16s_rdna菌种鉴定

1、16SrDNA方法鉴定细菌种属一目的1. 掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。二、原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23Sr

2、RNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分析较困难。而16SrRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。在细菌的16SrDNA中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补，而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此，16SrDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。随着核酸测序技术的发展，越来越多的

3、微生物的16SrDNA序列被测定并收入国际基因数据库中，这样用16SrDNA作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。1、16SrRNA普遍存在于原核生物中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。2、在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。3、16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。4、可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物,将16SrDNA片段

4、扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。利用16SrDNA鉴定细菌的技术路线:序列比对三、操作步骤(一)细菌基因组DNA提取1. 挑单菌落接种到10mLLB培养基中37C振荡过夜培养。2. 取2mL培养液到2mLEppendorf管中，8000rpm离心2分钟后倒掉上清液。3. 加140pLTE打散细菌，再加入60pL10mg/ml的溶菌酶。37C放置1

5、0分钟。4. 加入400pLDigestionBuffer，混匀。再加入3pLProteinK,混匀，55C温育5分钟。5. 加入260pL乙醇，混匀，全部转入UNIQ-10柱中。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。6. 加入500pL70%乙醇(WashSolution)，10000rpm离心0.5分钟。7. 重复第六步。8. 再10000rpm离心2分钟彻底甩干乙醇。吸附柱转移到一个新的1.5mL的离心管。9. 加入50预热(60C)的洗脱缓冲液，室温放置3分钟。12000rpm离心2分钟，流下的液体即为基因组DNA。10. 电泳。取3溶液电泳检测质量。(二)PCR扩增1. 根

6、据已发表的16SrDNA序列设计保守的扩增引物。16S(F)5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-316S(R)5-GGTTACCTTGTTACGACTT-32. PCR扩增体系：在0.2mLEppendorf管中加入1LDNA，再加入以下反应混合液:16S(R)10xPCRBuffer1L(10M)5LdNTP4LTaq酶0.5L加ddH2O使反应体系调至50L,简单离心混匀。3. PCR反应将Eppendorf管放入PCR仪，盖好盖子，调好扩增条件。扩增条件为:94C3min94C30sec50C45sec72C100sec72C7min35cycles4. PCR产物的电泳检测拿

7、出Eppendorf管，从中取出5L反应产物，加入1L上样缓冲液，再加入4ul的ddO混匀。点入预先制备好的1%的琼脂糖凝胶中。电泳1hr。在紫外灯下检测扩增结果。（三）扩增片段的回收根据上步实验结果，如果扩增产物为唯一条带，可直接回收产物。否则从琼脂糖凝胶中切割核酸条带，并回收目的片段。1）称量一2mL.的Eppendorf管质量，记录。2）在紫外灯下切割含目的条带的凝胶，放入2mL的Eppendorf管内，称量。计算凝胶质量。3）每100mg凝胶加入100BindingBuffer，混匀。60C温育至凝胶融化。4）全部转入UNIQ-10柱中。10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。5）加入500BindingBuffer，10000rpm离心1分钟，倒去收集管内的液体。6）加入70%乙醇（WashSolution），10000rpm离心0.5分钟。7）再10000rpm离心2分钟彻底甩