第三章食品中细菌菌落总数其检验

1、第三章第三章 食品中细菌菌落总数检验食品中细菌菌落总数检验 检验流程操作技巧计数与报告2022-6-131 1华南农业大学食品学院 林捷菌落总数食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。2022-6-132 2华南农业大学食品学院 林捷食品中食品中细菌数量的表示方法细菌数量的表示方法细菌总数，也称细菌直接显微镜数。通常以细菌总数，也称细菌直接显微镜数。通常以1g1g或或1mL1mL

2、或或lcmlcm2 2样品中的细菌总数来表示。样品中的细菌总数来表示。 菌落总数：菌落总数：菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的菌落：指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。细菌集合而成。检测：指一定数量或面积的食品样品，在一定条检测：指一定数量或面积的食品样品，在一定条件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个件下进行细菌培养，使每一个活菌只能形成一个肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落肉眼可见的菌落，然后进行菌落计数所得的菌落数量。通常以数量。通常以lglg或或1mL1mL或或lcml

3、cm2 2样品中所含的菌落数样品中所含的菌落数量来表示。量来表示。2022-6-133 3华南农业大学食品学院 林捷细菌菌落总数按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养48h，能在平板计数琼脂上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，仅是需氧菌和兼性厌氧菌数。2022-6-134 4华南农业大学食品学院 林捷细菌菌落总数检验GB4789.2-2010 检 样选取几个适当倍数的稀释液每皿加入约15-20mL平板计

4、数琼脂（PCA）361 482h菌 落 计 数报 告第一法第一法2022-6-135 5华南农业大学食品学院 林捷实验材料实验材料1 1、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、电炉、电热恒温培养箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、电炉、吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试吸管、广口瓶、三角瓶、玻璃珠、平皿、试管、试管架、微量移液器、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌管架、微量移液器、酒精灯、均质器或乳钵、灭菌刀或剪刀、灭菌镊子、刀或剪刀、灭菌镊子、75%75%酒精棉球、油性笔、登记酒精棉球、油性笔、登记薄薄2 2、培养基和试剂：、培养基和试剂：75%75%乙醇、生理盐水（磷酸缓冲乙醇、生理盐水（磷酸

5、缓冲液）、液）、1mol/mL1mol/mL氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液、 1mol/mL1mol/mL盐酸溶液、盐酸溶液、平板计数琼脂培养基、平板计数琼脂培养基、petrifilmpetrifilm纸片和压板，检验纸片和压板，检验方法。方法。2022-6-136 6华南农业大学食品学院 林捷PCA与与NA2022-6-137 7华南农业大学食品学院 林捷样品的处理样品的处理样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或（或0.10.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含

6、盐量较高的食品（如酱油）进有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。必要时可调解必要时可调解pHpH值至中性。值至中性。无菌操作：所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、无菌操作：所用玻璃器皿必须是完全灭菌的。所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。琼脂平板在操作的工乙醇在包装开口处擦拭后取样。琼脂平板在操作的工作台暴露作台暴露3030分钟，每个平板不得超过分钟，每个平板不得超过2 2个菌落。个菌落。采样的代表性：多点取样

7、、均质或研磨、振摇等方法处理，采样的代表性：多点取样、均质或研磨、振摇等方法处理，以获得均匀稀释液。以获得均匀稀释液。2022-6-138 8华南农业大学食品学院 林捷稀释程序稀释程序2022-6-139 9华南农业大学食品学院 林捷25g倾注培养倾注培养根据标准要求或对污染情况的估计，选择23个适宜稀释度，分别在稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1ml稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46营养琼脂培养基注入平皿约15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置361温箱内培养482h，取出计

8、算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。2022-6-131010华南农业大学食品学院 林捷对照对照空白对照：不加样品，反应培养基中的杂质及污染情况稀释液对照：加1mL无菌稀释液，反映稀释液是否受到污染样品对照：加1mL样品稀释液后放冰箱，以区别样品中的杂质无菌操作对照：在空气中暴露30min，反应空气质量和操作技术2022-6-131111华南农业大学食品学院 林捷洁净级别标准超净工作台，要求100级；无菌室空间，要求1万级。2022-6-131212华南农业大学食品学院 林捷倾注培养基倾注培养基倾注培养基一般以倾注培养基一般以15ml15ml较为适宜，平板过厚影

9、响观察，较为适宜，平板过厚影响观察，太薄易干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部太薄易干裂。倾注时，培基底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。，以防止细菌有所死亡或繁殖。如预计样品中存在会在如预计样品中存在会在

10、PCAPCA上形成蔓延菌落，可在培养上形成蔓延菌落，可在培养基凝固后在加入约基凝固后在加入约4mL4mL培养基，凝固后再翻转平板。培养基，凝固后再翻转平板。2022-6-131313华南农业大学食品学院 林捷培养培养培养基凝固后倒置培养。培养基凝固后倒置培养。培养温度一般为培养温度一般为363611（水产品的培养温度，（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用由于其生活环境水温较低，故多采用303011）。）。培养时间一般为培养时间一般为48h(48h(水产品水产品72723h)3h)。培养箱应。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养保持一定的湿度，琼脂平板培养48h48h后，培养基后

