微生物的生长

1、1 微生物生长的概念微生物生长的概念 微生物在适宜的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按自身的代谢方式进微生物在适宜的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按自身的代谢方式进行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质的总量（包括重量、体积、行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质的总量（包括重量、体积、大小）不断地增加，称为微生物的大小）不断地增加，称为微生物的生长现象生长现象。 单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重

2、复上述过程，使细胞度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重复上述过程，使细胞数目增加，称为数目增加，称为繁殖繁殖。在多细胞微生物中，例如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴。在多细胞微生物中，例如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做程才叫做繁殖繁殖。 生长也可以认为是微生物生长也可以认为是微生物群体数

3、量增加群体数量增加。在一般情况下，当环境条件适合，生在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。长与繁殖始终是交替进行的。2 生长量的测定生长量的测定一、直接法一、直接法 1、测体积、测体积 2、称干重、称干重二、间接法二、间接法 1、生理指标法、生理指标法（1） 测定细胞总含氮量测定细胞总含氮量粗蛋白总量粗蛋白总量=含氮量含氮量%6.25（2）含碳量的测定）含碳量的测定（3）其它：磷、）其它：磷、DNA、RNA、ATP和和 N乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产气、产CO2、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的测定。、耗氧、粘度和产热等指标

4、，均可用于生长量的测定。 2、比浊法、比浊法 微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的增高。最微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用古老的比浊法是采用McFarland比浊管，用不同浓度的比浊管，用不同浓度的Bacl2与稀与稀H2SO4配制成的配制成的10支试管，支试管，其中形成的其中形成的BaSO4有有10个梯度，表示个梯度，表示10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即一未知浓度的菌液在

5、透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。可目测出该菌液的大致浓度。精确的测定，要用分光光度计进行精确的测定，要用分光光度计进行。在可见光的。在可见光的450650nm波长内均可测定波长内均可测定。三、计数法三、计数法计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目，此法适宜于单细胞状态的微生物或孢子。计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目，此法适宜于单细胞状态的微生物或孢子。1、直接法、直接法 直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括死细胞在直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括死细胞在内的总菌数。内的总菌数。

6、（1）比例计数法比例计数法 是一种粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）是一种粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未知菌液中的细胞浓度。知菌液中的细胞浓度。（2）血球计数板法血球计数板法 计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌较为适用。详细方法见实验指导书。较为适用。详细方法见实验指导书。血球计数板方法血球计数板方法2、间接法、间接法

7、是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊，在固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。浊，在固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。（1）平板菌落计数法）平板菌落计数法 一种常用的食品中细菌总数的计数法，有标准方法将待测样品稀释，一种常用的食品中细菌总数的计数法，有标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平板上出现的菌落数乘以样品的稀释度，即可计算出样品的含菌数。也可板上出现的菌落数乘以样品的稀释度，即

8、可计算出样品的含菌数。也可用涂布法将稀释样品接种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法用涂布法将稀释样品接种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确，缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间的优点是检测的结果较为精确，缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间长。长。（2）液体稀释法液体稀释法 对未知样品作对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的倍系列稀释。选适宜的3个连续的个连续的10倍稀释液各取倍稀释液各取3ml，接种到，接种到3组共组共9支液体培养基试管中，每管接入支液体培养基试管中，每管接入1ml，培养一定的时间后，记录每个稀释度出，培养一定的时间后，记录每个稀释度出现生长的

9、试管数，然后查现生长的试管数，然后查MPN（most probable number ，最近似数）表，根据样最近似数）表，根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。（3）细胞混浊度的测定细胞混浊度的测定 估计细胞数目和粗重的一较快和适用的方法是使用混浊度测定法。一个细胞悬浮估计细胞数目和粗重的一较快和适用的方法是使用混浊度测定法。一个细胞悬浮液用肉眼观察是呈现浑浊的，这时因为光线通过悬浮液时，细胞散射光线。存在的液用肉眼观察是呈现浑浊的，这时因为光线通过悬浮液时，细胞散射光线。存在的细胞数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。可以用光度计或分光光细胞

10、数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。可以用光度计或分光光度计测量混浊度，分光光度计和光度计射出的光线通过细胞悬浮液时，就可以检测度计测量混浊度，分光光度计和光度计射出的光线通过细胞悬浮液时，就可以检测出没有被细胞散射的光线。出没有被细胞散射的光线。（比浊法）（比浊法） 1、延滞期（、延滞期（lag phase） 又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。延滞期有如下特点：延滞期有如下特点

11、：（1）生长的速率常数为零。）生长的速率常数为零。（2）细胞的体积增大，）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂做准备。、含量增多为分裂做准备。（3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。的合成加快，易产生诱导酶。（4）对不良环境敏感，例如）对不良环境敏感，例如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，其方法主要有：发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，其方法主要有：（1）以对数期的菌体作种子菌，）以对数期的菌体作种子菌，（2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延

