第02章：蛋白质化学

1、第二章第二章 蛋白质化学蛋白质化学w氨基酸氨基酸w蛋白质通论蛋白质通论w蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构w蛋白质的空间构象蛋白质的空间构象w蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系w蛋白质的性质及应用蛋白质的性质及应用w蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化蛋白质及多肽可以被酸、碱、酶水解。蛋白质及多肽可以被酸、碱、酶水解。AA是蛋白质的基本结构单元是蛋白质的基本结构单元。大多数的蛋白质都是由大多数的蛋白质都是由20种种AA组成，组成，它们被称为标准氨基酸或基本氨基酸。它们被称为标准氨基酸或基本氨基酸。第一节第一节 氨基酸（氨基酸（Amino Acid）一、氨基酸的化学结构特点一、氨基酸的化学结

2、构特点w除除Pro外，其余均为外，其余均为-氨基酸。氨基酸。 不变部分不变部分可变部分可变部分二、氨基酸的分类二、氨基酸的分类1、根据、根据是否组成蛋白质是否组成蛋白质来分：来分： 蛋白质中的常见蛋白质中的常见AA（标准标准AA） 蛋白质中的稀有蛋白质中的稀有AA 非蛋白非蛋白AA非标准非标准AA标准标准AA-非极性、脂肪族侧链非极性、脂肪族侧链AA标准标准AA-芳香族侧链芳香族侧链AA标准标准AA-极性、不带电荷侧链极性、不带电荷侧链AA标准标准AA-极性、带负电荷侧链极性、带负电荷侧链AA标准标准AA-极性、带正电荷侧链极性、带正电荷侧链AA按按R基极性分类基极性分类20种标准氨基酸种标准

3、氨基酸1）非极性）非极性：8种种 Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp2）极性不带电荷）极性不带电荷：7种种 Ser、Thr、Cys、Pro、Asn、Gln、Tyr 3）极性带负电荷）极性带负电荷：2种种 Asp、Glu4）极性带正电荷）极性带正电荷：3种种 Lys、Arg、His稀有氨基酸稀有氨基酸w仅在仅在少数少数蛋白质中存在的氨基酸蛋白质中存在的氨基酸w均均由相应的标准氨基酸衍生而来由相应的标准氨基酸衍生而来NHHOCOOH4-羟基脯氨酸H2NCH2CHCH2CH2CHCOOHOHNH25-羟基赖氨酸NH2CH3NHCH2CHCH2CH2CHCOOH6-N-甲基

4、赖氨酸HOIICH2CHCOOHNH23,5-二碘酪氨酸 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸w目前已经发现目前已经发现150余种。余种。w分布广泛，但分布广泛，但不存在不存在于蛋白质中于蛋白质中，大部分大部分是标准是标准AA的衍生物。的衍生物。存在意义：存在意义：w重要代谢物的前体：重要代谢物的前体：鸟氨酸鸟氨酸、瓜氨酸瓜氨酸w生长调节：生长调节： -丙氨酸丙氨酸w细菌细胞壁组分：细菌细胞壁组分：D-Glu、D-Alaw神经传导：神经传导： -氨基丁酸氨基丁酸wN素转运和贮藏：刀豆氨酸素转运和贮藏：刀豆氨酸w杀虫防御：杀虫防御：D-环丝氨酸环丝氨酸绝大部分非蛋绝大部分非蛋白白AA的功能尚的功能尚不明

5、确不明确w必需氨基酸必需氨基酸：人和非反刍动物体内不能合：人和非反刍动物体内不能合成，需要从食物中获取的氨基酸成，需要从食物中获取的氨基酸 。 Ile Met Val Leu Trp Phe Thr Lys 一一 家家 借借 两两 三三 本本 书书 来来2、从、从营养学角度营养学角度分：分： 必需氨基酸和非必需氨基酸必需氨基酸和非必需氨基酸w豆腐里的豆腐里的Met含量较少，但鱼里含量丰含量较少，但鱼里含量丰富；鱼里的富；鱼里的Phe含量较少，但豆腐里含量含量较少，但豆腐里含量丰富。丰富。二者混合食用可提高营养价值二者混合食用可提高营养价值；w鱼含有丰富的鱼含有丰富的VD，可帮助吸收豆腐里丰，可

