植物愈伤组织培养及其应用-本科实验报告

1、本科学生实验报告学号 124120439 姓名 牟兴玲 学院 生命科学学院 专业、班级 12级生物技术 实验课程名称 植物愈伤组织培养及其应用 指导教师及职称 郝大海 开课时间 2014 至 2015 学年 上 学期填报时间 2014 年 12 月 16 日云南师范大学教务处编印实验名称：植物愈伤组织培养及其应用实验时间：2014年9月至2014年12月小组合作： 是一、实验预习1实验目的（1）、掌握培养基母液配制方法（2）、掌握培养基配制方法（3）、熟悉无菌材料继代、繁殖操作（4）、熟悉愈伤组织诱导、再分化技术（5）、熟悉试管苗移栽、定植技术2、实验设备及材料 （1）、仪器设备：高压蒸汽灭菌

2、锅、洁净工作台、循环水式真空泵、电子天平、酸度测定仪、光照培养箱,搪瓷杯、搪瓷盘、100 ml三角烧瓶（12个/组）、150 ml三角瓶、试剂瓶、剪刀、长镊子、培养皿、移液管、漏斗、量筒、烧杯（50、100、500、1000 m1），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、线绳、牛皮筋、脱脂棉、滤纸、pH试纸（5.4-7.0）、标签纸、称量纸、药勺等。（2）、试剂：95%酒精，1N NaOH，1N HCl，硝酸铵，硝酸钾，氯化钙，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸锰，硫酸锌，氯化钴，硫酸铜，钼酸钠，碘化钾，硼酸，Na2EDTA，硫酸亚铁，盐酸，盐酸吡哆素（VB6），盐酸硫胺素（VB1），肌醇，甘氨酸，蒸

3、馏水。（3）MS继代培养基的配制及灭菌仪器：pH试纸、电磁搅拌器、电炉用具：高压灭菌锅、微量移液器、移液管、量筒、容量瓶、培养瓶（三角瓶）、烧杯、标签试剂：配制MS培养基的各种母液、生长调节剂、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1 N NaOH，1 N HCl3、 实验原理及实验流程或装置示意图： （一）植物组织培养是指植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。 母液配制：在植物组织培养工作中，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液的浓缩液，这样不但可以保证各物质成

4、分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏。（二）培养基成分：水、无机盐、有机物、植物激素、培养体的支持材料、其他辅助性物质（三）灭菌（1）有菌的区域是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。因此，无菌室未处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表，呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。（2）菌包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。（3）无菌的区域：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的)，高层大气、岩石内

5、部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部，强酸强碱，化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的。（4）灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的微生物全部杀死。（5）消毒：指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物，所以通过严格灭菌的操作空间(接种室、超净台、等)和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。（6）在这样的条件下进行的操作，就叫做无菌操作。（7）无菌操作、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌用前干热灭菌：160-1

6、80,1.5-2.0h用前湿热灭菌：121, 20-30min接种前用酒精棉球擦试，浸入75%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌干热灭菌：烘箱加热到160-180,1.5-2.0h湿热灭菌：121, 20-40min接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。、空间采用紫外线和熏蒸灭菌紫外灯照射(接种室、超净台、接种箱)：波长260nm，距离小于1.2m，20-30min。臭氧灭菌机：1-2h熏蒸灭菌：5-8ml/m3甲醛+5g/ m3 高锰酸钾；冰醋酸；1-3%高锰酸钾或3%来苏儿。 接种台喷雾消毒：75%酒精。、实验服、口罩、滤纸灭菌湿热灭菌：121,

7、20-30min紫外线灭菌。实验服灭菌后置于缓冲间或密封好。、物体表面用药剂喷雾/擦拭灭菌灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 范围：桌面、墙面、双手、材料表面消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；0.25-1%新洁尔灭；洗衣粉；吐温-80（8）常用的灭菌方法物理方法 如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法 使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的材料不同目的适当选用。、培养基用湿热灭菌高压蒸汽灭菌、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌（95%的酒精，酒精

