3、126)>非矿化诱导组(0.1489±0.0037)>空白对照组(0.0775±0.0058)（P<0.05）。 结论 矿化诱导培养能够促进冻存的BMSCs在裸鼠体内形成型胶原。 【关键词】  低温保存； 骨髓细胞； 型胶原； 牙周组织； 组织免疫组织化学    ABSTRACT:  Objective  To explore the effects of osteoinductive culture on the synthesis of type collagen by bone marrow

4、 stromal cells (BMSCs) in nude mice.  Methods  BMSCs from beagle dogs were harvested and cryopreserved for 12 months.  Recovered  BMSCs were combined with collagen scaffold in vitro in osteoinductive or nonosteoinductive culture medium.  Osteoinductive conditioned collagen s

5、caffold alone, osteoinduced and noninduced BMSCsscaffold complex were respectively implanted into the subcutaneous tissues of nude mice for 4 weeks.  Type collagen formation was evaluated by H&E staining and immunohistochemistry(IHC).  Results  Scarce collagen fibers were observed

6、 in the group implanted with collagen scaffold alone, moderate collagen fibers in noninduced BMSCsscaffold group, and large quantities of newly formed collagen fibers in osteoinduced BMSCsscaffold group.  Enhanced formation of type collagen was observed in osteoinduced BMSCsscaffold group (0.19

7、63±0.0126), with lesser formation in noninduced BMSCsscaffold group (0.1489±0.0037) and scaffold alone group(0.0775±0.0058)（P<0.05）.  Conclusion  Osteoinductive culture can enhance type collagen formation in nude mice by cryopreserved BMSCs.    KEY WORDS:&#

8、160; cryopreservation； bone marrow cells； collagen type ； periodontium； immunohistochemistry； disease models,animal    骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一种能分化为成纤维细胞、成骨细胞和脂肪细胞等多种类型细胞的多能干细胞，在骨组织、软骨组织以及牙周组织缺损的再生医学中有着广泛的应用前景1。本课题组前期研究发现，冻存BMSCs复苏传代后，在体外培养条件下仍保持了较高的细胞存活率、细胞增殖及成骨分化能力，

9、并且具有未冻存细胞相似的体内促进牙周组织再生的能力23。寻找适宜的细胞培养条件对于牙周再生医学有着重要意义。因此，本实验拟研究矿化诱导培养能否促进冻存后的BMSCs在裸鼠体内形成型胶原，从而为选择适宜培养条件、提高BMSCs体内再生牙周组织的能力提供参考。1  材料和方法1.1  实验动物及主要试剂 健康成年Beagle雌性犬（体质量11 kg)、BALB/c裸鼠42只(46周，体质量1823 g)；新生牛血清(江滨生物，杭州)；DMEM(Gibco，美国)；地塞米松、维生素C和甘油磷酸钠(Sigma，美国)；BME10X医用胶原膜 (北京中国医学科学院生物医学工

10、程研究所)；型胶原抗体、SABC过氧化物酶试剂盒(博士德生物，武汉)；DAB显色试剂盒、EDTA抗原修复液(福州迈新生物技术开发有限公司)。1.2  方法1.2.1  BMSCs的分离与冻存 采用实验室所用的“改良全骨髓培养法”获取细胞4，培养传至第2代；将2.5×106 mL-1 BMSCs以10%二甲基亚砜、10%新生牛血清、80% DMEM为冻存培养液，按4 0.5 h、-20 0.5 h和-80 冰箱过夜后放入液氮中，低温保存12个月。1.2.2  BMSCs的复苏与培养 冻存的BMSCs在37 恒温水浴中迅速翻转解冻，离心、

11、弃冻存液，收集细胞于标准环境中培养备用。以含10%的新生牛血清的DMEM为基础培养液，以含10%新生牛血清、10-8 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C和10 mmol/L 甘油磷酸钠的DMEM为矿化诱导培养液，复苏细胞在基础培养液和矿化诱导液中分别与支架在体外复合。1.2.3  BMSCs胶原膜的复合 将0.5 cm×0.5 cm的胶原膜在24孔板内分别加入基础培养液与诱导培养液预湿；取复苏的BMSCs，以终浓度为1×107 L-1接种于已预湿的胶原膜上，每片接种30 L，暂不加培养液，置37 、体积分数为0.05的CO2孵箱中培养0.5 h；然后分别加入基础培养液与诱导培养液2 mL继续培养，隔日换液，倒置显微镜下观察细胞附着情况。1.2.4  BMSCs胶原膜复合物的植入 BMSCs胶原膜支架体外复合培养5 d后，将裸鼠用100 mg/kg氯胺酮麻醉后，于背部作前后向约0.6 cm的切口，切开皮肤及皮下组织，在裸鼠皮下分别植入相应复合物。分组情况为：（1）矿化诱导组（15只）：植入在矿化诱导培养液中复合的BMSCs胶原膜复合物；