12、滞期的一个重要因素）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个重要因素 ，接种量大，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。一般采用延滞期短，接种量小，则延滞期长。一般采用38%的接种量，最高不超过的接种量，最高不超过1/10。（3）培养基的成分）培养基的成分 为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基。养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基。2、对数期（、对数期（logarithmic phase）又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的

13、一段时期。此时菌体细胞生长的速又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generation time）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，细短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，细胞以惊人的速度产生，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。胞以惊人的速度产生，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。 在对数期中，以下三个参数尤为重要对数期中，以下三个参数尤为重

14、要（P112)。(1)繁殖代数（繁殖代数（n）(2)生长速率常数（生长速率常数（R）(3)代时（代时（G）影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有：影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有：（1）菌种）菌种 ：不同微生物代时差别大，即使是同一菌种，由于培养基成分和物理条：不同微生物代时差别大，即使是同一菌种，由于培养基成分和物理条件（如培养温度、培养基的件（如培养温度、培养基的pH和营养物质的性质）的不同，其对数期的代时和营养物质的性质）的不同，其对数期的代时也不同。但是，在一定条件下，各种菌的代时是相对稳定的，多数为也不同。但是，在一定条件下，各种菌的代时是相对稳定的，多数为2030分分

15、钟，有的长达钟，有的长达33小时，快的只有小时，快的只有9.8分钟左右。分钟左右。细细 菌菌培养基培养基温度（温度（）代时（分）代时（分）漂 浮 假 单 胞 菌 （漂 浮 假 单 胞 菌 （P s e u d o m o n a s natriegenes）大肠杆菌（大肠杆菌（Escherichia coli）蜡状芽孢杆菌（蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）嗜热芽孢杆菌（嗜热芽孢杆菌（Bacillus thermophilus）枯草芽孢杆菌（枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）巨大芽孢杆菌（巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）乳酸链球菌（乳酸链球菌（

16、Streptococcus lactis）嗜酸乳杆菌（嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）伤寒沙门氏菌（伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）金黄色葡萄球菌（金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）霍乱弧菌（霍乱弧菌（Vibrio cholerae）丁酸梭菌（丁酸梭菌（Clostridium butyricum）大豆根瘤菌（大豆根瘤菌（Rhizobium japonicum）结 核 分 枝 杆 菌 （结 核 分 枝 杆 菌 （M y c o b a c t e r i u m tuberculosis）活跃硝化杆菌（活跃硝化杆菌（Nit

17、robacter agilis）梅毒密螺旋体（梅毒密螺旋体（Treponema pallidum）褐球固氮菌（褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）肉汤肉汤 肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤肉汤牛乳牛乳牛乳牛乳肉汤肉汤肉汤肉汤 肉汤肉汤肉汤肉汤玉米醪玉米醪合成合成 合成合成家兔家兔葡萄糖葡萄糖 27 373055253037373737 37302537 273725 9. 8 171818.326323126668723.527 30 213851344 461792 932 12001980240（2）营养成分）营养成分 ：同种细菌，营养丰富的培养基，其代时就短，

18、反之则长。同种细菌，营养丰富的培养基，其代时就短，反之则长。（3）培养温度）培养温度 ：温度是影响微生物生长速率的重要物理因素。在微生物的最适生长温：温度是影响微生物生长速率的重要物理因素。在微生物的最适生长温度范围时，代时就短。度范围时，代时就短。大肠杆菌在不同温度下的代时大肠杆菌在不同温度下的代时温度（温度（）代时（分）代时（分）温度（温度（）代时（分）代时（分）101520253086012090402935404547.52217.520773、稳定期稳定期 （stationary phase） 稳定期又叫最高生长期或恒定期。处于稳定期的微生物其特点是新繁殖的细胞数与稳定期又叫最高生长

19、期或恒定期。处于稳定期的微生物其特点是新繁殖的细胞数与衰亡细胞数几乎相等，细胞数目没有净增加或净减少，即是正生长与负生长达动态平衡，衰亡细胞数几乎相等，细胞数目没有净增加或净减少，即是正生长与负生长达动态平衡，此时生长速度逐渐趋向于零。此时生长速度逐渐趋向于零。出现稳定期的原因主要有：出现稳定期的原因主要有：（1）营养物质耗尽，营养物质的比例失调，例如）营养物质耗尽，营养物质的比例失调，例如C/N比值不合适等；比值不合适等；（2）酸、醇、毒素或过氧化氢等有害代谢产物的累积；）酸、醇、毒素或过氧化氢等有害代谢产物的累积；（3）pH、氧化还原势等环境条件越来越不适宜等。、氧化还原势等环境条件越来越

20、不适宜等。 在稳定期虽然没有出现生长，但许多细胞功能包括能量代谢和某些生化合成过程都在稳定期虽然没有出现生长，但许多细胞功能包括能量代谢和某些生化合成过程都仍然在继续，稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，仍然在继续，稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，产物的积累也达到了高峰，这时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系。此外，由于对稳定期到这时，菌体的总产量与所消耗的营养物质之间存在着一定关系。此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，促进了连续培养技术的产生和研究。生产上常常通过补料、调节温来的原因进行研究，促进了连续培养技术的产生和研究。生产上常常通过

