实验室文章li3ppqq博士

1、复旦大学临床医学博士研究生毕业论文吡咯喹啉醌三锂干预阿尔茨海默病的实验研究Beneficial effectsof trilithiumpyrroloquinoline quinoneinon behaviorsand pathologyina mouse model ofAlzheimerS disease系(部)医院：博士生姓名： 学科专业：中山医院赵蕾神经病学导师：钟春玖教授徐天乐研究员导师组成员：万方数据|JIII I I I II III Il UlII II JIfY2701 787目录本文缩略一一一一一一一一一一一1 中文摘要一一一一一一一一一3 英文摘要一一一一一一一一6 弓l

2、言一一一一一9第一部分：吡咯喹啉醌三锂的合成、急性毒性研究及血液、生化指标检测嘀刖百吾言一一一一一一一一一一 3第一章吡咯喹啉醌三锂急性毒性研究一一一16 材料和方法一一一一16结果一一一一一一一一一一一1 8、坌占一一一一一一22第二章慢性口服Li3PQQ后APPPSl转基因小鼠的血液及生化指标检钡4一一一一一22 材料和方法- 一一22 结果一J、结一一讨t仑一一一一一一一一一一一27第二部分：吡咯喹啉醌三锂的药效及改善认知功能研究刚吾材料矛口方法一一一一一一一3 1 坌占果一一一一39 t寸t台一-一一-一一一一一48第三部分：吡咯喹啉醌三锂减轻APPPSl小鼠病理损害的实验研究日1一j

3、LU舌一一5l材料和方法一一一5 1 结果一一一一62 讨古台一一一一67第四部分：吡咯喹啉醌三锂防治阿尔茨海默病的作用机制研究月U菁一一一68 材料和方法一一一一一一68 结果一一一一-一一一一一一72 讨古台一一一一一一76 j三文J、坌吉一一801LL万方数据参考文献一综述-89综述参考文献一一一一一一101发表文章目录-_-一一一致谢-i08万方数据复旦大学博士学燮一-_-_-_一本文缩略词p淀粉样多肽A1313-amyloid peptideAp结合乙醇脱氢酶A13-binding alcohol dehydrogenaseABAD亲和素生物素过氧化avidin biotin per

4、oxidase complexABC物酶复合物人工脑脊液artificial cerebrospinalfluidACSF阿尔茨海默病ADAlzheimerS diseases(丝氨酸苏氨酸)蛋白kinase BAKTPKBprotein激酶B13淀粉样蛋白前体蛋白APPamyloid 13-proteinprecursor3，3二氨基联苯胺四DAB3,3一diaminobenzidinetetrahydrochloride盐酸盐多奈哌齐糖原合成酶激酶3DNPdonepezilGSK3glycogen synthase kinase-3enzyme-linked immunosorbent a

5、ssay酶联免疫吸附实验兴奋性突触后电位ELISAfEPSPsfield excitatory postsynaptic potentials谷氨酸Gluglutamate免疫组织化学染色高效液相色谱法IHCimmunohistochemicalstainingHPLChigh Performance LiquidChromato-graphyLCMS液相色谱质谱法liquid Chromatography-Mass Spectrometrytri-lithium pyrroloquinoline吡咯喹啉醌三锂Li3PQQquinonein氯化锂LiCl1ithium chloridemedi

6、an lethal doseLD50半数致死量长时程增强LTPlong-term potentiationMMTmemantine美金刚N甲基一D天冬氨酸NMDAN··methyl·-D-aspartatePBSphosphate-buffered saline磷酸盐缓冲液聚合酶链反应PCRpolymerase chain reaction1万方数据复旦大学博士学位论文多聚甲醛早老素1PFAparaformaldehydePSlpresenilin-1早老素2PS2presenilin一2磷酸化tau蛋白phosphorylated tauPtau十二烷基磺酸钠一

