水稻转基因实验操作手册整理

1、水稻转基因实验操作一、 水稻愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1 消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1） 将种子放入100ml无菌三角瓶中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 3 %次氯酸钠（NaClO）溶液（次氯酸钠：水（V/V）=9:21），放入摇床振荡60分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。 2诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿10颗；2） 操作完毕用封口膜封好培养皿，在26培养箱，（光）暗培养10-1

2、5天；3） 在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在26 光（暗）培养箱，继代培养2周（继代两次）。(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、预培养 将继代两次的状态较好的愈伤颗粒，接种到预培养基26 暗培养4天。预培养基碳源为20克蔗糖+20ml 50% 葡萄糖（115度灭菌30min）。乙酰丁香酮（AS）浓度为100 M (每毫升培养液中加入100 mM的AS 1微升)三、 农杆菌（工程菌）培养把-70保存的菌种首先用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB液体培养基，在26-28，150 r/min振荡培养

3、16-18 h，活化转入打靶载体的农杆菌。在预培养的第2天，用含125 mg/L壮观霉素、50 mg/L利福平的YEB固体培养基划线接种农杆菌菌株，28 静止培养2-3 d。3 d后将单菌落农杆菌刮入农杆菌悬浮液体培养基或者AAM培养基，28 振荡培养34 h。分光光度计测定菌液浓度，并将其浓度调至0.5-1.0 OD600四、 感菌与共培养1）将预培养后的愈伤组织接入100 mL三角瓶,中，加入调制好的农杆菌悬浮液侵染30分钟，期间摇动数次；2）倒去菌液，将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上吸干表面菌液（30-40分钟）；3）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。19-

4、20（组培室）暗培养3天。五、愈伤组织的抗生素筛选将共培养后的愈伤组织取出，用无菌水快速摇动清洗4次，然后加入无菌水浸泡10min,使愈伤内部的菌体游离出来；倒去洗液，再用含400mg/L头孢的无菌水浸泡20min。再用含400mg/L头孢的无菌水冲洗一次，最后置于无菌滤纸上沥干3h。第一轮筛选：将沥干的愈伤转入含400 mg/L羧苄青霉素（Car）和400 mg/L头孢霉素的选择培养基（没有选择压力）上，26暗培养5-7天； 然后将愈伤转到含400mg/L羧苄青霉素（Car）、400 mg/L头孢霉素和50mg/L潮霉素的培养基上进行选择，26，暗培养，两周一次，培养两次。六、抗性愈伤组织的

5、诱导分化和生根1）将筛选获得的抗性愈伤组织接入预分化培养基中，26，暗培养5-7天。2）预分化培养的抗性愈伤转入分化培养基（改用三角瓶或者平底试管）26，2000Lx光照培养，再生转基因植株。3）待小苗长到3-5cm;转入生根培养基上发根。4）将根系健壮的植株移入盆砵，凉棚过渡3-5天；然后移到自然条件下生长，直至成熟。注：分化过程中不可将愈伤继代培养，转基因苗从分化到移栽时间大约为三个月左右。将根部和茎叶分化得较完好的苗从试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。以上操作步骤皆在无菌

6、条件下进行。七、转化苗的检测验证1）GUS检测：将准备好的材料浸泡在染液里，37保温过夜。GUS染液成分见附录。2）GFP检测：将材料放在共聚焦显微镜下观察成像。3）PCR检测：设计潮霉素抗性基因引物HYG-F 5 CTTCTGCGGGCGATTTGT 3 HYG-R 5 CAGCGTCTCCGACCTGAT 3 PCR 反应条件为：95变性5min，55退火2min，72延伸2min， 72保温10min。反应结束后，PCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。4）潮霉素快速检测转基因幼苗的方法（具体见附录）。附录：各种母液及培养基的配制方法一、激素的配制激素溶解方法母液浓度6-BA; KT10

7、0mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再用蒸馏水定容100mL；4保存1 mg/mlNAA; IAA100mg样品加稀碱1ml振荡溶解（1M KOH），再用蒸馏水定容100mL；4保存1 mg/ml2，4-D2,4-D 100 mg加少量酒精溶解，再用蒸馏水定容100mL; 4保存1mg/mlAS0.196g AS加10mL二甲基亚砜（DMSO）溶解，用1.5mleppendorf管分装成小份-20贮存。配制时注意带乳胶手套操作。 100mM1） 抗生素链霉素（Str）50mg/ml：溶解0.5g链霉素硫酸盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20贮存。利福平

8、50mg/ml：溶解0.5g利福平于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20贮存壮观霉素（Spec）125mg/ml：溶解1.25g壮观霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20贮存。羧苄青霉素（Car）400mg/ml：溶解4g羧苄青霉素二钠盐于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20贮存。头孢霉素400mg/ml：溶解4g头孢霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20贮存卡那霉素（Kan）50mg/ml：溶解0.5g卡那霉素于灭菌去离子水中，最后定容至10ml, 过滤灭菌分装成小份-20贮存。二

9、、各类基本培养基成分表：各类基本培养基MSN6CCB5大量元素(g/L)(g/L)(g/L)(g/L)NH4NO31.65/0.64/KNO31.92.831.2122.5KH2PO40.170.40.1360.15MgSO47H2O0.370.1850.2470.25CaCl22H2O/CaCl20.44/0.3320.166/0.1250.588/0.440.15(NH4)2SO4/0.463/0.134微量元素(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)KI0.0830.080.0090.075H3BO30.620.160.310.3MnSO44H2O2.23

