第二章 光度分析法 §21 动力学分析法

1、 第一节 高灵敏光度分析法高灵敏光度分析法 第一部分：第一部分： 动力学分光光度法动力学分光光度法 第二部分：第二部分： 酶催化法酶催化法 三基本原理和一些基本概念1反应速度反应速度反应速率：表示单位时间、单位体积内反应物或生成物浓度的摩尔数变化，反应速率：表示单位时间、单位体积内反应物或生成物浓度的摩尔数变化，化学反应转化速率的表示方法：化学反应转化速率的表示方法： aA+bBdD+gG1/a(-dcA/dt)=1/b(-dcB/dt)=1/d(dcD/dt)=1/g(dcG/dt)2反应级数反应级数 零级反应零级反应 凡转化速率与反应物浓度的零次方成正比的反应称为零级反应。凡转化速率与反应

2、物浓度的零次方成正比的反应称为零级反应。 速率方程为速率方程为-dcA/dt=K0 积分后积分后 c0-ct=c= K0t 当当ct= c0/2 时时 反应时间为半衰期反应时间为半衰期 t1/2= c0/2K0 零级反应的特征：零级反应的特征：反应物的消耗浓度或产物的生成量与反应物的消耗浓度或产物的生成量与反应时间反应时间t成线性关系，直线的斜率为成线性关系，直线的斜率为K0；K0的单位为的单位为mol/L；半衰期与反应物的初始浓度半衰期与反应物的初始浓度c0成正比，与成正比，与K0成反比。成反比。 一级反应一级反应凡转化速率与反应物浓度的一次方成正比的反应，称为一级反凡转化速率与反应物浓度的

3、一次方成正比的反应，称为一级反应。应。 速率方程为速率方程为-dcA/dt=K1CA 积分后，当反应物积分后，当反应物A的浓度降低一半时，的浓度降低一半时， t1/2=0.693/K1 由上式可见，在温度一定时，一级反应的半衰期与反应物的由上式可见，在温度一定时，一级反应的半衰期与反应物的起始浓度无关，与转化速率常数起始浓度无关，与转化速率常数K1成反比，且等于成反比，且等于0.693/K1，这是一级反应的特点。这是一级反应的特点。 二级反应二级反应凡转化速率与两种反应物浓度的乘积成正比，或与一种反应物浓度的二次方凡转化速率与两种反应物浓度的乘积成正比，或与一种反应物浓度的二次方成正比的反应称

4、为二级反应。成正比的反应称为二级反应。 通式通式: A +BF+G 动力学方程式为：动力学方程式为：-(dcA/dt)=K2cAcB设设cA=cB=c，则，则 -(dcA/dt)=K2c2 半衰期为半衰期为 t1/2=1/K2c0 假一级反应假一级反应 对于二级反应：对于二级反应：-(dcA/dt)=K2cAcB，如果在操作上大大提高反应物之一，如果在操作上大大提高反应物之一B的浓度，使的浓度，使A与与B完全作用后，完全作用后，B的浓度基本上维持不变，因而可以看成是的浓度基本上维持不变，因而可以看成是个恒定值而并入个恒定值而并入K2项中，这样二级反应即变成了假一级反应，则项中，这样二级反应即变

5、成了假一级反应，则-(dcA/dt)=K1cA式中式中 K1= K2 cB 在许多实际工作中，都是通过控制反应条件，使二级、三级反应转为假在许多实际工作中，都是通过控制反应条件，使二级、三级反应转为假一级反应，使转化速率仅与待测物的浓度成正比，以达到测定的目的。一级反应，使转化速率仅与待测物的浓度成正比，以达到测定的目的。 3 3影响反应速率的主要因素影响反应速率的主要因素 反应物浓度反应物浓度 除零级反应外，反应物的浓度都对反应速率有影响。除零级反应外，反应物的浓度都对反应速率有影响。 催化剂：催化剂： 温度：温度： 活化剂：活化剂： 抑制剂：抑制剂： (1) (2) 2) 转化速率的测定方