7、聚丙烯酰胺凝胶电泳0节律刺激蛋白印迹sodium dodeeyl sulfateSDSPAGEpolyacrylamide gel electrophoresisthem-burst stimulateTBSWBwestem blot2万方数据复旦大学博士学位论文吡咯喹啉醌三锂干预阿尔茨海默病的实验研究中文摘要阿尔茨海默病(AlzheimerS disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病， 临床上以进行性的认知功能损害和特征性的病理学改变为主要特征。迄今为止， 仍然缺乏有效的防治阿尔茨海默病的药物和治疗手段，目前临床使用的脑内胆碱酯酶抑制剂(如石杉碱甲和多奈哌齐等)和非竞争性NMDA受

8、体拮抗剂(美金 刚)并不能阻止AD病情的进展；被认为最有前景的p淀粉样蛋白(13-amyloid， AD)疫苗治疗也被证明不能抑制痴呆症状和病情的进展，尽管它确实有清除脑内AB沉积和老年斑的作用，近年来，基于Ap假说研究的诸多新药临床试验相继失败促使我们反思目前的AD治疗研究策略，寻找低毒、多作用靶点的新药或“鸡尾酒疗法"成为AD防治研究中的热点。糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase一3，GSK-3)是一种多功能的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，是参与糖代谢的主要限速酶之一。GSK3在脑中高表达， 除了参与糖代谢外，还与很多生理病理学过程相关。近年来的研究发现，G

9、SK一3也是参与AD发病过程的重要因素，AD患者脑内GSK3活性显著增高，GSK-3 信号通路能通过双通道作用机制同时调控AD产生和Tau蛋白磷酸化而受到AD 研究学者的广泛重视。因此，通过调制GSK3信号通路功能防治AD被赋予极高的期望。然而，包括氯化锂等在内的、目前已知的GSK3抑制剂由于毒性过 大而限制了其临床应用。锂盐作为第一个被证明的GSK3抑制剂虽然用于临床 治疗双相精神障碍已经超过50年，但由于极窄的治疗窗和对老年人群过大的副 作用而难以用于AD的临床治疗。因而，寻找低毒性的GSK一3抑制剂也成为AD 研究热点之一。吡咯喹啉醌三锂(trilithium pyrroloquinol

10、ine quinonein，Li3PQQ，分子式： C14H3N208Li，分子量：348)是我们自己合成的、具有自主知识产权的小分子 有机锂盐。锂盐作为GSK3抑制剂已经证明显著抑制AB沉积和Tau蛋白磷酸化、减少它们在神经细胞内外的沉积和改善胰岛素抵抗与糖代谢紊乱的作用。吡咯喹啉醌作为新近发现的B族维生素，被证明具有显著促进细胞线粒体增生和功能、拮抗氧化损伤、减少A13集聚和毒性等多种作用。因而，Li3PQQ兼具改善线粒体功能、抗氧化损伤和抑制GSK3介导的tau蛋白磷酸化与AB形成、抑制神经变性性病理损害发生等作用，是有效的多靶点防治AD候选药物之一。这里，我 们采用昆明鼠进行急性毒性试

11、验，研究Li3PQQ的毒性作用；利用APPPSl双转基因小鼠模型研究Li3PQQ的药理药效以及作用机制。万方数据复旦大学博士学位论文论文的第一部分研究Li3PQQ急性毒性试验及对血液学相关指标的影响： 通过观察昆明鼠口服受试物Li3PQQ后的中毒反应及死亡情况，用于初步评价受 试物安全性，并为后续试验的剂量设计提供参考依据。挑选健康昆明小鼠，采用上下法，根据在AOT425StatPgm 10中设定的给药剂量给药，同时设阳性对照氯化锂(1ithiumchloride，LiCl)组。Li3PQQ按790mgkg、2500mgkg给药后1 015min观察到部分小鼠活动减少，约20min-lh后恢复

12、；5000mgkg给药后1 0min左右观察到活动减少和闭眼，部分动物约2小时后恢复，部分动物在给药后死亡，死亡发生在48小时以内。LiCl370mgkg，1160mgkg给药后无明显异常，5000mgkg组全部死亡，死亡发生在给药后2-20小时内，Li3PQQ组雄性(->2500rngkg)及雌性(5000mgkg)与较低剂量组(790mgkg)相比体重增长缓慢。本次试验测得Li3PQQ的半数致死量(Mediandose，LD50)为雄lethal性>5000mgkg，雌性5000mgkg(95可信区间为3308 mgkg-5400 mgkg)。阳性对照品LiCI的LD50为25