6、帮助吸收豆腐里丰富的富的Ca。炖鱼时加块豆腐？炖鱼时加块豆腐？（一）酸碱性质（一）酸碱性质1、氨基酸的两性解离、氨基酸的两性解离w在不同的溶液在不同的溶液pH条件下，条件下，AA表现出不表现出不同的解离状态。同的解离状态。 三、氨基酸的重要性质三、氨基酸的重要性质2、氨基酸的等电点及计算、氨基酸的等电点及计算w定义定义：令：令Aa分子的正负电荷数目相等，净电荷分子的正负电荷数目相等，净电荷为为0时的溶液时的溶液pH值，简称值，简称pI。w侧链不含解离基团的侧链不含解离基团的中性中性AA，其等电点为：其等电点为：pI = (pK1+ pK2 )/2 w侧链含有可解离基团的侧链含有可解离基团的AA

7、，其其pI值取决于值取决于两两性离子两侧的性离子两侧的pK值值。 碱性碱性AA：pI = (pKR+ pK2 )/2 酸性酸性AA：pI = (pK1+ pKR )/2 碱性碱性Aa的两性解离的两性解离酸性酸性Aa的两性解离的两性解离3、等电点的应用：、等电点的应用： w等电点时，等电点时，Aa的的溶解度最小溶解度最小-Aa的的分离；分离；wAa的带电性质的带电性质-电泳法电泳法/离子交换法离子交换法分离混合分离混合Aa。w问题问题：等电点分别为：等电点分别为3.0、6.5、10.0的三的三种氨基酸处于种氨基酸处于pH6.5的缓冲液环境中电的缓冲液环境中电泳，请问它们将如何运动？泳，请问它们将

8、如何运动？w回答回答：pI 3.0的氨基酸将移动向正极，的氨基酸将移动向正极，pI 6.5的氨基酸将保持不动，的氨基酸将保持不动，pI 10.0的氨基的氨基酸将移动向负极。酸将移动向负极。1、与、与2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）的反应的反应O2NFNO2+ H2N CH CROHN CH CROO2NNO2H+H2OO2NNO2HN CH CROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸（二）氨基酸的重要化学反应（二）氨基酸的重要化学反应（乙醚抽提）（乙醚抽提）Sanger反应反应应用：应用：w鉴定游离鉴定游离AA；w鉴定多肽或蛋白质的鉴定多肽或蛋白质的N端端AAN

9、CSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR12、与异硫氰酸苯酯（、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应的反应 Edman反应反应 应用：应用：w鉴定游离鉴定游离AA；w鉴定多肽或蛋白质的鉴定多肽或蛋白质的N端端AA；w短肽中短肽中AA顺序分析顺序分析-多肽自动分析多肽自动分析仪（仪（50Aa）的工作原理的工作原理3、与茚三酮的反应、与茚三酮的反应 20种标准种标准Aa均可以与茚三酮反应；均可以与茚三酮反应； 多数多数Aa + 茚三酮茚三酮 蓝紫色蓝紫色物质；物质； Pro + 茚三酮茚三酮 黄色黄色

10、物质（物质（亚亚氨基酸不氨基酸不释放释放NH3） 应用应用：比色分析，测定含量：比色分析，测定含量 层析分离的显色剂层析分离的显色剂w除除Gly外，所有外，所有-氨基酸中的氨基酸中的C都为都为手性手性碳原子碳原子，具有旋光性，具有旋光性 （+，-）和光学异构）和光学异构体（体（D-，L-）；）；w比旋光度是比旋光度是AA的重要物理常数之一，是的重要物理常数之一，是鉴别各种鉴别各种AA的重要依据。的重要依据。 （三）氨基酸的旋光性与构型（三）氨基酸的旋光性与构型w 蛋白质中的蛋白质中的AA通常为通常为L-AA。（四）氨基酸的紫外光谱性质（四）氨基酸的紫外光谱性质在在近紫外区近紫外区(220-30

