大小型层析柱的装填实践介绍(中文)

1、 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHA. Sprauer 5/06TOYOPEARL树脂填料树脂填料大小型工业制备色谱柱的装填实践大小型工业制备色谱柱的装填实践 GtecPallGE HealthcarePall-Euroflow / Resolute TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHTOYOPEARL树脂填料的装填树脂填料的装填 装填前的准备工作装填前的准备工作 小颗粒的去除小颗粒的去除 缓冲液平衡缓冲液平衡 匀浆准备匀浆准备 装填步骤装填步骤 / 层析柱类型层析柱类型 层析柱的操作层析柱的

2、操作 柱子的平衡与柱效评价柱子的平衡与柱效评价 保存保存内容提要内容提要Peak Biotech TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH装填的一般原则装填的一般原则TOYOPEARL的装填压力最好在的装填压力最好在0.5 - 5 bar的范围内的范围内装填流速至少比实际操作流速高装填流速至少比实际操作流速高50%不要使用会产生剪切力的装置不要使用会产生剪切力的装置（如：磁力搅拌器、（如：磁力搅拌器、 齿轮泵）齿轮泵） - 这些装置会磨碎树脂填料并产生小颗粒这些装置会磨碎树脂填料并产生小颗粒 TOYOPEARL是一种刚性强的树脂填料，装填时务必是一种

3、刚性强的树脂填料，装填时务必区别于一般的软式琼脂糖凝胶区别于一般的软式琼脂糖凝胶 Superformance / GtecTOYOPEARL树脂填料的装填树脂填料的装填 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH基本步骤基本步骤去除小颗粒去除小颗粒装填缓冲液平衡装填缓冲液平衡匀浆准备匀浆准备装柱装柱TOYOPEARL出货时为悬出货时为悬浮液状态（含浮液状态（含20%乙醇）乙醇）TOYOPEARL树脂填料的装填树脂填料的装填 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH装柱前务必进行小颗粒去除的操作装柱前务必进行小

4、颗粒去除的操作! 小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大小颗粒的存在会阻塞筛板或烧结板，并最终会导致整个柱子的压降增大 小颗粒的去除采取悬浮静置移注法小颗粒的去除采取悬浮静置移注法 重复这一步骤不少于重复这一步骤不少于3次次借助显微镜可检借助显微镜可检查小颗粒的存在查小颗粒的存在小颗粒的去除小颗粒的去除 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHTOYOPEARL 粒径粒径Coarse C级规格: 100 mMedium M级规格: 65 mFine F级规格: 45 mSuperfine S级规格: 35 m水中静置时间水中静

5、置时间15-30 Min.30-45 Min.45-60 Min.60-90 Min.Amicon Moduline-120cm ID显微镜微观显示 Toyopearl 650 MTOYOPEARL的静置时间的静置时间 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液进行填料的在去除小颗粒时的最后一次步骤中可加入装填缓冲液进行填料的平衡平衡 最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取合适的装填缓冲溶液最好根据实际生产中所使用的缓冲液选取合适的装填缓冲溶液 一般来讲，分离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是一般来

6、讲，分离纯化工艺中将使用到的最高离子强度的流动相是装填缓冲液的首选装填缓冲液的首选这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽这一操作可以将填料装得最为紧密，并且可以防止死体积的发生或胶体内沟槽的出现。的出现。装填缓冲液的平衡装填缓冲液的平衡 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHTOYOPEARL-典型的装填缓冲溶液典型的装填缓冲溶液 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 利用量筒测量静置胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼利用量筒测量静置胶体体积或使用水泵抽滤浆液至湿滤饼后计

7、算装填所需要的填料体积后计算装填所需要的填料体积 通过添加装填缓冲液调节浆液浓度通过添加装填缓冲液调节浆液浓度:-流动式装填柱流动式装填柱 40 - 70% (v/v) -自动装填柱自动装填柱 20 - 60% (v/v) 最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静置体积或抽最终装填好的柱床体积是要小于装填前胶体静置体积或抽干的湿滤饼的体积干的湿滤饼的体积Slurry preparation in the columnSlurry preparation in a separate tankSettling resinAmicon Moduline-120cm ID匀浆准备匀浆准备 TOSOH

8、BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHToyopearlHW-40, HW-50, HW-55HW-65 and HW-75FEther-650, Phenyl-650Butyl-650, DEAE-650Super-Q-650, CM-650SP-650 and all AffinityQAE-550C and SP-550C使用约使用约1.1倍柱体积的静置胶倍柱体积的静置胶使用约使用约1.2倍柱体积的静置胶倍柱体积的静置胶使用约使用约1.25-1.4倍柱体积的静置胶倍柱体积的静置胶对于给定的柱子，装柱所需的静置胶体积对于给定的柱子，装柱所需的静置胶体积 T