13、12mgkg(95可信区间为1160 mgkg-5000 mgkg)。8周的APPPSl双转基因小鼠的血常通过检测给予Li3PQQ 15、3、6mgkg规及生化指标，来评价Li3PQQ的毒性作用。20周龄的APPPSl双转基因及同 窝野生型对照小鼠分别给予Li3PQQ 15、3、6mgkg，安理申(donepezil，DNP) 15mgkg，美金刚(memantine，MMT)3mgkg，野生型溶剂(WT，vehicle)组， 转基因溶剂(TG，vehicle)组。给药8周后取血检测血常规，肝肾功，血糖，血 甘油三酯，胆固醇等指标，发现Li3PQQ三个剂量组均不影响APPPSl双转基因 小鼠的

14、血常规及生化指标，为证实其毒性及副作用小又提供了一个有力的证据。论文的第二部分研究Li3PQQ的药效作用、改善认知功能研究及突触可塑性研究。以不同年龄(20周龄、40周龄)的APPPSl双转基因小鼠为研究对象， 采取灌胃的给药方式，分别给予Li3PQQ 15mgkg、3mgkg、6mgkg、12mgkg， 阳性对照药安理申(donepezil，DNP)15mgkg，锂盐对照药LiCl 5mgkg、l OOmgkg，吡咯喹啉醌对照组Na3PQQ 14mgkg，野生型溶剂(WT，vehicle)组，转基因溶剂(TG，vehicle)组。给药8周后，进行Morris水迷宫行为学试验，研究Li3PQQ

15、不同剂量组空间学习记忆功能的变化；同时研究APPPSl小鼠海马CAl区0节律刺激(Theta-burststimulate，TBS)诱导的长时程增强的变化，进行突触可塑性研究。研究证实：Li3PQQ 3mgkg，6mgkg口服给药8周均能改善El服20周龄APPPSl双转基因小鼠的空间学习记忆损害，同时Li3PQQ 12mgkg给药8周均能改善20周龄、40周龄APPPSl双转基因小鼠的空间学习记忆损害及海马CAl区的长时期增强，增强其突触可塑性。本论文的第三部分及第四部分研究Li3PQQ给药后APPPS 1小鼠的病理学表现及作用机制。采用免疫组织化学染色检测AD的两大病理指标：淀粉样斑块和4

16、万方数据复旦大学博士学位论文神经原纤维缠结，酶联免疫吸附实验检测皮层的ABl42含量，免疫蛋白印迹实验检测皮层的磷酸化tau蛋白含量；同时通过免疫蛋白印迹实验和酶活试剂盒检测GSK3，GSK3Q，GSK3p，13淀粉样结合乙醇脱氢酶(913bindingalcoholdehydrogenase，ABAD)的表达量及活性，探讨相关作用机制。研究发现Li3PQQ 3、6、12mgkg均能够减少APPPSl双转基因小鼠皮层淀粉样斑块的数目、面积及磷酸化tau蛋白的表达量，而这一作用是通过抑制GSK-3，GSK30r，GSK一3p 的活性及增强ABAD的活性来实现的。本文通过急性毒性试验及血液生化指标

17、检测证实Li3PQQ是低毒的有机小分 子锂盐，同时又利用不同年龄段的APPPSl双转基因小鼠模型研究其药理药效 和相关的作用机制，从而证实吡咯喹啉醌三锂是低毒、高效的多靶点治疗AD的候选分子，有可能给AD病程修饰治疗带来突破性影响，产生巨大的社会和经济效益。关键词：阿尔茨海默病；吡咯喹啉醌；锂盐；糖合酶激酶3；13淀粉样结合乙醇脱氢酶；中图分类号：R741万方数据effects of trMithium pyrroloquinolineBeneficialquinoneinonand pathology ina mouse model of Alzheimersbehaviorsdisease

