核酸的物理化学性质

1、会计学1核酸的物理化学性质核酸的物理化学性质第1页/共48页 核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。，其中糖苷键更易被水解。 第2页/共48页55端端3端端CGA第3页/共48页 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。键。DNA在在pH1.6于于37对水透析可完全除去嘌呤对水透析可完全除去嘌呤碱；在碱；在pH2.8于于100加热加热1h，也可完全除去嘌呤碱，也可完全除去嘌呤碱。 第4页/共48页 RNA的

2、磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有的核糖上有2OH，在碱作用下形成磷酸三酯。，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2，3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2核苷核苷酸和酸和3核苷酸。核苷酸。 DNA一般对碱稳定，若在一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加中加热至热至100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。酸。第5页/共48页 水解核酸的酶种类

3、很多。非特异性水水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。非特异水解糖苷键的糖苷酶。 第6页/共48页按底物专一性分类：作用于按底物专一性分类：作用于RNA的称为的称为RNA酶酶（ribonuclease，RNase）；作用于）；作用于DNA的称为的称为DNA酶（酶（deoxyribonuclease，DNase）。）。按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（按对底物作

4、用的方式可分为核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（）和核酸外切酶（exonuclease）。）。少数核酸酶既可内切又可外切。少数核酸酶既可内切又可外切。第7页/共48页核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割的，也有方向切割的，也有35方向方向切割的，分别称为切割的，分别称为53外切酶和外切酶和35外切酶。外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制限制性核酸内切酶性核酸内切酶 第8页/共48页1 1、碱基的解离、碱基的解离第9页/共48页ONHNHOON-NHOCH3ONHNHOCH3ON-NHO19.5pK 19.9pK HHONH

5、2NH+NHONH2NNHO-NH2NNH212.5pK 14.6pK HH 胞嘧啶中胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中尿嘧啶及胸腺嘧啶中第10页/共48页NNH+NHNNH2NNNHNNH2NNN-NNH214.15pK HH29.8pK NNHNHNH+NH2ONNHNHNNH2ONN-NHNH+NH2ONN-N-NNH2OHHH13.2pK 29.6pK 312.4pK 鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到则结合到N7上上第11页/共48页2、核苷的解离、核苷的解离戊糖可增强碱基的酸性解离戊糖可增强碱基的酸性解离核糖中的羟基也可发生解离核糖中的羟基也可发生解离3.3.核苷酸的解

6、离核苷酸的解离磷酸基使核苷酸具有很强的酸性磷酸基使核苷酸具有很强的酸性第12页/共48页ROHOHOOPRO-OHOOPRO-O-OOP10.7 1.6pK HH25.96.5pK OHN-CH2OOOHOOPOHNCH2OOHN-CH2OOO-OOPOHNCH2OH11.5pK 第13页/共48页第14页/共48页第15页/共48页核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。磷即相当于摩尔核苷酸。30.98APWL（ ） ：摩尔吸光系数：摩尔吸光系数 A：吸收值：吸收值 W：每升溶液磷重量：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径：比色杯

7、内径第16页/共48页 OD260的应用：的应用：1. DNA或或RNA的定量的定量 OD260=1.0相当于相当于 50g/ml双链双链DNA 40g/ml单链单链DNA（或（或RNA） 20g/ml寡核苷酸寡核苷酸2.判断核酸样品的纯度判断核酸样品的纯度 DNA纯品纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低含杂蛋白及苯酚，降低3.判断判断DNA是否变性是否变性第17页/共48页第18页/共48页 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及使核酸分子高

8、级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2 2、变性的实质、变性的实质第19页/共48页降解：核苷酸骨架上降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂磷酸二酯键的断裂DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂第20页/共48页 高温（一般高温（一般7575） 热变性热变性 强酸、碱强酸、碱 酸碱变性酸碱变性 甲醛甲醛（Agarose中中RNA ） 尿素尿素（PAGE中中DNA ）3 3、变性因素、变性因素第21页/共48页 ODOD260260增高增高 粘度下降粘度下降 比旋度下

9、降比旋度下降 浮力密度升高浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变酸碱滴定曲线改变生物活性丧失生物活性丧失4、变性后理化性质变化、变性后理化性质变化RNA变性：从螺旋到线团之间的转变变性：从螺旋到线团之间的转变RNA的变性引起的性质变化没有的变性引起的性质变化没有DNA明显明显第22页/共48页第23页/共48页由于变性或降解引起紫外吸收增加的现由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称象称增色效应增色效应第24页/共48页第25页/共48页解链曲线：解链曲线：连续加热连续加热DNADNA，以温度对，以温度对A A260260作图，所得的曲线称为解链曲线作图，所得的曲线称为解链曲线。第26页/共48页 指增

10、色效应达指增色效应达50%时的温度时的温度 一般一般DNA Tm 值在值在85 - 90 C之间之间 Tm：DNA变性时，变性时，OD260达达到最大值的到最大值的50%时的温度称时的温度称为为DNA的的解链温度解链温度或或融解温融解温度度(Tm)。大小与大小与G+C含量成正比。含量成正比。第27页/共48页第28页/共48页（1 1）DNA的均一性：的均一性：（2）GC含量：含量： 经验公式：经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44（3）介质中的离子强度：）介质中的离子强度： Tm值大小与下列因素有关：值大小与下列因素有关：第29页/共48页热变性的热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，经

11、缓慢冷却后即可复性，这一过程称为这一过程称为退火退火(annealing) 。第30页/共48页第31页/共48页第32页/共48页复性时紫外吸收减少的现象复性时紫外吸收减少的现象第33页/共48页( (三三) ) 核酸的杂交核酸的杂交第34页/共48页第35页/共48页DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子第36页/共48页第37页/共48页 SouthernSouthern杂交杂交 NorthernNorthern杂交杂交 WesternWestern杂交杂交第38页/共48页第39页/共48页第40页/共48页第41页/共48页 RN

12、A的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有的核糖上有2OH，在碱作用下形成磷酸三酯。，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2，3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2核苷核苷酸和酸和3核苷酸。核苷酸。 DNA一般对碱稳定，若在一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加中加热至热至100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。酸。第42页/共48页 水解核酸的

13、酶种类很多。非特异性水水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。非特异水解糖苷键的糖苷酶。 第43页/共48页核酸外切酶有核酸外切酶有53方向切割的，也有方向切割的，也有35方向方向切割的，分别称为切割的，分别称为53外切酶和外切酶和35外切酶。外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制限制性核酸内切酶性核酸内切酶 第44页/共48页 某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力，某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变2 2、变性的实质、变性的实质第45页/共48页由于变性或降解引起紫外吸收增加的现由于变性或降解引起紫外吸收增加的现