11、0nm) ，20种种Aa中中只有只有Phe、Tyr、Trp有光吸收的能力。有光吸收的能力。 max280nm蛋白质：蛋白质：Protein（第一重要第一重要）第二节第二节 蛋白质通论蛋白质通论一、蛋白质的生物学功能一、蛋白质的生物学功能w催化催化（最重要）（最重要） ：酶：酶w结构结构：如角：如角、胶原、胶原、膜、膜 （最重要）（最重要） w运输运输：如血红：如血红、血清、血清；膜转运；膜转运w运动运动：如肌动：如肌动、肌球、肌球；微管；微管w保护保护：如抗体；抗冻：如抗体；抗冻；溶血；溶血w储存储存：如卵清：如卵清；酪；酪；谷；谷w调节调节：如激素；参与基因表达调控的蛋白：如激素；参与基因表

12、达调控的蛋白w为什么人体细胞会为什么人体细胞会有不同的形状呢？有不同的形状呢？w细胞内有支撑体细胞内有支撑体-丝网状丝网状骨架蛋白骨架蛋白（决定细胞形状及（决定细胞形状及运动）；运动）；w毛发毛发-角蛋白角蛋白w骨骼、牙齿、皮骨骼、牙齿、皮肤肤-胶原蛋白胶原蛋白结构蛋白均为结构蛋白均为纤维状纤维状w口、胃、肠口、胃、肠消消化酶化酶（胞外）（胞外）w血管血管抗体抗体（免（免疫球蛋白疫球蛋白）、）、激激素素巨噬细胞巨噬细胞功能蛋白大多为功能蛋白大多为球状球状综上所述综上所述：w蛋白质是构成生物体最基本的蛋白质是构成生物体最基本的结构物质结构物质和和功能物质功能物质。w蛋白质是生命活动的蛋白质是生命

13、活动的物质基础物质基础，几乎参，几乎参与所有的生命活动过程与所有的生命活动过程。二、蛋白质的元素组成二、蛋白质的元素组成 含氮含氮有机化合物有机化合物w 碳碳 50-55%w 氢氢 6.5-7.3w 氧氧 19-24w 氮氮 16%w 硫硫 0-3w 其他（其他（P、Fe、I、Mo、Zn、Cu） 微量微量蛋白质含量的测定蛋白质含量的测定v凯氏定氮法凯氏定氮法：根据生物样品中的含氮量：根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量来计算蛋白质的大概含量v蛋白质含量蛋白质含量 = 蛋白氮蛋白氮/16% = 蛋白氮蛋白氮 6.25第三节第三节 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构 一、肽（一、肽（pept

14、ide）和肽键（）和肽键（peptide bond）肽键肽键( (酰胺键酰胺键) )命名命名：从肽链的：从肽链的N端开始，称为某氨酰某氨端开始，称为某氨酰某氨酰酰某氨酸某氨酸w蛋白质蛋白质= 1或几条多肽链（或几条多肽链（+ 辅助基辅助基团）团）w短链且具有生物活性的多肽不算蛋短链且具有生物活性的多肽不算蛋白质，通常称为白质，通常称为活性肽活性肽！w参与体内氧化还原反应参与体内氧化还原反应w保护含巯基蛋白的还原性保护含巯基蛋白的还原性1、天然存在的活性肽、天然存在的活性肽 w 干扰素干扰素治疗乙肝治疗乙肝w 机理机理：诱导细胞合成抗病毒蛋白，增：诱导细胞合成抗病毒蛋白，增强机体免疫力强机体免疫