18、Abstracta devastating disease characterizedAlzheimerSdisease(AD)isby pathologicalwell asinthe brain：amyloid plaques，neurofibrillarytangles，asalterationssynapse-and neuron10ssUnfortunately,efficient disease-modifying therapies are unavailablesupported by numerous experimentalandBecause the13-amyloid(

19、AS)hypothesisison the clearance ofclinical studies。current treatmentstrategies for AD have focusedall the clinical trialseliminating ADatplaquesHowever,almostamyloidtargetedfunctionThis frustrating situation hasdeposit havedone little toimprove cognitivepromoted US to reconsider therapeutic strategi

20、eslithiumthisa neworganicsalt，trilithiumInstudy,we synthesizedpyrroloquinoline quinonein(Li3PQQ)Lithiumis the first discovered and the mostthe inhibitor ofsynthase kinase-3(GSK-3)in multipleextensivelytestedglycogenanimal modelsGSK3 has beendemonstrated to be involved inAD pathogenesis bymodulating

21、tau phosphorylation and AS productionPyrroloquinolinequinone(PQQ)serves tois a newly identified redox-cofactor vitaminfor mammals，whichonlynotin the mitochondrialalsomediate redox reactionschain，butrespiratoryplaysaoxygen species and attenuatingpotential rolein scavenging reactiveoxidativestressin m

22、itochondriaAsa cofactor of Ap-binding alcohol dehydrogenase(ABAD)，PQQmitochondriafrom oxidativeinnoveldamageADTherefore，thismight protectchemicalincould exhibitbeneficial effectsADLi3PQQpowerfulhaltingmechanismsneurodegenerative progression by targeting multiple ADcausingmiceevaluation inIn the firs

23、tconductedKumingbyasafetypart，wemedian lethaltoxicity of Li3PQQThedoses(LD50)weretheacutedetermining509kg for males，which arefor femalesand overshown tobe509kg body weightsignificantly higher than those oflithium chloride(LiCl，259kg body weight)Li3PQQlearning andtested the effect of chronic treatmen

24、tofonSecondly,wememoryThe drug(15，3，6 and12mgkg body weight)was gastrically gavaged dailyweeks)，a mouse model of AD and 1 2mgkgfor 8 weeks to the APPPS 1mice(20286万方数据weeks to the APPPS 1mice(40-48for 8was gastrically gavaged dailybody weightweeks)for 5four trials perIn tlle Morris water maze test，m

25、icewere traineddaysdayand then tested on the sixth dayWe showed that mice administered withLi3PQQ(3，6thantransgenic(TG)andsignificantlybetter1 2mgkg body weight)performedin the Morris water maze learning and memory testvehicle controlsandsynaptic mechanisms underlying the enhancedlearningTo further

26、study thethe APPPS 1recorded fieldexcitatory postsynaptictransgenic mice，wememoryinslicesBoth LiCI(100mgkgarea of hippocampalpotentials(fEPSPs)from theCAlincreased theLi3PQQ(1 2mgkg bodyweight)significantlybodyweight)andmagnitude of TBSinduced LTP,indicating that both drugs facilitate the hippocampa

27、lsynaptic plasticity ofAPPPSl transgenic micethe numbers andimmunochemicalin corticalstainingslices，weanalyzedBytreatmentWemice after theareain APPPS 1transgenicof amyloid plaquesdrugfound that chronic treatmentboth the number ofof Li3PQQ significantlyreducedimmunosorbentand area ofenzyme-linkedamyl

28、oid plaquesByamyloid plaquesthe concentration of Ap l-42，which is known as theassay(ELSIA)in codex，we testedconcentration ofharmfulmostreduced theamyloid proteinLi3PQQsignificantlyreduced the number of theApl-42Furthermore，Li3PQQ(6，12 mgkg)significantlyimmunochemicalcells，as shown byin corticalphosp

29、horylated taupositivestainingslicesBy western blotting，we found that the phosphorylation oftau in serine 396 wasof LiCl andreducedin theLi3PQQbutnot intheofgroupsignificantlygroupdonepezilTo confirm thatat ABAD andtheindeedLi3PQQtestedGSK-3，wetargetsexpression and activities of these enzymes in the