9、OSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHo 恒流速装填法恒流速装填法o 恒压装填法恒压装填法o 辅助的重力沉降装填法辅助的重力沉降装填法不同装填方法的特点不同装填方法的特点装填方法装填方法 恒流速恒流速 恒压恒压 重力沉降重力沉降 装填速度装填速度 快快快快 慢慢流速范围流速范围 可增大至较高可增大至较高 可增大至较高可增大至较高 只能慢操作只能慢操作重复性重复性 很好很好很好很好 好好泵泵恒速恒速 恒压恒压 蠕动泵蠕动泵压力计压力计 需要需要需要需要 不需要不需要主要装填方法主要装填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOS

10、CIENCE GmbH方法简介方法简介: 将柱底筛板用装填缓冲液润湿（赶走气泡）将柱底筛板用装填缓冲液润湿（赶走气泡） 任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作任何时候，均需确保浆液在注入层析柱前进行过匀浆操作 匀浆液倒入后，立刻将分配器置于储槽内浆液表面匀浆液倒入后，立刻将分配器置于储槽内浆液表面 分配器与溶液浆液间不应有气泡存在分配器与溶液浆液间不应有气泡存在 阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动阶段性调整装填流速至目标流速，以产生一个实时的、没有太大振动的栓塞流的栓塞流 在最初的压实操作基础上，为进一步压实柱床，至少泵入在最初的压实操作基础上，为进一步压

11、实柱床，至少泵入5-10倍柱体倍柱体积的装填缓冲液积的装填缓冲液 调整分配器至胶体表面调整分配器至胶体表面 重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床重复后两个步骤，直至柱床被彻底压实。最后将分配器移至距离柱床2-5 mm 处（最后一次）。不要担心使用分配器的同时进行柱床的压处（最后一次）。不要担心使用分配器的同时进行柱床的压实操作！实操作！MilliporeQuik ScaleFlow Packed Columns (Millipore-QuikScale+Moduline, GE Healthcare-BPG, Gtec-Superformance, BioRad-Gel

12、tec, etc.)恒流速装填方法恒流速装填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH模式填料类型柱尺寸cm ID x L填料等级装填流速cm/h操作流速 cm/hSECHW-40HW-50HW-55HW-65HW-752,2 x 602,2 x 602,2 x 602,2 x 602,2 x 60S (30 um)F (45 um)C (75 um)S (30 um)F (45 um)S (30 um)F (45 um)S (30 um)F (45 um)F (45 um)30 4060 80120 16025 3550 7025 3550 7

13、020 7540 15040 15010 2525 5050 10010 2025 3510 2025 3510 1515 3015 30IECDEAE-650, SuperQ-650CM-650, SP-650SP-550, QAE-550MegaCap II SP-5502,2 x 202,2 x 202,2 x 20S (35 um)M (65 um)C (100 um)C (100 um)EC (100-300 um)400 600800 1000800 1200700 1000800 120045 6580 13080 60080 24080 500HICEther-650, Phe

14、nyl-650, Butyl-650 PPG-600, Butyl-600SuperButy-550, Hexyl-5502,2 x 202,2 x 202,2 x 20S (35 um)M (65 um)C (100 um)M (65 um)C (100 um)400 600800 1000800 1200800 1000800 120045 6580 13080 50080 13080 500AFCAF-Amino-650, AF-Carboxy-650AF-Formyl-650, AF-Epoxy-650AF-Tresyl-650, AF-Chelate-650, AF-Blue HC-

15、650, AF-Heparin-HC-650AF-Red-6502,2 x 10M (65 um)800 100030 130实验室规模最优化的装填及柱操作流速实验室规模最优化的装填及柱操作流速 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH柱尺寸(I.D. x L)2.2 cm x 60 cm9 cm x 30 cm25 cm x 30 cm填料类型HW-55SQAE-550CDEAE-650M目标流速 (ml/min)23002000增加量(ml/min) 0.5 50 500 保持时间(min) 0.5 2 2 恒流速装填法中流速的增加量举例：恒流速

16、装填法中流速的增加量举例：恒流速装填方法恒流速装填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHGtec/Superformance 20cm ID Column气泡会由于切换阀、管路连接处、 活塞运动、未脱气缓冲液而引起.恒流速装填方法恒流速装填方法- 扰动扰动（由入口处筛板下气泡而引起的）（由入口处筛板下气泡而引起的） TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH装填装填运行运行管路清洗管路清洗卸料卸料Horizontal Flow - “Self Packer” - preset column volum

17、e(Pall/Euroflow-ResoluteTM, Millipore-IsoPakTM, GE Healthcare-Chromaflow, Eastern River)优点：易于装填优点：易于装填弱点：填料用量较大弱点：填料用量较大, 卸料可能较难卸料可能较难, 有剪切力发生有剪切力发生, 卸料会导致大量的浆液体积卸料会导致大量的浆液体积Resolute恒压装填方法恒压装填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHRadial Flow - “Self Packer” - preset column volume (Proxcys-CRI