21、补料、调节温度和度和pH等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。等措施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。 4、衰亡期（、衰亡期（decline phase或或 death phase） 如果群体细胞达到稳定期后仍继续培养，这些细胞或许仍能维持生命和继续进如果群体细胞达到稳定期后仍继续培养，这些细胞或许仍能维持生命和继续进行代谢，但它们也可能死亡。如果出现死亡，就认为群体细胞处于衰亡期。稳定期行代谢，但它们也可能死亡。如果出现死亡，就认为群体细胞处于衰亡期。稳定期后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中活菌数目急剧下后，微生物死亡率逐渐增加，以致死亡数大大超过新生数，群体中

22、活菌数目急剧下降，出现了降，出现了“负生长负生长”（R为负值），此阶段叫衰亡期。为负值），此阶段叫衰亡期。 这时，细胞形态多样，例如产生很多膨大、不规则的退化形态；有的细胞内多这时，细胞形态多样，例如产生很多膨大、不规则的退化形态；有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强发液泡，革兰氏染色反应为阳性的变成阴性；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强发生自溶（生自溶（autolysis）；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物；对于芽孢杆菌，）；有的微生物在这时产生抗生素等次生代谢产物；对于芽孢杆菌，芽孢释放往往也发生在这一时期。芽孢释放往往也发生在这一时期

23、。二、微生物的连续培养二、微生物的连续培养 连续培养连续培养( continuous culture )又叫开放培养又叫开放培养( open culture )，是相对分，是相对分批培养批培养( batch culture )或密闭培养或密闭培养( closed culture )而言的。而言的。 在分批培养的指数前期，培养条件或许可以维持相对稳定，但在后期，当在分批培养的指数前期，培养条件或许可以维持相对稳定，但在后期，当细胞数目变得非常大的时候，培养基的化学组成一般会发生巨大的变化。对许细胞数目变得非常大的时候，培养基的化学组成一般会发生巨大的变化。对许多研究来说，都希望能长时间地保持培养

24、物处于一种稳定的环境中，这就可以多研究来说，都希望能长时间地保持培养物处于一种稳定的环境中，这就可以通过使用连续培养而获得。通过使用连续培养而获得。 连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，认识到了稳定期到来的原因，连续培养是在研究典型生长曲线的基础上，认识到了稳定期到来的原因，采取在培养器中不断补充新鲜营养物质，另一方面，及时不断地以同样速度排采取在培养器中不断补充新鲜营养物质，另一方面，及时不断地以同样速度排出培养物（包括菌体和代谢产物）。这样，培养物就可达动态平衡，其中的微出培养物（包括菌体和代谢产物）。这样，培养物就可达动态平衡，其中的微生物可长期保持在对数期的平衡生长状态和稳定的生长速

25、率上。生物可长期保持在对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率上。连续培养的方法主要有两类：连续培养的方法主要有两类：1、恒浊法、恒浊法 其原理是根据培养器内微生物的生长密度，用光电控制系统（浊度计）来检测培养其原理是根据培养器内微生物的生长密度，用光电控制系统（浊度计）来检测培养液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液的流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定液的浊度（即菌液浓度），并控制培养液的流速，从而获得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养液。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，的微生物细胞的连续培养液。在恒浊器中的微生物，始终能以最高生长速率进行生长，并可在允许范围内控

26、制不同的菌体密度。并可在允许范围内控制不同的菌体密度。2、恒化法、恒化法 恒化法是使培养液流速保持不变，使微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生恒化法是使培养液流速保持不变，使微生物始终在低于最高生长速率条件下进行生长繁殖的一种连续培养方法。常常通过控制某一种营养物的浓度，使其成为限制性的因长繁殖的一种连续培养方法。常常通过控制某一种营养物的浓度，使其成为限制性的因子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。随着子，而其他营养物均为过量，这样，细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。随着细菌的生长，菌体的密度会随时间的增长而增高，而限制性生长因子的浓度又会随时间细

27、菌的生长，菌体的密度会随时间的增长而增高，而限制性生长因子的浓度又会随时间的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培的增长而降低，两者互相作用的结果，出现微生物的生长速率正好与恒速加入的新鲜培养基流速相平衡。养基流速相平衡。连续培养装置结构连续培养装置结构连续培养如用于发酵工业中，就称为连续培养如用于发酵工业中，就称为连续发酵（连续发酵（continuous fermentation）。连续发酵与分批发酵相比有许多优点：连续发酵与分批发酵相比有许多优点： （1）自控性，便于利用各种仪表进行自动控制；（）自控性，便于利用各种仪表进行自动控制；（2）高效，它使装料