6、法转化速率的测定方法 (3) (3) 测量方法测量方法 5. 5. 定量分析定量分析催化一级反应：催化一级反应：dCG/dt=K1CAC催催 如果测定反应的初速，反应物如果测定反应的初速，反应物A的浓度的浓度cA改变很小，可视为恒定值并输改变很小，可视为恒定值并输入常数项，则入常数项，则 dCG/dt =K0C催催 (1)即反应的初速与催化剂的浓度成正比，上式积分得即反应的初速与催化剂的浓度成正比，上式积分得 CG=k0 C催催t （光度法中，（光度法中，A=K0 C催催t ） (2) 由此式可知，当由此式可知，当C催一定时，反应物的浓度催一定时，反应物的浓度CG与反应时间与反应时间t成直线关

7、系，成直线关系，为零级反应。为零级反应。 如果反应物如果反应物A的浓度不可忽略，即的浓度不可忽略，即CA不等于其初始浓度不等于其初始浓度C0，则式，则式(1)积分积分得得 -CA=K1C催催t - C0 （光度法中，光度法中， (A0/A)=K0 C催催t ） (3)当当C催一定时，反应物浓度催一定时，反应物浓度CG的负对数与反应时间的负对数与反应时间t成线性关系，为一级反成线性关系，为一级反应。应。，根据这些公式用图解法，根据这些公式用图解法就可求出被测物浓度。实际过程中，根据所监测转化速率的方法，选用与浓就可求出被测物浓度。实际过程中，根据所监测转化速率的方法，选用与浓度有线性关系的物理量

8、来代替浓度。度有线性关系的物理量来代替浓度。6 6定量分析实验技术和求值方法定量分析实验技术和求值方法 起始斜率法：也叫正切法，是一种根据线性曲线的斜率来测起始斜率法：也叫正切法，是一种根据线性曲线的斜率来测定待测物浓度的方法。定待测物浓度的方法。2. 固定时间法：让指示反应进行到某一确定的反应时间固定时间法：让指示反应进行到某一确定的反应时间tf ，然后测定与产物或反应物浓度有线性关系的特征值。然后测定与产物或反应物浓度有线性关系的特征值。3. 可变时间法可变时间法(固定浓度法固定浓度法)：测量指示反应中某反应物或产物浓度达到某规：测量指示反应中某反应物或产物浓度达到某规定数值时所需要的时间

9、。定数值时所需要的时间。原理指示反应：RP，C为催化剂tPtRddddr无催化剂时：无催化剂时： r r0 0= =k k0 0RR有催化剂时：有催化剂时： r rC C= =k kC CRCRC总反应速率：总反应速率： r总总=r0+rc=(k0+kCC)R催化剂浓度与速率成正比r= =k0+kCCdtPd原理：原理：反应开始阶段P50A, 假一级 r=-dA/dt=dP/dt=kA积分： A=A0Exp(-kt)单组分测定单组分测定方法：方法：1、起始斜率法、起始斜率法 r0=kA02、对数作图法、对数作图法 Ln(At)= Ln(A0)-kt(2 ) 多组分测定多组分测定(速差法速差法)

10、原理： A+RPA B+RPB R大大过量，PA，PB对检测器不可分 A=A0Exp(-kAt) PA=A0-A =A0(1-Exp(kAt)=A0fA(t)特点特点（与催化法比）：（与催化法比）：准确度高，灵敏度差(不超过光度法) P = PA+PB = A0fA(t)+B0fB(t)在t1, t2测定P1，P2 解方程或用多元统计方法，提高准确度多组分测定多组分测定(速差法速差法)7 7动力学分析法的灵敏度和选择性动力学分析法的灵敏度和选择性1. 灵敏度灵敏度 例例: A + B X + Y，若，若vt表示该反应进行表示该反应进行t分钟时的瞬时速率，则分钟时的瞬时速率，则 vt=dcx/d