10、0.441.1651ZnSO47H2O0.860.150.5750.2Na2MoO42H2O0.0250.240.025CuSO45H2O0.00250.0250.0025CoCl26H2O0.00250.0280.0025Fe2+-EDTA(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)FeSO47H2O2.782.782.782.78Na2-EDTA2H2O3.733.733.733.73有机成分(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)(g/L 100)Nicotinic acid0.050.051.20.1Pyridoxine-HCl(VB6)0.0

11、50.050.20.1Thiamine-HCl(VB1)0.040.11.71Glycine0.20.20.4/Inositol10101810麦芽糖20g甘露醇25gagar 8gvc60mg1）有机母液储存液（4度保存）：1烟酸（Nicotinic acid）1mg/ml2盐酸吡哆醇(VB6)1mg/ml3盐酸硫胺素(VB1)10 mg/ml4肌醇(myo-Inositol)10 mg/ml5Glycine2 mg/ml B5 有机工作液为从序号为1、2、3 各取1mL； 序号4取10 mL Ms 有机工作液从序号为1、2各取0.5mL, 3取40l；4取10ml;5取1ml N6 有机工

12、作液从序号为1、2各取0.5 ml ,3取100l；4取10ml;5取1ml2）铁盐配制（4度保存）：注：配制顺序如下1. 称取2.78g FeSO47H2O溶解于200ml去离子水中（A）。2. 称取3.73g Na2-EDTA2H2O溶解于200 ml去离子水中（B）。3. 将B置于70水浴锅中直至溶质完全溶解（C）。4. 将A倒入C中混合，置于70水浴锅中保温2h。5. 定容至1L。三、农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：酵母提取物1g蛋白胨10g蔗糖5gMgSO47H2O1.027pH灭菌结束后加抗生素至终浓度为： 利福平 50mg/L 壮观霉素（Spec）125mg/L四

13、AA培养基储存液 (室温储存)大量元素g/L（10倍）KCl29.5NaH2PO41.5MgSO47H2O2.5CaCl22H2O1.5微量元素g/L（100倍）MnSO44H2O1.0ZnSO47H2O0.2H3BO30.3KI0.075CuSO45H2O0.0025Na2MoO42H2O0.025CoCl26H2O0.0025微量元素配制中Na2MoO42H2O 单独溶解后与其他物质混合后定容到1L,室温保存。3）水稻苗期水培营养液配方：Macro-nutrient solution (mM)元素终浓度使用盐类分子量(g/mol)母液(103)用量(g/L)N2.5(1.25 mM)NH4

14、NO380.04100P0.3KH2PO4136.0940.83K1(0.35mM)K2SO417460.9Ca1CaCl22H2O147147Mg1MgSO47H2O246.5246.5SiO20.5Na2SiO39H2O284.2142.1Micro-nutrient solution (M) Mn9MnCl24H2O197.921.781Mo0.39Na2MoO42H2O241.950.0944B20H3BO361.831.2366Zn0.77ZnSO47H2O287.560.2214Cu0.32CuSO45H2O249.680.0799Fe20FeSO47H2O+Na2_EDTA278

15、.025.57注: 1 制备大量元素营养液母液时，各种盐类分别溶解，分别储存，使用时每升营养液加1mL母液。2 制备微量元素营养液（除Fe外）时，先放500mL去离子水，称取各种盐类逐一溶解后，入容量瓶加蒸馏水稀释至1L，制成母液，使用时每升营养液加1mL母液。3 Fe的制备：溶解5.57g FeSO47H2O于200 mL蒸馏水，再另溶解7.45g Na2-EDTA 200mL蒸馏水中，加热Na2-EDTA（大约70度），加入FeSO47H2O，不断搅拌，然后于70度恒温箱中螯合2h，冷却定容至1L，储于棕色瓶中，使用时每升营养液加1mL母液。4 调节pH为5.5。5 铵营养时，加入硝化抑制

16、剂（双氰胺），每升营养液加2mg双氰胺（终浓度）。各人配制时，应注意所用的盐类和分子量，检查盐用量准确无误。五、GUS染色液配方(1) 制备方法：A液：称取NaH2PO42H2O3.12g溶于蒸馏水，定容至100ml。B液：称取Na2HPO412H2O7.17g溶于蒸馏水，定容至100ml。(2) 取100ml B液与40ml A液混合（混合后pH值约7.03），用NaH2PO42H2O调至pH7.0。(3) 染色液：试剂终浓度母液浓度配20ml所需母液量（ml）磷酸钠缓冲液（pH7.0）100mmol/L200mmol/L10Na2EDTA10mmol/L50mmol/L4K3Fe(CN)6

17、1mmol/L40mmol/L0.5 K4Fe(CN)61mmol/L40mmol/L0.5TritonX-1000.5%(v/v)0.1甲醇20%(v/v)4ddH2O5.9（补水至20ml）X-Gluc0.5mg/ml10mg说明：1.除了TritonX-100, 甲醇, X-Gluc不用灭菌外其他的母液都要灭菌.其中K3Fe(CN)6和K4Fe(CN)6要用过滤灭菌的方法2.GUS活性的精确定位需要有亚铁离子。GUS酶水解其底物X-Gluc产生可溶性无色的吲哚基衍生物，它可扩散到其他部位，必须经氧化缩合成二聚体，才能形成不溶性的蓝色沉淀，二聚体化由氧化催化剂(如亚铁氰化钾、过氧化物酶或过氧化氢酶等)催化，若不加Fe2-，则仅形成可溶性中间产物而扩散，加亚铁氰化钾后因吲哚基二聚体化而不扩散，不溶性蓝色沉淀形成越快，GUS酶的定位越精确。材料准备：(1) 瞬时表达检测取浸染后的愈伤，稳定表达取分化前的愈伤。(2) 叶片、幼根等制成徒手切片（或剪成小