28、、灭菌、）高效，它使装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等工艺简化了，缩短了生产时间和提高了设备的利用效率；出料、清洗发酵罐等工艺简化了，缩短了生产时间和提高了设备的利用效率；（3）产品质量较稳定；（）产品质量较稳定；（4）节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、）节约了大量动力、人力、水和蒸汽，使水、汽、电的负荷减少。电的负荷减少。不足之处：（不足之处：（1）主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件下，）主要是菌种易于退化，使微生物长期处于高速繁殖的条件下，即使是自发突变率很低，也难以避免变异的发生。（即使是自发突变率很低，也难以避免变异的发生。（2）容易污染，在连续发）容易污染，在连续

29、发酵中，要保持各种设备无渗漏，通气系统不出任何故障，是极其困难的。因此，酵中，要保持各种设备无渗漏，通气系统不出任何故障，是极其困难的。因此，“连续连续”是有时间限制的，一般可达数月至一年、两年。（是有时间限制的，一般可达数月至一年、两年。（3）连续培养中，）连续培养中，营养物的利用率低于分批培养。营养物的利用率低于分批培养。 由于细胞的生长差异，同步生长常常只能维由于细胞的生长差异，同步生长常常只能维持持2-32-3代，之后又逐渐转变为非同步生长。代，之后又逐渐转变为非同步生长。三、同步生长三、同步生长 在分批培养中，细菌群体以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂，即是在分批培养中，细菌

30、群体以一定速率生长，但所有细胞并非同时进行分裂，即是培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。要培养中的细胞不处于同一生长阶段，它们的生理状态和代谢活动也不完全一样。要研究每个细胞所发生的变化是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使微生物研究每个细胞所发生的变化是很困难的。为了解决这一问题，就必须设法使微生物群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，所有的细胞都能同时分裂，群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，所有的细胞都能同时分裂，因而发展了单细胞的同步培养（因而发展了单细胞的同步培养（synchronous culture）技术。）技术。获得细

31、菌同步生长的方法主要有两类：获得细菌同步生长的方法主要有两类：调整生理条件诱导同步性调整生理条件诱导同步性 主要是通过控制环境条件如温度、光线和处于稳定期的培养物添加新鲜培养基主要是通过控制环境条件如温度、光线和处于稳定期的培养物添加新鲜培养基等来诱导同步。等来诱导同步。机械法（又称选择法）机械法（又称选择法） 一般可用过滤分离法或梯度离心法来达到。在这两种方法中，由于诱导法可能一般可用过滤分离法或梯度离心法来达到。在这两种方法中，由于诱导法可能导致与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，这在生理学研究中导致与正常细胞循环周期不同的周期变化，所以不及选择法好，这在生理学研究中尤其明

32、显。尤其明显。a.膜洗脱法膜洗脱法 b.密度剃度离心法密度剃度离心法用用Helmstetter-Cummings法获得同步生长的细菌法获得同步生长的细菌 影响微生物生长的外界因素很多，其一是前面讨论过的营养物质，其二是许多物理、影响微生物生长的外界因素很多，其一是前面讨论过的营养物质，其二是许多物理、化学因素。当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖化学因素。当环境条件的改变，在一定限度内，可引起微生物形态、生理、生长、繁殖等特征的改变。等特征的改变。几个有关的术语：几个有关的术语：消毒消毒是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播。是指杀死或消除所有病

33、原微生物的措施，可达到防止传染病传播。防腐防腐指利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡指利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的方法。常用低温、干燥、盐腌、糖渍等方法，或加化学防腐剂于食品中防止食品腐的方法。常用低温、干燥、盐腌、糖渍等方法，或加化学防腐剂于食品中防止食品腐败、变质。败、变质。灭菌灭菌是指利用一切物理或化学因子，使存在于物体内所有活的微生物，永久性地是指利用一切物理或化学因子，使存在于物体内所有活的微生物，永久性地丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢，是一种彻底杀菌措施。丧失其生活力，包括最耐热的细菌芽孢，是一种彻底杀菌措施。商

34、业灭菌商业灭菌又叫杀菌，是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，它是指食品经过杀又叫杀菌，是从商品的需要出发对食品进行的灭菌，它是指食品经过杀菌处理后按照一定的检验方法检不出活的微生物或仅能检出极少数非病原微生物，而菌处理后按照一定的检验方法检不出活的微生物或仅能检出极少数非病原微生物，而且它们在一定的保存期内不致引起食品变质腐败。且它们在一定的保存期内不致引起食品变质腐败。 就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下就总体而言，微生物生长的温度范围较广，已知的微生物在零下12100均可生均可生长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长。长。而每一种微生物只能在一定的温度范围内生长

35、。温度对典型的嗜冷生物、嗜温生物、嗜热生物及两种不同的嗜高温生温度对典型的嗜冷生物、嗜温生物、嗜热生物及两种不同的嗜高温生物的生长速率之间的关系物的生长速率之间的关系最低生长温度最低生长温度 是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。是指微生物能进行繁殖的最低温度界限。 最适生长温度最适生长温度是指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。但是，同一微是指某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。但是，同一微生物，不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等于生生物，不同的生理生化过程有着不同的最适温度，也就是说，最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度