15、力w 脑肽脑肽是人在受到突然伤害时，脑垂体是人在受到突然伤害时，脑垂体自然分泌的自然分泌的“鸦片鸦片”w 机理机理：抑制感觉神经元释放痛觉信号：抑制感觉神经元释放痛觉信号2、肽的重要性质、肽的重要性质-双缩脲反应双缩脲反应w多肽特有的颜色反应多肽特有的颜色反应w双缩脲双缩脲 + 碱性硫酸铜碱性硫酸铜蓝色蓝色络合物络合物w含有含有两个以上肽键两个以上肽键的多肽，也能发生双的多肽，也能发生双缩脲反应缩脲反应为研究方便为研究方便，分四层次探讨分四层次探讨w一级结构决定高级结构；一级结构决定高级结构；w高级结构行使生物功能高级结构行使生物功能二、蛋白质的一级结构二、蛋白质的一级结构 （primary

16、structure）1、概念：蛋白质分子中各多肽链上、概念：蛋白质分子中各多肽链上氨氨基酸残基的排列顺序。基酸残基的排列顺序。2、维系一级结构的作用力：、维系一级结构的作用力：w肽键肽键 peptide bond w二硫键二硫键 disulfide bond 牛胰岛素（牛胰岛素（insulin）的一级结构）的一级结构wMW=5734；wA链链（21aa，11种），种），B链链（30aa，16种）；种）；w两个链间二硫键，一个链内二硫键。两个链间二硫键，一个链内二硫键。a、样品必须纯（样品必须纯（97%以上）；以上）；b、知道蛋白质的分子量；知道蛋白质的分子量；（1）测定一级结构的要求）测定一级

17、结构的要求3、蛋白质一级结构的测定、蛋白质一级结构的测定（2）测定步骤）测定步骤w测定蛋白质分子中多肽链的数目；测定蛋白质分子中多肽链的数目；w多肽链的拆分及分离；多肽链的拆分及分离；w分析各多肽链的分析各多肽链的N端和端和C端；端；w用多种方法将用多种方法将多肽链断裂成多个肽段；多肽链断裂成多个肽段；w分离肽段，分离肽段，测定每个肽段的测定每个肽段的AA顺序；顺序；w确定多肽链中各肽段的顺序；确定多肽链中各肽段的顺序；w确定多肽链中二硫键的位置确定多肽链中二硫键的位置w构象构象是由于分子中存在是由于分子中存在可自由旋转可自由旋转的原子的原子，形成的分子特殊的空间结，形成的分子特殊的空间结构状

18、态。构状态。第四节第四节 蛋白质的空间构象蛋白质的空间构象nNHCCRO 多肽链多肽链Hw一个蛋白质的多肽链在生物体正常的一个蛋白质的多肽链在生物体正常的温度和温度和pH条件下，只有一种或很少几条件下，只有一种或很少几种有活性的天然构象，并且相当稳定。种有活性的天然构象，并且相当稳定。这说明了这说明了天然蛋白质主链上的单键不天然蛋白质主链上的单键不能自由旋转能自由旋转。 Pauling & Corey X-射线衍射技术射线衍射技术w肽键具有肽键具有部分双键性质部分双键性质，不能自由旋转；，不能自由旋转； C-N键长键长0.149nm C=N键长键长0.127nm 肽键键长肽键键长0.1

19、32nmw组成肽键的组成肽键的4个原子和与之相连的个原子和与之相连的2个个C 处于处于同一个平面内同一个平面内-肽平面肽平面（peptide plane）；）；w相邻的肽平面也不能随意旋转相邻的肽平面也不能随意旋转-二面角二面角（，）。一、蛋白质空间折叠的限制因素一、蛋白质空间折叠的限制因素 肽键中肽键中C-N 键具有部分双键性质，因此键具有部分双键性质，因此组成组成肽键肽键的原子处于同一平面的原子处于同一平面CONCON+-CON+- 共振杂化形式共振杂化形式w2个肽平面旋转时受到个肽平面旋转时受到肽键上的肽键上的H、O以及以及侧链侧链R基空间位阻基空间位阻的影响的影响二、蛋白质的二级结构二