18、O)oLow space requirements only 0,51 m2; even 600 liter BV is mounted on wheelsoLarge inlet surface area cotrolled & gentle product application (“Natural Distribution”).oThin frit keeps the resin together it is not used as flow distributor a barrier of only 60um negligible influence on pressure g

19、eneration Identical pathlength for all substances A-ECRIO 601S5 liter BVCRIO - Colonne Radiale InOxidable恒压装填方法恒压装填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHDynamic Axial Compression (Novasep, Peak Biotech, Technikrom, GE Healthcare)UnpackingPneumatic/HydraulicSlurry transfer优点：装填操作简单，非常快优点：装填操作简

20、单，非常快缺点：卸料会导致大量的浆液体积缺点：卸料会导致大量的浆液体积(while column is assembled) ；不易操；不易操作作g (while disassembling the column), 卸料缓慢卸料缓慢Peak Biotech/Dan Process - DAC恒压或恒流速装填方法恒压或恒流速装填方法 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 不要使用没有进行正确柱效评价的层析柱不要使用没有进行正确柱效评价的层析柱! SEC、RPC及及HIC型层析柱的柱效与装填质量密型层析柱的柱效与装填质量密切相关的。切相关的。 只有

21、只有IEC和和AFC型层析柱，在没有高塔板数时也能型层析柱，在没有高塔板数时也能正常工作。尽管如此，对称性因子还是相当重要正常工作。尽管如此，对称性因子还是相当重要的。的。层析柱操作层析柱操作 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH 使用使用5-10倍柱体积的低离子强度缓冲液进行柱子的平衡倍柱体积的低离子强度缓冲液进行柱子的平衡 使用低分子量、无保留的化合物进行柱效的测定（如：丙酮、盐）使用低分子量、无保留的化合物进行柱效的测定（如：丙酮、盐） 进样体积为柱体积的进样体积为柱体积的0.25 - 1% 将测定而得的塔板数、不对称性因子与厂家提供的最小

22、值相比较将测定而得的塔板数、不对称性因子与厂家提供的最小值相比较 如果未达到最小塔板数等期望值，必须重新进行柱子的装填！如果未达到最小塔板数等期望值，必须重新进行柱子的装填！可供选择的方法可供选择的方法: 使用高离子强度的装填缓冲液，使用低盐溶液或水进样，使用高离子强度的装填缓冲液，使用低盐溶液或水进样，会产生一个负的电导信号会产生一个负的电导信号/倒峰（不需要平衡、节省时间等）倒峰（不需要平衡、节省时间等）柱效评价柱效评价 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHN = plates per columnVe = elution volume cm

23、 or mlW1/2 = width of the peak at half peak height cm or mlSymmetry:Distance b / a = peak width at 10% peak height cm or mlInjectionab1/10 hhhVe1/2 hW1/2N = 5.54 (Ve /W1/2 )2结果与下列因素有关结果与下列因素有关:- 评价操作（因人而异）评价操作（因人而异）- 进样的可重复性（硬件影响）进样的可重复性（硬件影响） - 流速流速- 进样样品的分子尺寸进样样品的分子尺寸柱效与不对称性因子的计算柱效与不对称性因子的计算 TOSOH

24、 BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH样品：丙酮样品：丙酮Pall Resolute 400TOYOPEARL填料装填柱的最小柱效值填料装填柱的最小柱效值 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH理想的峰形理想的峰形 (Gau) 与非理想的峰形与非理想的峰形Gau 前沿前沿/前伸峰前伸峰 拖尾峰拖尾峰 柱效评价柱效评价 峰形峰形 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbH前沿峰的处理前沿峰的处理 提高浆液浓度提高浆液浓度 降低装填压力降低装填压力 缩短静置时间缩短静置时间

25、(在柱中在柱中)拖尾峰的处理拖尾峰的处理 与前沿峰的处理方法相反与前沿峰的处理方法相反低柱效的处理低柱效的处理 去除小颗粒去除小颗粒 重新平衡胶体重新平衡胶体 改变样品改变样品/样品缓冲液样品缓冲液 检查检测器检查检测器/泵泵Pall - Resolute柱效评价柱效评价 常见问题及处理常见问题及处理 TOSOH BIOSCIENCE GmbHTOSOH BIOSCIENCE GmbHII流动式装填中出现沟槽流动式装填中出现沟槽/管路管路柱床发生塌陷柱床发生塌陷IBPG 20cm ID Column / Toyopearl DEAE-650MResolute 40cm ID Column / Toyopearl Butyl-650M2-3 cm length- not criticalChannels 5 cm length - critical !处理方法：柱子的最大耐压为处理方法：柱子的最大耐压为3 bar - 更换耐压较高的柱子（如：更换耐压较高的柱子（如： 7 bar ）