36、最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或累积代谢产物量最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度。因此，生产上要根据微的培养温度，更不等于累积某一代谢产物量最高时的培养温度。因此，生产上要根据微生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或发酵。例如，嗜热链球菌的生物不同生理代谢过程温度的特点，采用分段式变温培养或发酵。例如，嗜热链球菌的最适生长温度为最适生长温度为37，最适发酵温度为，最适发酵温度为47，累积产物的最适温度为，累积产物的最适温度为37。最高生长温度最高生长温度是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温

37、度下，微生物细胞易于是指微生物生长繁殖的最高温度界限。在此温度下，微生物细胞易于衰老和死亡。微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。例如细胞色素衰老和死亡。微生物所能适应的最高生长温度与其细胞内酶的性质有关。例如细胞色素氧化酶以及各种脱氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关。氧化酶以及各种脱氢酶的最低破坏温度常与该菌的最高生长温度有关。 致死温度致死温度最高生长温度如进一步升高，便可杀死微生物。这种致死微生物的最低温最高生长温度如进一步升高，便可杀死微生物。这种致死微生物的最低温度界限即为致死温度。在一定的温度下处理时间越长，死亡率越高。严格地说，一般应度界限即为致死温度。在

38、一定的温度下处理时间越长，死亡率越高。严格地说，一般应以以10分钟为标准时间。细菌在分钟为标准时间。细菌在10分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度。分钟被完全杀死的最低温度称为致死温度。 微生物类型微生物类型生长温度范围（生长温度范围（）分布的主要处所分布的主要处所最低最低最适最适最高最高低温低温型型专性嗜冷专性嗜冷125 1515 20两极地区两极地区兼性嗜冷兼性嗜冷5 010 2025 30海水及冷藏食品上海水及冷藏食品上中温中温型型室温室温10 2020 3535 4040 45腐生菌腐生菌体温体温寄生菌寄生菌高温型高温型25 4550 6070 95温泉、堆肥、土壤表层等温泉、堆肥、土

39、壤表层等不同类型微生物生长温度范围不同类型微生物生长温度范围1、低温型的微生物、低温型的微生物 又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。常见的产碱杆菌属、假单胞菌属、黄杆又称嗜冷微生物，可在较低的温度下生长。常见的产碱杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、微球菌属等常使冷藏食品腐败变质。有些肉类上的霉菌在零下菌属、微球菌属等常使冷藏食品腐败变质。有些肉类上的霉菌在零下10仍能生长，如仍能生长，如芽枝霉；荧光极毛菌可在零下芽枝霉；荧光极毛菌可在零下4生长，并造成冷冻食品变质腐败。生长，并造成冷冻食品变质腐败。耐冷微生物比嗜冷微生物分布广泛得多。可以从温带环境的土壤、水中、肉类、奶类制耐冷微生物比嗜冷微生物

40、分布广泛得多。可以从温带环境的土壤、水中、肉类、奶类制品及储藏在冰箱中的苹果汁、蔬菜中分离到。耐冷性的微生物在品及储藏在冰箱中的苹果汁、蔬菜中分离到。耐冷性的微生物在2040之间能很好地生之间能很好地生长。长。嗜冷的分子机制嗜冷的分子机制 嗜冷微生物产生的酶，一般在寒冷条件下酶活最大，在非常温和的温度下，这些酶嗜冷微生物产生的酶，一般在寒冷条件下酶活最大，在非常温和的温度下，这些酶经常就会变性或失活。嗜冷微生物与嗜温微生物比较，就是在低温下能够进行主动运输，经常就会变性或失活。嗜冷微生物与嗜温微生物比较，就是在低温下能够进行主动运输，也就意味着嗜冷微生物的原生质膜构造不同于一般的微生物，即使在

41、低温下也不能抑制也就意味着嗜冷微生物的原生质膜构造不同于一般的微生物，即使在低温下也不能抑制膜现象发生。对嗜冷微生物细胞质膜组成成分研究表明，它们含有较高含量的不饱和脂膜现象发生。对嗜冷微生物细胞质膜组成成分研究表明，它们含有较高含量的不饱和脂肪酸，这些不饱和脂肪酸在低温下也能保持半流动状态。某些嗜冷菌的膜脂类组成中也肪酸，这些不饱和脂肪酸在低温下也能保持半流动状态。某些嗜冷菌的膜脂类组成中也含有聚不饱和脂肪酸和含有多个双键的碳氢化合物。现在已经从几种生存于南极的细菌含有聚不饱和脂肪酸和含有多个双键的碳氢化合物。现在已经从几种生存于南极的细菌脂类组分中鉴别出了含有脂类组分中鉴别出了含有9个双键