30、codexof the APPPS 1 mice after thetreatmentWe showed thatwas effectivethechronicLi3PQQinmodulatingdrugand ABAD in vivoLi3PQQ at 6mgkg and 1 2mgkgdid not affectactivities of GSK·3theofitincreased theenzymatic activityoflevelABAD，butdose-dependentlydid nottheABADBy contrast，while Li3PQQchangeof G

31、SK-3 in theexpressioncodex of theAPPPS 1increased the ratio ofmice，itdose-dependentlyandphospho-GSK-3a(Ser2 1)GSK一3aphosphoGSK-3p(Ser9)GSK一3pIncreasedGSK一3 a(Ser2 1)and GSK-3 p(Ser9)indicatedecreasedlevels ofphosphorylationat 6 and 1 2activities for bothenzymesConsistently,Li3PQQmgkg significantlyde

32、creased the enzyme activity oftotal GSK3，as well as that ofGSK一3仅and GSK一36。7万方数据复旦大学博士学位论文Given that drugs against singletargets are insufficient to prevent AD progression，the development of new drugs against multiple targets involvedin AD pathogenesisorcocktailtherapies representattractivefor AD t

33、reatmentOuranapproachstudybeneficial effects on behaviors andshowed thatLi3PQQexhibitedsignificantlyinpathology through modulatingmodel ofAlzheimerS disease。a mousemultiple pathophysiological processesKeywords：AlzheimerSquinonein，lithium，glycogendisease，pyrroloquinolinesynthase kinase-3，Apbindingalc

34、ohol dehydrogenase8万方数据复旦大学博士学位论文正文部分引言随着人口老龄化进程加速，阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)以其高患病率、高经济负担越来越引起社会的普遍关注。AD是好发于老年人的常见的 进行性中枢神经系统退行性疾病，是痴呆最常见的类型，在65岁以上人群中约为5，85岁以上人群中超过20I¨。本病常散发，女性多于男性，女性患者的病程 常较男性患者长。其临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。随着人口的老龄化，AD的发病率逐 年上升，严重危害老年人的身心健康和生活质量，给病人造

35、成深重的痛苦，给家庭和社会带来沉重的负担，已成为严重的社会问题，引起各国政府和医学界的普遍关注【21。迄今为止，我们仍然缺乏有效阻止或延缓AD疾病进展的药物和治疗手段。 目前临床使用的脑内胆碱酯酶抑制剂(如石杉碱甲和多奈哌齐等)和非竞争性 NMDA受体拮抗剂(美金刚)并不能阻止AD病情的进展；被认为最有前景的D 淀粉样蛋白(13-amyloid，A13)疫苗治疗也被证明不能抑制痴呆症状和病情的进展， 尽管它确实有清除脑内A13沉积和老年斑的作用【3】，多项临床试验的失败促使我 们反思目前AD的研究策略。脑内老年斑形成和神经原纤维缠结是AD的两大特征性病理改变，AB和过 磷酸化tau蛋白是形成老

36、年斑和神经纤维缠结的基础和主要成分【4。5】。AB前体蛋 白(A13 precursor protein，APP)代谢异常导致AD产生过多和清除减少【68】、受累神经元内蛋白激酶和或蛋白磷酸酯酶磷酸化系统失衡导致tau蛋白异常磷酸化p。1 UJ被认为是导致AD两大特征性病理损害发生的主要机制，如B分泌酶(p-secretase，BACE)111-12】和丫分泌酶(y-secretase)13-141活性增高导致AB产生增 加、包括糖合酶激酶一3(glycogen synthase kinase3，GSK3)在内的某些蛋白激酶活性升高引发的tau蛋白相关位点磷酸化【1516】等。在针对这些可能病

37、理机制而设计的防治策略中，由于p分泌酶和1，分泌酶抑制剂仅能减少Ap产生、而不能阻止tau蛋白磷酸化等原因，临床试验效果令人失望【1718】。现实促使我们从更为广泛的视角重新思考AD的防治策略。虽然家族性AD和转基因动物模型研究显示早老素1(presenilin1，PSl)、早老素2(presenilin2， PS2)和APP等基因突变可以导致AD发病，但散发性AD的发病却难以用单基 因异常机制来解释。新近大量临床与基础研究表明，散发性AD不是单一病理损害机制导致的简单疾病，而是糖(脂)和能量代谢紊乱【19-21、线粒体功能异常和q万方数据复旦大学博士学位论文氧化应激【22q3等多种机制参与的