20、、蛋白质的二级结构w概念：多肽链概念：多肽链主链主链的空间排列、折叠。的空间排列、折叠。w氢键氢键是稳定二级结构的主要作用力。是稳定二级结构的主要作用力。w类型类型： -螺旋、螺旋、 -折叠、折叠、 -转角、无转角、无规卷曲。规卷曲。w螺旋一周含螺旋一周含3.6个个Aa残残基，沿轴上升的距离基，沿轴上升的距离（螺距螺距）为）为0.54nm；w每个每个Aa残基的残基的C=O与与其后其后第第4个个Aa残基的残基的N-H形成氢键。形成氢键。1、 -螺旋（螺旋（helix） O.H C（NCHC） N H R O3.613-螺旋螺旋w是最常见，含量最多的二级结构。是最常见，含量最多的二级结构。w有左手

21、和右手螺旋，天然蛋白质中的有左手和右手螺旋，天然蛋白质中的 -螺旋几乎都是螺旋几乎都是右手螺旋右手螺旋。w每个二面角每个二面角均为：均为： =-57 ， =-48 。w不稳定因素：不稳定因素：Pro；大基团侧链大基团侧链AA的聚的聚集集；同种电荷侧链同种电荷侧链AA的聚集的聚集。2、 -折叠（折叠（ -pleated sheet）第二常见的二级结构。第二常见的二级结构。由两条或多条由两条或多条几乎完全伸展几乎完全伸展的多肽链平行排的多肽链平行排列，通过链间的列，通过链间的氢键氢键交联而形成的，或一条交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的锯齿状锯齿状

22、折叠构象折叠构象。类型：类型：平行平行式式（肽链的（肽链的N-端都在同一侧端都在同一侧）；）；反平行式反平行式（相邻肽链的方向相反）（相邻肽链的方向相反）平行式平行式反平行式反平行式3、 -转角（转角（ -turn）w至少含至少含4个个aa残基残基;w弯曲处的第弯曲处的第1个个aa的的C=O 和第和第4个个aa的的N-H 之间形成氢键。之间形成氢键。w主要存在于主要存在于球状球状蛋白。蛋白。 -转角中的常见转角中的常见AA：wGly：无侧链基团，能调整其他无侧链基团，能调整其他AA残基的空间阻碍；残基的空间阻碍；wPro：环状结构，迫使转角形成。环状结构，迫使转角形成。4、无规卷曲（无规卷曲（

23、nonregular coil）w指没有一定规律的松散盘曲的肽链结指没有一定规律的松散盘曲的肽链结构，本身虽有一定的稳定性，但作用构，本身虽有一定的稳定性，但作用力弱。力弱。w酶的功能部位酶的功能部位常包含此构象，灵活易常包含此构象，灵活易变。变。-螺旋螺旋-折叠折叠-转角转角无规卷曲无规卷曲三、超二级结构三、超二级结构w指蛋白质中指蛋白质中相邻相邻的的二级结构单位二级结构单位组合在组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的认的二级结构组合体二级结构组合体。w基本类型基本类型：、等等类型类型希腊钥匙拓扑结构希腊钥匙拓扑结构-曲折曲折：典型例子典型例子- -

24、-角蛋白角蛋白w结构蛋白，为毛发、甲、角、鳞和羽的主结构蛋白，为毛发、甲、角、鳞和羽的主要成分。要成分。w结构结构：3个个 -螺旋（螺旋（-S-S-）原纤维原纤维微原微原纤维（纤维（9+2）大原纤维大原纤维w -角蛋白在湿热时能被拉伸，角蛋白在湿热时能被拉伸，可可转变成转变成 -角蛋白角蛋白。微微原原纤纤维维原原纤纤维维螺螺旋旋大原纤维大原纤维皮层皮层细胞细胞鳞鳞状状细细胞胞微原纤维微原纤维毛发的结构毛发的结构四、蛋白质的三级结构四、蛋白质的三级结构 （Tertiary Structure）1、定义定义：指多肽链在空间上盘绕、折叠：指多肽链在空间上盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的三维形

