洋葱内表皮细胞骨架的观察

1、LOGO洋葱内表皮细胞骨架的观察洋葱内表皮细胞骨架的观察一、实验目的一、实验目的 1、掌握植物细胞骨架显示的原理及染色方法、掌握植物细胞骨架显示的原理及染色方法. 2、观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构、观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构二、实验原理二、实验原理 细胞骨架（cytoskeleton）是指真核细胞中的纤维蛋白所组成的网络结构。、细胞骨架的概念红：微丝红：微丝 绿：微管绿：微管微管微管主要成分微管蛋白微管主要分布在核周围， 呈放射状向四周扩散 电镜下的微管1.微管蛋白微管蛋白（一）微管的化学组成（一）微管的化学组成微微管管蛋蛋白白 微管蛋白微管蛋白 微管蛋白微管蛋白异二异二聚体聚体

2、2个鸟嘌呤核苷酸个鸟嘌呤核苷酸（GTP)结合位点结合位点。可与秋水仙素、长春可与秋水仙素、长春花碱结合。花碱结合。 微管蛋白微管蛋白 微管蛋白微管蛋白异二异二聚体聚体聚合聚合首位首位相连相连原纤维原纤维微管微管（13） 微丝的形态与组分微丝的形态与组分 形态：形态：是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细是一类由蛋白纤维组成的实心纤维细丝。丝。直径直径 5-7nm，长短不一。，长短不一。 在细胞中，微丝可在细胞中，微丝可成束、成网或纤维状分散分布成束、成网或纤维状分散分布，主要分布与细胞质膜的内侧。 在具有运动功能的细胞中比较发达。在具有运动功能的细胞中比较发达。 微丝微丝化学成分化学成分肌动蛋白肌动

3、蛋白肌动蛋白结合蛋白肌动蛋白结合蛋白 中间丝中间丝 直径介与微管与微丝之间，故得名中间丝直径介与微管与微丝之间，故得名中间丝（中间纤维（中间纤维 IF） 810nm。中间纤维则分布在整个细胞中。 IF结构稳定：既不受秋水仙素也不受细胞结构稳定：既不受秋水仙素也不受细胞松弛松弛B素影响，并且也没有极性。素影响，并且也没有极性。二、实验原理二、实验原理细胞骨架细胞骨架细胞生长、细胞生长、运动运动维持细胞形态维持细胞形态分裂分裂、分化分化 基因表达基因表达能量转换能量转换信息传递信息传递物质运输物质运输细胞骨架的功能细胞骨架的功能微管微管微丝微丝中间丝中间丝 二、实验原理二、实验原理 细胞骨架组成及

4、分类细胞骨架组成及分类根据组根据组成成分成成分及形态及形态结构结构细胞质骨架细胞质骨架细胞骨架细胞骨架细胞膜骨架细胞膜骨架细胞核骨架细胞核骨架细胞外基质细胞外基质细胞质骨架细胞质骨架广义广义狭义狭义二、实验原理二、实验原理 细胞骨架观察方法细胞骨架观察方法 电镜电镜组织化学组织化学间接免疫荧光间接免疫荧光 酶标酶标观察方法观察方法二、实验原理二、实验原理 试剂选用原因试剂选用原因1Triton X-100可可溶解抽提细胞中溶解抽提细胞中的蛋白质和脂质，的蛋白质和脂质，但不破坏细胞骨但不破坏细胞骨架系统，因此显架系统，因此显得更清晰得更清晰3M-缓冲液缓冲液洗涤洗涤细胞，可以提高细胞，可以提高骨

5、架稳定性骨架稳定性2戊二醛戊二醛固定能较固定能较好保存骨架成分、好保存骨架成分、考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色，使骨架蛋染色，使骨架蛋白着色，胞质背白着色，胞质背景着色弱，有利景着色弱，有利于骨架显示于骨架显示 注意微丝微管和中间丝都是直径很小的结构，最大的单根微丝微管和中间丝都是直径很小的结构，最大的单根微管才微管才25nm左右，只能在电镜下观察。左右，只能在电镜下观察。 本实验用普通光镜是本实验用普通光镜是因为骨架纤维成束分布，染色后有夸大作用。由于细胞经抽提因为骨架纤维成束分布，染色后有夸大作用。由于细胞经抽提后剩下的主要是细胞骨架，使之显现更清晰。后剩下的主要是细胞骨架，使之显现更清

6、晰。M缓冲液缓冲液 M缓冲液使细胞骨架中的微丝保持稳定。在M缓冲液中，其中咪唑是缓冲剂EGTA 和EDTA螯合 Ca离子，溶液并提供Mg离子，在低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚) 是一种非离子型表面活性剂（或称去污剂）。分子量为646.86（C34H62O11）。它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。非离子型表面活性剂它在水溶液中不产生离子的一种表面活性剂。它在水中的溶解是由于它具有对水亲和力很强的官能团。表面活性剂表面活性剂分子结构具有两亲性： 一端为亲水基团，另一端为疏水 基团。溶解于水中以后，表面活 性剂能降低水的表

7、面张力，并提 高有机化合物的可溶性。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G-250考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。3%-戊二醛戊二醛 作为一种有机交联剂 戊二醛在一定条件下能将单体、线型高分子或预聚物转变成三维网状结构的物质。 戊二醛在1%浓度时，交联度已达到很高的程度，在此浓度以下，随浓度下降，交联度下降，溶胀度和降解率增加。浓度超过1%时，各指标无明显变化。 交联剂是一种能在线型分子间起架桥作用，从而使多个线型分子相互键合交联成网状结构的物质。促进或调节聚合物分子链间共价键或离子键形成的物质。三、实验用品三、实验用

8、品1、材料、材料2、器材、器材3、试剂、试剂洋洋葱葱鳞鳞茎茎显微镜、小显微镜、小烧杯、滴管、烧杯、滴管、载玻片、盖载玻片、盖玻片、镊子玻片、镊子 M-缓冲液缓冲液 6mmol/L磷酸缓冲磷酸缓冲液液 1% Triton X-100 0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝 R250 3%戊二醛戊二醛3.0%3.0%戊二醛：用戊二醛：用0.2mol/L0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制磷酸盐缓冲液配制 0.2考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250：甲醇：甲醇46.5ml，冰乙酸，冰乙酸7ml，蒸馏水，蒸馏水46.5ml三、实验用品三、实验用品 4 4、试剂配制、试剂配制1% Triton X-100：一般配成：一般配成

9、30%储备液，通储备液，通 常常Triton X-100与与M-缓冲液以所需比例混合置于缓冲液以所需比例混合置于30-40 水浴水浴2-3小时，以便液体充分混匀。使小时，以便液体充分混匀。使用时将用时将30%储备液临时稀释成储备液临时稀释成1%。 M-缓冲液四、实验方法四、实验方法1、撕取、撕取2、抽提、抽提3、冲洗、冲洗4、固定、固定吸去缓冲液，用吸去缓冲液，用1%TritonX-100 处理洋葱处理洋葱表皮表皮25 min。3戊二醛固定戊二醛固定30min撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约撕取洋葱鳞茎内表皮细胞约1cm2大小若大小若干片，置于磷酸缓冲液的培养皿中，使其干片，置于磷酸缓冲液的培养皿中，使其下沉，（下沉，（12min)吸去吸去Triton Xl00，用，用M一缓冲液洗一缓冲液洗3次，次，每次每次5分钟分钟四、实验方法四、实验方法5、冲洗、冲洗6、染色、染色7、制片、制片8、观察、观察PH6.8磷酸磷酸缓冲液洗缓冲液洗3次，每次次，每次5分钟分钟用用