42、的碳氢化合物。个双键的碳氢化合物。在在0以下，菌体内的水分冻结，生化反应无法进行而停止生长。有些微生物在冰点下就以下，菌体内的水分冻结，生化反应无法进行而停止生长。有些微生物在冰点下就会死亡，主要原因是细胞内水分变成了冰晶，造成细胞脱水或细胞膜的物理损伤。因此，会死亡，主要原因是细胞内水分变成了冰晶，造成细胞脱水或细胞膜的物理损伤。因此，生产上常用低温保藏食品，各种食品的保藏温度不同，分为寒冷温度、冷藏温度和冻藏生产上常用低温保藏食品，各种食品的保藏温度不同，分为寒冷温度、冷藏温度和冻藏温度。温度。2、中温型的微生物、中温型的微生物 绝大多数微生物属于这一类。最适生长温度在绝大多数微生物属于这

43、一类。最适生长温度在20 40之间，最低生长温度之间，最低生长温度10 20，最高生长温度，最高生长温度40 45。它们又可分为嗜室温和嗜体温性微生物。嗜。它们又可分为嗜室温和嗜体温性微生物。嗜体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限温度范围在体温性微生物多为人及温血动物的病原菌，它们生长的极限温度范围在10 45，最适生长温度与其宿主体温相近，在最适生长温度与其宿主体温相近，在35 40之间，人体寄生菌为之间，人体寄生菌为37左右。引左右。引起人和动物疾病的病原微生物、发酵工业应用的微生物菌种以及导致食品原料和起人和动物疾病的病原微生物、发酵工业应用的微生物菌种以及导致食品原料和

44、成品腐败变质的微生物，都属于这一类群的微生物。因此，它与食品工业的关系成品腐败变质的微生物，都属于这一类群的微生物。因此，它与食品工业的关系密切。密切。3、高温型微生物、高温型微生物 它们适于在它们适于在45 50以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限于某些地以上的温度中生长，在自然界中的分布仅局限于某些地区，如温泉、日照充足的土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机物中，如堆肥中区，如温泉、日照充足的土壤表层、堆肥、发酵饲料等腐烂有机物中，如堆肥中温度可达温度可达60 70。能在。能在5570中生长的微生物有芽孢杆菌属（中生长的微生物有芽孢杆菌属（Bacillus）、）、梭状芽孢杆菌（梭状芽孢杆

45、菌（Clostridium）、嗜热脂肪芽孢杆菌（）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bac. stearothermophilus）高）高温放线菌属（温放线菌属（Thermoactinomyces）、甲烷杆菌属（）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）等；温）等；温泉中的细菌；其次是链球菌属和乳杆菌属。有的可在近于泉中的细菌；其次是链球菌属和乳杆菌属。有的可在近于100的高温中生长。的高温中生长。这类高温型的微生物，给罐头工业、发酵工业等带来了一定难度。这类高温型的微生物，给罐头工业、发酵工业等带来了一定难度。嗜热的分子机制嗜热的分子机制 嗜热微生物和嗜高温微生物为什么能在那么高的温度下生长？也与

46、这些生物中的酶嗜热微生物和嗜高温微生物为什么能在那么高的温度下生长？也与这些生物中的酶和蛋白质有关，它们具有耐热性及高温下的稳定性。研究嗜热微生物中的酶发现，它们和蛋白质有关，它们具有耐热性及高温下的稳定性。研究嗜热微生物中的酶发现，它们的氨基酸序列与嗜温微生物中催化相同反应的酶的氨基酸序列一般只有很小的差别，很的氨基酸序列与嗜温微生物中催化相同反应的酶的氨基酸序列一般只有很小的差别，很明显，是一个关键的氨基酸代替了存在于此酶中一个或几个氨基酸，明显，是一个关键的氨基酸代替了存在于此酶中一个或几个氨基酸，导致该酶折叠的方导致该酶折叠的方式不同式不同，从而使该酶能耐热性增强。，从而使该酶能耐热性

47、增强。 同时高温型微生物的蛋白质合成机构同时高温型微生物的蛋白质合成机构核糖体和其他成分对高温抗性也较大，发现核糖体和其他成分对高温抗性也较大，发现tRNA在特定的碱基对区域内含有较多的在特定的碱基对区域内含有较多的GC对，提供了较多的氢键，增加了热稳定性；对，提供了较多的氢键，增加了热稳定性；细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键，因此可保持在细胞膜中饱和脂肪酸含量高，它比不饱和脂肪酸可以形成更强的疏水键，因此可保持在高温下的稳定性并具正常功能。高温下的稳定性并具正常功能。4、热对微生物的致死作用、热对微生物的致死作用 高温致死的机理高温致死的机理 菌体蛋白变性，同时

48、破坏了酶的结构，酶的活性消失了，代谢也就停止了。菌体蛋白变性，同时破坏了酶的结构，酶的活性消失了，代谢也就停止了。微生物耐热性的几个数值微生物耐热性的几个数值（1）热（力致）死时间（）热（力致）死时间（Thermal Death Time TDT） 指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间，称热力致死指在特定的条件和特定的温度下，杀死一定数量微生物所需要的时间，称热力致死时间。时间。（2） D值（值（Decimal reduction time） 在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即在一定温度下加热，活菌数减少一个对数周期（即90%的活菌被杀死）时，所需要的的活菌被

