DB15∕T 2484-2021 胡萝卜小孢子培养技术规程

1、 ICS 65.020.20CCS B0515内蒙古自治区地方标准DB15/T 24842021胡萝卜小孢子培养技术规程Technical code of practice for microspore culture of carrot2021-12-25发布2022-01-25实施 DB15/T 24842021前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。I DB15/T 24842021胡萝卜小孢子培养技术规程12范围本文件规定了胡萝卜小孢子培养技术的操作流程。本文件适用于胡萝卜的小孢子培养。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的

2、规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682NY/T 2306分析实验室用水规格和试验方法花卉种苗组培快繁技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。小孢子 microspore高等植物生活史中雄配子体发育过程中短暂而重要的阶段，是减数分裂后四分体释放出的单倍性单细胞。小孢子培养 microspore culture采用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的小孢子，通过无菌操作技术接种在人工培养基上，诱导形成愈伤组织或胚状体，进而形成完整植株的一种培养方式。单倍

3、体 haploid体细胞中含有本物种配子染色体数目的个体。4试剂超纯水应符合GB/T 6682中规定的三级超纯水。1 DB15/T 24842021药品消毒试剂：乙醇，氯化汞。无机试剂：硝酸铵，硝酸钾，硫酸铵，氯化钙、硝酸钙，硫酸镁，磷酸二氢钾，磷酸二氢钠，碘化钾，硼酸，硫酸锰，硫酸锌，钼酸钠，硫酸铜，氯化钴，硫酸亚铁，EDTA二钠盐。有机试剂：肌醇，烟酸，盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸，叶酸，生物素，谷氨酰胺，丝氨酸，谷胱甘肽。生长调节剂：2,4-D，6-BA。其他试剂：琼脂，活性炭，蔗糖。所有药品等级均为分析纯。5仪器设备纯水仪，万分之一分析天平，pH计，移液枪，恒温培养箱，电磁炉，超净工

4、作台，高压灭菌锅，离心机，光学显微镜。6培养基配制灭菌与分装小孢子培养各阶段使用商品化的B5、NLN、MS和1/2MS基本培养基，具体成分及含量见附录A。按培养基说明书用量加入基本培养基、根据附录A的用量加入除琼脂外的其它成分，待培养基内所有组分充分溶解后，调pH值至5.8，定容，按附录A的用量加入琼脂粉，分别制成分离培养基、诱导培养基、分化培养基和生根培养基。将配制好的培养基分装至三角瓶中封口后进行高压蒸汽灭菌，灭菌应符合NY/T 2306的规定。灭菌结束后，待培养基温度降至5560时，在超净工作台中将分离培养基、诱导培养基、分化培养基分装至培养皿中、生根培养基分装至三角瓶中，自然冷却。7小

5、孢子培养技术流程采样选择生长势好、无病虫害的健壮植株，于晴天上午取开花后15 d25 d的花序。剥取花药压片并使用1%醋酸洋红染色，镜检筛选花粉母细胞处于单核期的花序。外植体消毒将花序用自来水冲洗10 min，用剪刀将小花依次剪下，置于烧杯中，在超净工作台中依次用75 %乙醇50 s、0.1 %氯化汞4 min消毒、无菌水冲洗6次，沥干水分。小孢子分离将消毒后的小花转入无菌研钵，加入1倍体积的分离培养基，用研棒轻研，液体经400目筛过滤至10mL离心管中，700 r/min离心3 min，去上清液，沉淀用1 mL分离培养基悬浮。重复上述步骤2次后，将悬浮液加入液体诱导培养基中，将小孢子浓度调至

6、1×10个·mL。吸取2 ml移入固体诱导培养基中。5 -1诱导胚状体2 DB15/T 24842021将培养皿放入恒温培养箱中33下暗培养2 d，然后25下暗培养50 d120 d至胚状体产生。胚状体分化当小孢子分化出胚状体时，将胚状体接种于分化培养基中。将培养皿放入培养箱中，培养条件为光照强度1500 lx，16 h·d，温度26。培养30 d左右可以形成小苗。-1诱导生根选取生长健壮的离体再生苗移植到生根培养基上，每个三角瓶中放置23株。将培养瓶放至培养箱中，培养条件为光照强度1500 lx，16 h·d，温度26，培养2至4周直至小苗生出完整根系

7、。-1炼苗与移栽将培养瓶放置于日光温室中，打开瓶盖，加水至培养基上1 cm，炼苗3 d，然后将根部培养基清洗干净，栽种于装有消毒育苗基质的营养钵中，浇水后用塑料袋覆盖保湿，7 d后取掉塑料袋。温度白天控制在25±3，夜晚12±3。8倍性鉴定取幼苗根尖，采用根尖压片法进行压片，在显微镜下观察染色体数目，当再生植株染色体数目为9条时，证明该植株为单倍体。3 DB15/T 24842021AA附录 A（资料性）培养基成分及用量A.1商品基本培养基成分用量见表A.1。表A.1商品基本培养基成分及用量表单位为毫克每升分离培养基诱导培养基NLN1250分化培养基生根培养基1/2MS95

8、08250培养基成分B5MS190016500KNO32500NH4NO30(NH4)2SO4CaCl2·2H2OCa(NO3)2·4H2OMgSO41340150044002200050061.041250122.09180170090KH2PO4085NaH2PO4130.440MnSO4·H2OH3BO31018.941022.36.28.60.250.0250.0250.8327.837.31000.10.50.5222.36.28.60.250.0250.0250.8327.837.31000.10.50.5232ZnSO4·7H2ONa2MoO4·2H2OCuSO4·5H2OCoCl2·6H2OKI100.250.0250.0250.7527.837.3100100.250.0250.0250FeSO4·7H2ONa2EDTA·2H2O肌醇27.837.31000.50.55盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸11甘氨酸02叶酸00.50.058001003000生物素000L-谷氨酰胺L-丝氨酸谷胱甘肽0000000004 DB15/T 24842021