38、，以蛋白质(多肽)异常集聚和突触异常减少为 显著病理特征的复杂疾病。特别值得一提的是，神经元具有高度特化的亚细胞结 构，如突触和轴突、树突等，突触是介导神经细胞间信号传导的基本单位，神经 突触结构及功能的异常改变可引起神经系统信号网络功能异常并导致神经系统 疾病。线粒体功能障碍、氧化应激和蛋白质(多肽)异常聚集可导致突触功能与 结构损害。在AD发病早期，突触数量和突触蛋自己显著下降，脑组织活检发现 AD发病后24年，患者海马的突触数量减少已高达4455【24】。随着病程进展， 突触丢失不断增加，且与认知功能损害程度密切相关，AD也被认为是突触功能障碍(synaptic failure)性疾病【

39、25J。因而，解除和削弱突触损害的病因学因素或机制也是防治AD研究热点之一。现有的AD治疗药物或手段之所以不能达到满意的治疗效果，可能与它们不 能兼顾导致AD沉积、tau蛋白异常磷酸化和突触损害等多方面的病理损害机制 有关。因而，寻找低毒、多作用靶点的新药或“鸡尾酒疗法"成为AD防治研究中的热点。基础与临床研究发现，AD患者和动物模型脑细胞葡萄糖代谢障碍与能量代 谢显著降低、而且明显早于临床症候和特征性病理损害的形成【2睨71，糖代谢障碍已被认为是痴呆和AD的独立危险因素【2鼬91，部分学者甚至建议将AD归类为III 型糖尿病【301。因而，在糖代谢和稳态维持中具有重要和核心作用的线

40、粒体功能 和GSK3活性与AD发病的关系广受研究者关注。线粒体是调控细胞能量代谢、细胞凋亡以及活性氧(reactive oxygen species， ROS)和自由基产生的关键部位，与AD发生发展密不可分【31。321。临床和实验研 究业已证明，AD患者和模型动物脑细胞线粒体数目减少【33】、形态和功能异常34-35】、线粒体相关的酶活性(如细胞色素c氧化酶和Q酮戊二酸脱氢酶等)显著下降【3637】等。线粒体功能和氧化磷酸化过程等异常不仅减少细胞生理活动必需的ATP产生3s_391，而且导致钙稳态失衡40411、ROS和自由基产生增加【42431、细胞内蛋白质(多肽)异常磷酸化m45】和细胞

41、凋亡【46】等病理生理过程发生。尽管目前我们尚不能最终确定线粒体功能障碍究竟是AD发生的原因还是结果，但通过线 粒体功能保护来减少氧化损伤等病理生理过程发生已经是AD防治的重要靶标，专(，一【4748】 O此外，GSK3与细胞糖代谢稳态维持密切相关，其活性增高导致或加重“胰岛素抵抗，发生f49-矧，而研究也显示AD患者脑内GSK3活性显著增副”52】。GSK3信号通路能通过双通道作用机制同时调控Ap产生和tau蛋白磷酸化而受 到AD研究学者的广泛重视(图1)153。GSK3是一个与多方面生理机能和疾病发病机制关联的蛋白激酶，有两个同功异构体，分别是GSK一3a(51KD)和万方数据GSK3D(

42、47KD)，二者氨基酸序列有85的-致性、催化亚基更是有98的同源 性【541。研究证明，GSK3a通过特异性底物调控Y-分泌酶活性和APP加工的p 通路功能，GSK3 cc活性升高导致Ap产生增加，锂盐可以通过抑制GSK-3a活性显著减少AD产生【551。此外，由于tau蛋白在体内是GSK3的磷酸化底物之一， GSK3、特别是GSK3B介导的tau蛋白过磷酸化在AD发病机制中的作用也被广泛研列56。571。在体动物模型研究证明，GSK3B基因过表达导致的酶活性增高诱发脑内tau蛋白过度磷酸化和神经变性性病理损害发生158|，而抑制或下调GSK3D表达或活性可以减少Ap的产生和tau蛋白磷酸化