8、灯火焰上灼烧）、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌（烘箱加热到160-180持续90分钟）、不耐热的物质采用过滤灭菌（一些生长调节剂如赤霉素、玉米素、脱落酸和一些化学成分在高温高压下会发生降解而失去效能或降低效能）、空间采用紫外线和熏蒸灭菌（紫外线灭菌与熏蒸灭菌）、一些物体表面用药剂喷雾灭菌（ 75%的酒精1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭）、植物材料表面用消毒剂灭菌、无菌室内的空气采用过滤灭菌（超净工作台的空气过滤网）（9）愈伤组织诱导与再分化l 定义:是指将外植体接种到人工培养基上，在激素作用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。l 诱导愈伤组织的关键主要是培养条件，其

9、中激素的成分和浓度是最重要的因素。l 从外植体脱分化形成愈伤组织大致可分为三个时期：诱导期：细胞准备进行分裂的时期，是愈伤组织形成的起点。分裂期：指外植体细胞经诱导脱分化，不断分裂、增生子细胞的过程。分化期：指愈伤组织细胞停止分裂，细胞内发生一系列形态和生理上的变化,形成一些不同形态和功能的细胞的时期。试管苗移栽驯化l 试管苗移栽是组织培养过程的重要环节，为做好试管苗的移栽，应该选择合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个组织培养工作的顺利完成。l 试管苗必须通过炼苗，如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然

10、环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。（10）、移栽用基质和容器基质要求：具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点。 常用基质：珍珠岩、蛭石、砂子等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。基质配比：珍珠岩：蛭石：草炭土或腐殖土=1：1：0.5。砂子：草炭土或腐殖土=1：1。移栽基质在使用前应高压灭菌。4、 实验方法步骤及注意事项：（一）MS液（1）、MS大量元素母液（10X）称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取100ml。化学药品工作液（1升）母液（1升）NH4NO31650 mg/L165gKNO31900 mg/L190gCaCl22H2O

11、440 mg/L44gMgSO47H2O370 mg/L37gKH2PO4170 mg/L17g（2）. MS微量元素母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。化学药品工作液母液（1L）MnSO44H2O（ MnSO4H2O）223 mg/L（214 mg/L）223mgZnSO47H2O 86 mg/L86mgCoCl26H2O0025mg/L025mgCuSO45H2O0025 mg/L025mgNa2MoO42H2O025 mg/L25mgKI083 mg/L83 mgH3BO362 mg/L62 mg（3）、MS铁盐母液（100X）称10升量溶解在1

12、00ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。化学药品1升量母液（100ml）Na2EDTA373 mg/L373 mgFeSO47H2O278 mg/L278 mg （4）、MS有机物母液（100X）称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基母液10ml。化学药品1升量母液（100ml）烟酸05 mg/L5 mg盐酸吡哆素（VB6）05 mg/L5 mg盐酸硫胺素（VB1）0.1 mg/L1 mg肌醇100 mg/L1 g甘氨酸2 mg/L20 mg（二）母液的保存（1）装瓶：将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。（注意将易分解、氧化者，放入棕

13、色瓶中）（2）贮藏：4冰箱。（3）实验流程：量取大量元素量取微量元素量取钙盐、铁盐和其它有机物称取蔗糖和琼脂配制MS培养基调PH值分装培养基培养基灭菌（三）MS固体培养基的配制 1、将配制好的MS培养基母液从冰箱中取出，按顺序排列，并逐一检查是否沉淀或变色，避免使用已失效的母液。2、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。注意：配500ml培养基用1000ml烧杯。3、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。MS培养基配制母液用量试剂母液用量（1L培养基）大量元素母液100ml微量元素母液10ml铁盐母液10ml有机物母液10ml生长调节剂母液蔗糖3

14、0g4. 加琼脂，煮沸 至琼脂熔于水中5. 定容6. 调节pH至6.2左右7. 分装培养基至150ml三角瓶：用NaOH或HCl调pH值为6.2，趁热分装，150ml的三角瓶约装入3040ml,35瓶/L。8. 扎口：要求封口松紧适宜，系活扣，便于接种操作。培养基应及时灭菌，防止变质（四）培养基灭菌1. 打开灭菌锅盖，向锅内加水。2.加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。3. 加盖，旋紧螺旋（注意用力均衡）。4. 打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5分钟，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而