11、t =cx/t = KckcAcB如果采用吸光度法检测如果采用吸光度法检测cx，则有，则有 A=cx b两式合并可得两式合并可得Ck= A/(tKcAcBb) 从理论上可估计推出催化剂最小浓度为从理论上可估计推出催化剂最小浓度为Ck=10-16 molL-1。2. 选择性选择性 提高测定过程的选择性提高测定过程的选择性 通过改变反应条件如试剂的浓度通过改变反应条件如试剂的浓度,体系的反应温度和酸度等或变换所使用的反应物，体系的反应温度和酸度等或变换所使用的反应物，使测定有利于待测元素而不利于感染元素。使测定有利于待测元素而不利于感染元素。 改变试剂的浓度，或者利用掩蔽剂和适当的活化剂，都能提高

12、测定过程的选择性。改变试剂的浓度，或者利用掩蔽剂和适当的活化剂，都能提高测定过程的选择性。 利用预分离除去干扰利用预分离除去干扰 利用预分离除去干扰，然后进行动力学测定。如果用萃取法分离，有时可直接在利用预分离除去干扰，然后进行动力学测定。如果用萃取法分离，有时可直接在有机相中进行催化测定。有机相中进行催化测定。 酶催化反应是生物化学中常见的反应，其显著酶催化反应是生物化学中常见的反应，其显著特点是它的特效性和高灵敏度，不仅可以用来测定特点是它的特效性和高灵敏度，不仅可以用来测定酶的活性，也可用来测定底物、活化剂或阻抑剂酶的活性，也可用来测定底物、活化剂或阻抑剂的浓度。的浓度。 酶阻抑剂能使酶

13、催化反应的速度降低，起始反酶阻抑剂能使酶催化反应的速度降低，起始反应速度随阻抑剂浓度的增大而减小，在一定的浓度应速度随阻抑剂浓度的增大而减小，在一定的浓度范围内呈线性关系，因此也可以测定阻抑剂的含量。范围内呈线性关系，因此也可以测定阻抑剂的含量。 第二部分第二部分 酶催化法酶催化法一一. .酶促反应动力学酶促反应动力学酶的特点酶的特点1酶催化动力学酶催化动力学2酶法分析酶法分析3酶是特殊的催化剂酶是特殊的催化剂 (1) 生物大分子生物大分子 (2) 催化条件温和催化条件温和 (3) 强酸、碱或高温强酸、碱或高温 下失活下失活 (3) 高选择性高选择性 (4) 高催化效率高催化效率1 酶的特点酶

14、的特点2 2 酶催化动力学酶催化动力学 k2比比k1和和k-1小得多，小得多，ES不变不变dES/dt=k1ES-k-1ES=0定义定义ESES的离解常数：的离解常数：酶催化动力学 在反应起始阶段，在反应起始阶段，S S0，则：，则：酶反应速率：酶反应速率：酶催化动力学酶催化动力学当当E全部与全部与S结合成结合成ES，S0足够大时，足够大时， rmax=k2E0假设假设 为快速可逆反应，为快速可逆反应，则：则：121kkk 米氏方程通过米氏常数米氏方程通过米氏常数Km部分表达了酶反应性质、反应条件和酶反应速部分表达了酶反应性质、反应条件和酶反应速度之间的关系。度之间的关系。Km的物理意义是：的

15、物理意义是：（1）Km= ， 说明说明Km是反应速度常数是反应速度常数k-1、k2和和k1的函数，的函数， 由于这些反应常数是由酶促反应性质、反应条件决定的，因此，对于由于这些反应常数是由酶促反应性质、反应条件决定的，因此，对于特定的反应、特定的反应条件来说，特定的反应、特定的反应条件来说，Km是一个特征常数，它一般只与酶的是一个特征常数，它一般只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶，性质有关，而与酶的浓度无关。不同的酶，Km值不同。但如果一种酶有几值不同。但如果一种酶有几种底物，则对每种底物，各有一个种底物，则对每种底物，各有一个Km值。所以，有时也可通过它来鉴别不值。所以，有时也可通