49、杀死）时，所需要的时间（分），即为时间（分），即为D值。测定值。测定D值时的加热温度，即在值时的加热温度，即在D的右下角表明。例如：含菌数为的右下角表明。例如：含菌数为105 /毫升的菌悬液，在毫升的菌悬液，在100的水浴温度中，活菌数降低至的水浴温度中，活菌数降低至104/毫升时，所需时间为毫升时，所需时间为10分，分，该菌的该菌的D值即为值即为10分，即分，即D100=10分。如果加热的温度为分。如果加热的温度为121.1（250 ），其），其D常用常用Dr表表示。示。 （3） Z值值 如果在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短如果在加热致死曲线中，时间降低一个对数周期（即缩短90

50、%的加热时间）所需要升的加热时间）所需要升高的温度（高的温度（），这所需要升高的温度数，即为），这所需要升高的温度数，即为Z值。值。 （4） F值值 在一定的基质中，其温度为在一定的基质中，其温度为121.1，加热杀死一定数量微生物所需要的时间（分），加热杀死一定数量微生物所需要的时间（分），即为即为F值。值。残存活细胞数（个）0102030405060106105104103102101D=10分加热时间（分）残存活细胞曲线100105110115120125oC加热时间（分）100101Z=9.3加热致死时间曲线（1） 菌种菌种 不同微生物由于细胞结构和生物学特性不同，对热的抵抗力也不同。

51、一不同微生物由于细胞结构和生物学特性不同，对热的抵抗力也不同。一般的规律是嗜热菌的抗热力大于嗜温菌和嗜冷菌，芽孢大于非芽孢菌，球菌大于非芽般的规律是嗜热菌的抗热力大于嗜温菌和嗜冷菌，芽孢大于非芽孢菌，球菌大于非芽孢杆菌，革兰氏阳性菌大于革兰氏阴性菌，霉菌大于酵母菌，霉菌和酵母的孢子大于孢杆菌，革兰氏阳性菌大于革兰氏阴性菌，霉菌大于酵母菌，霉菌和酵母的孢子大于其菌丝体。细菌的芽孢和霉菌的菌核抗热力特别大。其菌丝体。细菌的芽孢和霉菌的菌核抗热力特别大。（2）菌龄）菌龄 同样的条件下，对数生长期的菌体抗热力较差，而稳定期的老龄细胞较同样的条件下，对数生长期的菌体抗热力较差，而稳定期的老龄细胞较大，老

52、龄的细菌芽孢较幼龄的细菌芽孢抗热力强。大，老龄的细菌芽孢较幼龄的细菌芽孢抗热力强。（3）菌体数量）菌体数量 菌数愈多，抗热力愈强，因加热杀死最后一个微生物所需的时间也菌数愈多，抗热力愈强，因加热杀死最后一个微生物所需的时间也长；另外，微生物群集在一起时，受热致死不是时间而是有先有后，同时菌体能分泌长；另外，微生物群集在一起时，受热致死不是时间而是有先有后，同时菌体能分泌一些有保护作用的蛋白质物质，菌多分泌的保护物质也多，抗热性也就强。一些有保护作用的蛋白质物质，菌多分泌的保护物质也多，抗热性也就强。（4）基质的因素）基质的因素 微生物的抗热力随含水量减少而增大，同一种微生物在干热环境微生物的抗

53、热力随含水量减少而增大，同一种微生物在干热环境中比在湿热环境中抗热力大；基质中的脂肪、糖、蛋白质等物质对微生物有保护作用，中比在湿热环境中抗热力大；基质中的脂肪、糖、蛋白质等物质对微生物有保护作用，微生物的抗热力随这类物质的增多而增大；微生物在微生物的抗热力随这类物质的增多而增大；微生物在pH值范围是值范围是7左右，抗热力最强，左右，抗热力最强，pH值升高或下降都可以减少微生物的抗热力。特别是酸性环境微生物的抗热力减弱值升高或下降都可以减少微生物的抗热力。特别是酸性环境微生物的抗热力减弱更明显。更明显。（5）加热的温度和时间）加热的温度和时间 加热的温度越高，微生物的抗热力越弱，越容易死亡，加

54、加热的温度越高，微生物的抗热力越弱，越容易死亡，加热的时间越长，热致死作用越大。在一定高温范围内，温度越高杀死所需时间越短。热的时间越长，热致死作用越大。在一定高温范围内，温度越高杀死所需时间越短。另外，其他因素如盐类等，在基质中有降低水分活性作用，从而增强抗热力；而另一另外，其他因素如盐类等，在基质中有降低水分活性作用，从而增强抗热力；而另一类盐类如钙盐、镁盐可减弱微生物对热的抵抗力。类盐类如钙盐、镁盐可减弱微生物对热的抵抗力。6、高温灭菌的方法、高温灭菌的方法（1）干热灭菌法：）干热灭菌法： A . 火焰灭菌法：特点：速度快、灭菌彻底、效果好。应用范围：废弃物。火焰灭菌法：特点：速度快、灭