11、，培养基失重不应超过失重不应超过1515。为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，可同时作一稀释液与琼脂培基菌菌落发生混淆，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，于混合的平板，于44环境中放置，以便计数时作环境中放置，以便计数时作对照观察。或在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑对照观察。或在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTCTTC），培养后菌落呈红色，易于分别。），培养后菌落呈红色，易于分别。2022-6-131414华南农业大学食品学院 林捷平板菌落数的选择 选取菌落数在选取菌落数在3030300300之间的平板作为菌落总数测定标准。之

12、间的平板作为菌落总数测定标准。 一个稀释度使用两个平板，其中一个平板有较大片状菌落一个稀释度使用两个平板，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2 2以代以代表全皿菌落数。表全皿菌落数。 平皿内如有链状菌落生长时平皿内如有链状菌落生长时( (菌落之间无明显界线菌落之间无明显界线) )，若仅，若仅有一条链，可视为一个菌落；如

13、果有不同来源的几条链，有一条链，可视为一个菌落；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。则应将每条链作为一个菌落计。 当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300300时），但分布很均匀，可取平板的一半或时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/41/4计数。计数。2022-6-131515华南农业大学食品学院 林捷菌落计算公式有两个稀释度的菌有两个稀释度的菌落数在合适范围的落数在合适范围的情况下，使用菌落情况下，使用菌落计算公式。计算公式。2022-6-131616华南农业大学食品学院 林捷例一2022-6-131717华南农业大学

14、食品学院 林捷例二2022-6-131818华南农业大学食品学院 林捷菌落计算公式的统计学依据菌落计算公式的统计学依据2022-6-131919华南农业大学食品学院 林捷报告方法按国家标准方法规定菌落数在按国家标准方法规定菌落数在1 1100100时，按实有数字时，按实有数字报告；报告；如大于如大于100100时，则报告前面两位有效数字，第三位数时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。后面用按四舍五入计算。后面用0 0来代替位数，或采用来代替位数，或采用1010的的指数方式表示指数方式表示, ,保留保留2 2位有效数字。位有效数字。若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓若所

15、有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。延。若空白对照上面有菌落生长，则此次检验结果无效。若空白对照上面有菌落生长，则此次检验结果无效。固体检样以克（固体检样以克（g)g)为单位报告，液体检样以毫升（为单位报告，液体检样以毫升（mlml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cmcm2 2）报告。）报告。2022-6-132020华南农业大学食品学院 林捷菌落计数的重复性要求（菌落计数的重复性要求（ISO4833:2003ISO4833:2003）2022-6-132121华南农业大学食品学院 林捷菌落计数的重现性要求（菌落计数的重现性要求（ISO4833:

16、2003ISO4833:2003）2022-6-132222华南农业大学食品学院 林捷菌落总数的其它检验方法菌落总数的其它检验方法菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试纸片法测试纸片法检验流程：与国标法同，只是将培养基更换为PetrifilmTM菌落总数测试纸片测试纸片调节PH：样品匀液后，用1mol/mL1mol/mL氢氧化钠氢氧化钠溶液或溶液或1mol/mL1mol/mL盐酸溶液盐酸溶液调节至pH6.67.2。稀释：按照国标法进行。2022-6-132323华南农业大学食品学院 林捷接种接种测试纸片平放台面，揭开上层膜，用吸管或移液器吸取1mL样品匀液，垂直加在纸片中央，盖膜，压板，拿

17、去压板，静置1min，待培养基凝固后，每个稀释度接种2张测试纸片。2022-6-132424华南农业大学食品学院 林捷2022-6-132525华南农业大学食品学院 林捷菌落总数菌落总数PETRIFILMTM测试纸片法测试纸片法培养：水平放置，透明面向上，每堆低于20片，其他与第一法同。计数：选取菌落数在30300之间的测试纸片计数；计数所有红色菌落；整个纸片为红色和粉红色，或是纸片中央无菌落，边缘很多，均记录为“多不可计”；培养基液化，可计算未液化面积来估算菌数。2022-6-132626华南农业大学食品学院 林捷多不可计多不可计2022-6-132727华南农业大学食品学院 林捷菌落总数的

18、其它检验方法菌落总数的其它检验方法涂布平板法：将营养琼脂制成平板，在上面滴加检样稀释液0.2ml，用“L”棒涂布于整个平板的表现，放置约10分钟，将平板翻转，放至361温箱内培养242小时，（水产品用30C培养482小时)取出，进行菌落计数，然后乘以5(由02ml换算为1ml)，再乘以样品稀释液的倍数，即得每克或每升检样所含菌落数。特点：因为菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，虽检样中含有食品颗粒，也不会发生混淆但是本法取样量比常规检验法少。代表性会受到一定影响。2022-6-132828华南农业大学食品学院 林捷菌落总数的其它检验方法菌落总数的其它检验方法点滴平板法：用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使每滴相当于0025m1)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域(预先在乎板背面用标记笔划成四个区域)每个区域滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验。滴加后，将平板放平约10分钟，然后翻转平板，如涂布平板法+样移入温