16、过它来鉴别不同来源或相同来源但生理状况不同，而催化相同反应的酶是否属于同一种酶。同来源或相同来源但生理状况不同，而催化相同反应的酶是否属于同一种酶。（2）人们常把）人们常把Km看作是看作是ES的解离常数。的解离常数。Km越大，越易解离，说明酶与底越大，越易解离，说明酶与底物的亲和力越小；反之，物的亲和力越小；反之，Km越小，可认为酶与底物的亲和力越大。越小，可认为酶与底物的亲和力越大。（3）当）当S= Km时，时，v0vm/2，因此，因此，Km在数值上等于当反应速度为最在数值上等于当反应速度为最大反应速度值一半时底物的浓度，或者说大反应速度值一半时底物的浓度，或者说Km是一半活性部位被填充时底

17、物是一半活性部位被填充时底物的浓度。所以的浓度。所以Km是衡量反应速度与底物浓度间关系的尺度。在实际工作中，是衡量反应速度与底物浓度间关系的尺度。在实际工作中，人们常通过人们常通过Km来确定酶促反应要达到某种速度应该使用的底物浓度。来确定酶促反应要达到某种速度应该使用的底物浓度。（4）在酶的多种底物中，）在酶的多种底物中，Km能帮助人们判断酶的最适底物。因为最好能帮助人们判断酶的最适底物。因为最好的底物应该具有最大的的底物应该具有最大的vm/Km值。值。酶催化动力学酶催化动力学当当S0足够大时足够大时(测酶测酶) rrmzx=k2E0与与E0成正比成正比当当S0较小时较小时(测底物测底物) r

18、与与S0成正比关系。成正比关系。3 3 酶法分析酶法分析1 测底物测底物2 测活化剂测活化剂3 测抑制剂测抑制剂类似于非催化法, 高选择性 例：测定血液中NH4+在胺类存在下测出410-11mol活化剂是酶蛋白成为活性催化剂必需物质灵敏度极高例：测定血桨中Mg至10ppb利用镁对异柠檬酸脱氢酶的活化作用 抑制分可逆和不可逆 金属离子如: Ag，Bi，Co，Cu 阴离子如： CN-，Cr2O72-，F-，S2- 该法还可测定许多农药二、二、 影响酶促反应的因素影响酶促反应的因素 影响酶促反应的因素很多，除了酶和底物的性质及浓度，还应该考影响酶促反应的因素很多，除了酶和底物的性质及浓度，还应该考虑

19、酶的抑制剂、温度、虑酶的抑制剂、温度、pH值、酶的活性和底物浓度等。值、酶的活性和底物浓度等。1、抑制剂、抑制剂 降低酶促反应速度的物质称为抑制剂。抑制剂的作用分为永久降低酶促反应速度的物质称为抑制剂。抑制剂的作用分为永久性的（不可逆）和暂时性的（可逆）。许多药物和毒物就是通过抑制性的（不可逆）和暂时性的（可逆）。许多药物和毒物就是通过抑制酶的活性来起作用的。酶的活性来起作用的。 利用酶活性的降低所引起的光（或电）化学信号的降低，可利用酶活性的降低所引起的光（或电）化学信号的降低，可以检测抑制剂。最常见的抑制剂是有机磷杀虫剂，这类杀虫剂可与乙以检测抑制剂。最常见的抑制剂是有机磷杀虫剂，这类杀虫剂可与乙酰胆碱酯酶结合，抑制胆碱脂酶活性。不可逆抑制也可利用化学方法酰胆碱酯酶结合，抑制胆碱脂酶活性。不可逆抑制也可利用化学方法除去抑制剂除去抑制剂, 使酶复活。使酶复活。 可逆抑制的特征使抑制剂和酶很快达成平衡。由于酶和抑制可逆抑制的特征使抑制剂和酶很快达成平衡。由于酶和抑制剂的结合是可逆的，所以可逆抑制剂可以被大浓度的正常底物所取代。剂的结合是可逆的，所以可逆抑制剂可以被大浓度的正常底物所取代。2、温度、温度