43、而发挥神经保护作用p， GSK3抑制剂也被证明具有显著的神经保护作用【6m61j。因而，通过调制GSK一3信号通路功能防治AD被赋予极高的期望。雕图1糖合酶激酶-3通过双通道作用增加AD产生和tau蛋白异常磷酸化示意图【531遗憾的是，包括氯化锂等在内的、目前已知的GSK3抑制剂由于毒性过大 而限制了其临床应用。锂盐作为第一个被证明的GSK3抑制剂虽然用于临床治 疗双相精神障碍(bipolar disorder)已经超过50年，但由于极窄的治疗窗和对老年人群过大的副作用而难以用于AD的临床治疗【55621。因而，寻找低毒性的GSK3抑制剂也成为AD研究热点之一。吡咯喹啉醌三锂(分子式：C14H

44、3N20SLi3；分子量：348；见图2)是我们 自己合成的、具有自主知识产权的小分子有机锂盐【63】。锂盐作为GSK3抑制剂已经证明显著抑制Ap沉积和tau蛋白磷酸化、减少它们在神经细胞内外的沉积55J和改善胰岛素抵抗与糖代谢紊乱的作用【471。吡咯喹啉醌作为新近发现的B族维生素，被证明具有显著促进细胞线粒体增生和功能、拮抗氧化损伤、减少AB 集聚和毒性等多种作用【64击7】。因而，吡咯喹啉醌三锂兼具改善线粒体功能、抗氧化损伤和抑制GSK-3介导的tau蛋白磷酸化与AD形成、抑制神经变性性病理损万方数据复旦大学博士学位论文害发生等作用，是有效的多靶点防治AD候选药物之一。因而，吡咯喹啉醌三锂

45、 是低毒、高效的多靶点防治AD候选分子，有可能给AD病程修饰治疗带来突破性影响，产生巨大的社会和经济效益。图2吡咯喹啉醌三锂分子结构万方数据复旦大学博士学位论文第一部分吡咯喹啉醌三锂的合成、急性毒性研究及血液、生化指标检测前言吡咯喹啉醌三锂(trilithiumpyrroloquinoline quinonein，Li3PQQ)是一个结构相对简单的有机小分子锂盐(Li3PQQ，分子量：348；分子式：C14H3N208Li3)，其分子结构(见图2)保证了吡咯喹啉醌三锂具有较为稳定的理化性质。我们前期研究中业已研究成功成熟的Li3PQQ合成工艺(已经申报国家发明专利和国际发明专利，生产工艺流程见

46、图11)，高效液相色谱法(Hi曲Liquid Chromatography,HPLC)及液相色谱质谱分析(LiquidPerformanceMassSpectrometry,LC-MSl均证实原料药纯度能保证在990Chromatography以上(图12，上海日馨生物科技有限公司提供)。目前，上海日馨生物科技有限公司已经将上述合成工艺顺利放大为千克级合成工艺路线，完全能够保证Li3PQQ临床前研究的原料药供应，为本课题的完成 奠定了坚实的基础。为了初步验证Li3PQQ的安全性，我们进行了Li3PQQ口服给药的小鼠急性毒性试验及慢性口服Li3PQQ后小鼠血液学指标检测和血生化指标检测，来探讨其

47、是否低毒及有成药的可能。万方数据复旦大学博士NHCHO五面湎丽面丽1EtOH，HCI。NaN02Ac20-_L-2HBF4，EtOHHCOOHNHCHODMFNH2OCH3PQl02PQl03PQl01彳H3冒&HN-N-B-呲'C-HC-。OCH3EEOEtHCI，acetoRe幽些基NHCHONH2PQl05PQl06PQl08OMePQl09EH1LOHTHF·-2H2S04OCH3PQlllPQll2图11吡咯喹啉醌三锂生产工艺流程14复旦大学博士学位论文一4O昔。|I眦坤wI柏·舢g·'O。15：13：2tO鼬bO10k端ES，+