15、上升。5. 待压力逐渐上升到所需压力及温度时（一般为15磅/吋， 1.03410 5Pa，121）, 灭菌30分钟。6 灭菌后，待压力降至0时，开盖，取出灭菌物品。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。（五）马铃薯试管苗快繁1、无菌操作流程（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对

16、培养皿要过火烤干；（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。2、接种一般步骤试管苗驯化移栽炼苗：移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。试管苗移栽：取出发根的小苗用自来水洗掉根部粘着的培养基栽植苗周围基质压实轻浇薄水移入高湿度（相对湿度 90 ）环境。3、试管苗的管理(1)保持小苗的水分供需平衡在移栽后5-7d内给予较高的空气湿度，搭设小拱棚，初期要常喷雾处

17、理 5-7d后逐渐降低湿度，减少喷水次数拱棚通风约15d以后揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，逐渐减少浇水，促进小苗长得粗壮。(2)防止菌类滋生对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌。适当使用一定浓度的杀菌剂，如多菌灵、托布津，浓度800-1000倍，喷药宜7-l0d一次。喷水时可加入0.1的尿素，或用12MS大量元素的水溶液作追肥，可加快苗的生长与成活。(3)一定的温、光条件适宜的生根温度是18 20，初期可用较弱的光照。如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。(4)保持基质适

18、当的通气性选珍珠岩作基质，保证良好的通气作用。4、愈伤组织诱导（Callus introdution）（1）诱导培养基准备植物生长调节物质母液配制l NAA：热水或少量95的酒精 加水定容；l BA：少量1mol的HCI中加水定容；配制好的母液瓶上应分别贴上标签，注明母液名称、浓度及单位、日期。（2）培养基准备l MS+NAA 2mg/L+BA 0.5mg/Ll MS培养基成分同前l 加入激素母液l 配制、分装、灭菌过程同前（3）接种及继代l 材料：马铃薯试管苗茎段l 培养条件：全黑暗一周转至新培养基25，弱光照l 再次转接二、实验内容1、 实验现象、数据及观察结果与自然条件一样，组织培养中的

19、材料的生长要受到温度、光照、湿度等各种物理条件，不同气体、培养基的组成、pH值和渗透压等各种化学条件，以及外植体部位、大小、细胞密度等各种生物条件等环境条件的影响。实验过程中要注意考虑这些条件的影响，并采取适当的措施控制好这些条件。马铃薯苗愈伤组织诱导培养时，在恒温箱全黑条件下培养1周就可看出诱导结果，1-2周可用于继代培养。马铃薯愈伤组织诱导培养时，在恒温箱全黑条件下培养1周就可看出诱导结果，1-2周可用于继代培养。为了提高成活率，在培养基质中掺入75的百菌清可湿性粉剂200-500倍液，以进行灭菌处理。2、 对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论：在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培

20、养离体植物组织（器官 或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。通过组织培养得到的植物体的特点：组织培养得到的植物体的遗传物质 与原植物体的遗传物质完全相同，表现出的性状完全一样（排除基因突变等情况）。需要注意的是如果用亲本的花粉进行组织培养，那么得到的植株会是单倍体，单倍体的遗传物质自然也就比用体细胞培养的植株的遗传物质减少一半。植物组织培养的实质是：基因的选择性表达 在后期的愈伤组织的脱分化在生根的过程中应考虑愈伤组织发生不定芽 和不定根的能力与哪些因素有关；愈伤组织再生成完整植株有几种方式；怎样尽量避免

21、出现褐变和玻璃化苗；试管苗驯化中应注意调节什么因素；如何估测增殖率；如何安排快速繁殖计划等一系列的问题。 3、结论：1、植物组织培养的理论基础是什么？答：植物组织培养是指植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。2、培养基的成分主要包括有哪些？答：水、无机盐、有机物、植物激素、培养体的支持材料、其他辅助性物质等。3、在组织培养过程中，常用的灭菌方法有哪些？答：物理方法 如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量

22、无菌水冲洗等措施；化学方法 使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的材料不同目的适当选用。3、 何谓继代培养？继代培养的目的？何谓生根培养？生根培养的目的？答：继代培养是在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多，它们需要进一步增殖，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。若不能及时将培养物转到生根培养基上，就会使久不转移的苗子发黄老化，或