55、菌彻底、效果好。应用范围：废弃物。 B. 干燥加热空气灭菌法：干燥加热空气灭菌法：150-170 ，1-2小时。应用范围：玻璃器皿，金小时。应用范围：玻璃器皿，金属及其他干燥耐热物品的灭菌。玻璃器皿要烘干。属及其他干燥耐热物品的灭菌。玻璃器皿要烘干。（2）湿热灭菌）湿热灭菌(moist heat sterilization) A . 煮沸消毒法煮沸消毒法 ：物品在水中：物品在水中100煮沸煮沸15分钟以上，可杀死细菌的营养细分钟以上，可杀死细菌的营养细胞和部分芽孢，如在水中加入胞和部分芽孢，如在水中加入1%碳酸钠或碳酸钠或25%石炭酸，则效果更好。这种方法石炭酸，则效果更好。这种方法适用于注射

56、器、解剖用具等的消毒。适用于注射器、解剖用具等的消毒。 B. 巴氏灭菌巴氏灭菌 (pasteurization)：灭菌的温度一般在：灭菌的温度一般在6085处理处理1530分钟，分钟，可以杀死微生物的营养细胞，但不能达到完全灭菌的目的，用于不适于高温灭菌可以杀死微生物的营养细胞，但不能达到完全灭菌的目的，用于不适于高温灭菌的食品，如牛乳、酱腌菜类、果汁、啤酒、果酒和蜂蜜等，其主要目的是杀死其的食品，如牛乳、酱腌菜类、果汁、啤酒、果酒和蜂蜜等，其主要目的是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏杆菌），而又不影响它们的风中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏杆菌），而又不影响它们

57、的风味。味。C. 超高温瞬时灭菌法超高温瞬时灭菌法 （Ultra high temperature short time,UHT） 灭菌的温度在灭菌的温度在13513735秒，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽秒，可杀死微生物的营养细胞和耐热性强的芽孢细菌，但污染严重的鲜乳在孢细菌，但污染严重的鲜乳在142以上杀菌效果才好。超高温瞬时灭菌法现广以上杀菌效果才好。超高温瞬时灭菌法现广泛用于各种果汁、牛乳、花生乳、酱油等液态食品的杀菌。泛用于各种果汁、牛乳、花生乳、酱油等液态食品的杀菌。此法的特点是既可杀此法的特点是既可杀灭微生物，又可最大限度减少营养成分的破坏。在发酵工业中此法用作培养基的灭微

58、生物，又可最大限度减少营养成分的破坏。在发酵工业中此法用作培养基的灭菌，主要操作是将培养基在发酵罐外连续地进行加热、维持和冷却，然后才进灭菌，主要操作是将培养基在发酵罐外连续地进行加热、维持和冷却，然后才进入发酵罐，培养基一般在入发酵罐，培养基一般在135140下处理下处理515秒钟。秒钟。D. 高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 (normal autoclaving) 高压蒸汽灭菌法是实验室和罐头工业中常用的灭菌方法。高压蒸汽灭菌是高压蒸汽灭菌法是实验室和罐头工业中常用的灭菌方法。高压蒸汽灭菌是在高压蒸汽锅内进行的，锅有立式和卧式两种，原理相同，锅内蒸汽压力升高时，在高压蒸汽锅内进行的，锅有立式

59、和卧式两种，原理相同，锅内蒸汽压力升高时，温度升高。一般采用温度升高。一般采用9.8104Pa的压力，的压力，121.1处理处理1530分钟，也有采用较低分钟，也有采用较低温度（温度（115）下维持）下维持30分钟左右，可达杀菌目的。罐头工业中要根据食品的种分钟左右，可达杀菌目的。罐头工业中要根据食品的种类和杀菌的对象、罐装量的多少等决定杀菌式。实验室常用于培养基、各种缓冲类和杀菌的对象、罐装量的多少等决定杀菌式。实验室常用于培养基、各种缓冲液、玻璃器皿及工作服等灭菌。液、玻璃器皿及工作服等灭菌。影响高压蒸汽灭菌效果的因素：影响高压蒸汽灭菌效果的因素： 灭菌物体含菌量的影响灭菌物体含菌量的影响

60、 ； 灭菌锅内空气排除程度的影响灭菌锅内空气排除程度的影响 ； 灭菌对象的体积，灭菌对象体积的大小直接影响灭菌的效果，体积过大会影灭菌对象的体积，灭菌对象体积的大小直接影响灭菌的效果，体积过大会影响响 热的传导速率。待灭菌的物体或培养基体积不宜过大，也不不宜在锅内塞得拥热的传导速率。待灭菌的物体或培养基体积不宜过大，也不不宜在锅内塞得拥挤。挤。 灭菌对象灭菌对象PH的影响。当其的影响。当其PH在在6.08.0时，微生物的抵抗力较大，不易死亡；时，微生物的抵抗力较大，不易死亡；PH6.0时，最易引起死亡。时，最易引起死亡。 加热与散热速度加热与散热速度 在高压灭菌时，常常只注意达到灭菌温度后维持