48、?sIC'H”I烈靖U扣，00，Sk潞：0，S1tSG：砖。l C零3j孙7游?m锚瑚砖i |! i鬈错li摹q霸琳l搿抽睁j三蔓。羔。6 x鲨|-。5工董j；：k。薹!芰k。一础l、，f舢湖湖糯撇渤糯弱o020103040min图1-2吡咯喹啉醌三锂的结构及HPLC(A)、LCMS(B)图。A图示原料药峰值在分子量34706处，基本符合Li3PQQ的分子量大小；B图示14403分钟时出现出峰峰值，峰值的分子量为350左右，也符合Li3PQQ的分子量，提示峰值位置为Li3PQQ。15万方数据复旦大学博士学位论文第一章Li3PQQ的急性毒性研究材料和方法1实验材料11实验动物：昆明种叫)

49、小鼠，SPF级，68周龄。提供单位：上海斯莱克实验动物有限责任公司。所有涉及到动物的实验均按照复旦大学附属中山医院相关指导规定进行，符合动物伦理委员会要求。共分四批：第l批34只，雌雄各 半，体重130"1819；第2批24只，雌雄各半，体重121"-1819；第3批12 只，雌雄各半，体重134-一1779；第4批：10只，雌雄各半，体重123"-2059。给药开始时体重：雄性190"2299，雌性1 83'2219。饲养条件及环境：SPF级实验室饲养，温度2025，湿度4070， 噪声60分贝，换气次数10"-'20次纠、时

50、，明暗交替时间：12h明12h暗。小鼠 自由饮食、饮水，1"-'2天换水1次，1周换12次垫料。留验观察时间：动物入室后适应性饲养13天。12实验药物121药物名称吡咯喹啉醌三锂(Li3PQQ)：起始剂量为790mgkg；配制方法：称取LiaPQQ， 加纯水分别配制成所需浓度79mgmL，250mgmL和500medrnL，充分混匀。给 药当天配制。对照品氯化锂(LiCl)：起始剂量为370mgkg；配制方法：称取LiCl，加纯水分别配制成所需浓度37mgmL，116mgmL和500mgmL，充分混匀。给药当天配制。122剂量设置及依据根据上下法(Up and down me

51、thod)，按预实验结果及文献资料，进行主试验， 在AOT425StatPgm 10中设定给药剂量，并根据动物存活情况向上或向下调整剂量。123给药途径及选择理由：灌胃给药，与受试物的临床给药途径一致。给药容量：10mLkg。给药次数：单次给药。2实验方法万方数据复旦大学博士学位论文21动物分组：分为给药组和阳性对照组。挑选健康小鼠，按上下法进行主试验设定如下给药程序：表11Li3PQQ与LiCI的给药程序(动物编号、性别和剂量)22动物标识：给药组及对照组雌雄分笼饲养，根据需要用苦味酸按头、背、尾、条、白等标记。23给药方法：给药前禁食不禁水3h。根据在AOT425StatPgml0中设定的

52、给药剂量给药。在此给药程序中，每次给药1只动物，间隔48 h，观察动物死亡或存活情况(X死亡，O存活)，并向上或向下调整剂量，直到满足试验停止标准之一时，即停止试验。停止试验标准如下：(1)连续3只动物存活；(2)任意连续6 只试验动物中有5只连续发生存活死亡转化；(3)第一只动物发生转换之后至少有4只动物进入试验，并且LD50估算值的范围超过临界值(25倍)。24检测指标241一般症状观察：小鼠给药当天严密观察，尤其是给药后4h内。然后对存活 动物每天观察1次，连续14天，包括动物体重变化、饮食、外观、行为、分泌 物、排泄物、动物异常反应的症状、起始时间、严重程度、持续时间、是否可逆17万方数据复旦大学博士学位论文以及动物死亡情况。242小鼠体重：在给药当天(给药前)测定，其后每周1次。243病理检查：动物死亡及时解剖检查，其他动物在观察期结束后进行大体解 剖，记录病变情况，主要观察心脏、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、胃肠道等内脏， 观察是否有出血点、水肿等异常情况，并作记录。当发现器官出现体积、颜色、