25、成的包括主链和侧链构象在内的三维结构。结构。w一条多肽链一条多肽链的最高级结构为三级结构。的最高级结构为三级结构。2、肌红蛋白的结构与功能、肌红蛋白的结构与功能功能功能：哺乳动物肌肉中储存、运输氧：哺乳动物肌肉中储存、运输氧结构特点结构特点：1963年，年，Kendreww1条条多肽链，多肽链，1个血红素辅基，个血红素辅基，153aa，MW=16700。w外圆中空外圆中空，8段段 -螺旋螺旋（23aa7aa）。）。w极性极性aa多分布于分子表面，非极性多分布于分子表面，非极性aa则多分则多分布于分子内部布于分子内部 可溶可溶煤气中毒的机制煤气中毒的机制wCO与血红素与血红素Fe的结合能力是的结

26、合能力是O2的的250倍。倍。w人体吸入少量的人体吸入少量的CO即可完全抑制肌红蛋白或即可完全抑制肌红蛋白或血红蛋白与血红蛋白与O2的结合，造成缺氧死亡。的结合，造成缺氧死亡。w急救方法急救方法：尽快将病人转移到富含：尽快将病人转移到富含O2的环境的环境中。中。 五、蛋白质的四级结构五、蛋白质的四级结构 （quaternary structure）1、定义定义：指由：指由两个或两个以上两个或两个以上具有三级结构具有三级结构的的亚基（肽链）亚基（肽链）按一定方式聚合形成的特定按一定方式聚合形成的特定构象。构象。只有只有多条肽链多条肽链的寡聚蛋白才具有四级结构。的寡聚蛋白才具有四级结构。仅涉及仅涉

27、及亚基之间亚基之间的相互作用和空间排布。的相互作用和空间排布。2、维持、维持三、四级结构的主要作用力三、四级结构的主要作用力w主要是主要是次级键次级键，包括，包括氢键、离子键、范德氢键、离子键、范德华力、疏水作用力华力、疏水作用力等，有时还需等，有时还需二硫键二硫键在在链间起加固作用。链间起加固作用。w其中其中疏水作用力疏水作用力（在水溶液中，球状蛋白（在水溶液中，球状蛋白的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子内部的作用力）内部的作用力）是最重要的是最重要的3、血红蛋白的结构与功能、血红蛋白的结构与功能功能功能：存在于动物的红细胞，运输：存在于动物的红细胞，运

28、输O2和和CO2。能结。能结合合H+，维持，维持pH。结构结构：w4个个亚基，球状，亚基，球状，574aa，MW=65000 w 链（链（141aa），）， / / 链（链（146aa）w成人血红蛋白为成人血红蛋白为 2 2（HbA，96%）、）、 2 2（HbA2，2%），），胎儿血红蛋白为胎儿血红蛋白为 2 2（HbF）w三级结构与肌红蛋白相似三级结构与肌红蛋白相似，也含血红素辅基，也含血红素辅基第五节第五节 蛋白质结构与功能蛋白质结构与功能的关系的关系（一）（一）同源蛋白同源蛋白的种属差异与生物进化的种属差异与生物进化一、蛋白质的一级结构与功能的关系一、蛋白质的一级结构与功能的关系 对对

29、Cyt c一级结构的研究表明：一级结构的研究表明：1、亲缘关系越近，、亲缘关系越近，aa顺序的同源性越大。顺序的同源性越大。 黑猩猩黑猩猩 0 鸡、火鸡鸡、火鸡 13 牛猪羊牛猪羊 10 海龟海龟 15 狗驴狗驴 11 小麦小麦 35 粗糙链孢霉粗糙链孢霉 43 酵母酵母 442、不同生物间存在相同的、不同生物间存在相同的保守顺序保守顺序。（二）一级结构的变化引起功能的变化（二）一级结构的变化引起功能的变化w血红蛋白的一级结构变化引起血红蛋白的一级结构变化引起镰刀型镰刀型红细胞贫血病红细胞贫血病。w分子病分子病：基因突变：基因突变蛋白质表达异常蛋白质表达异常疾病疾病w镰刀形贫血病镰刀形贫血病：

30、血液中大量出现血液中大量出现镰刀形红细胞，镰刀形红细胞，患者缺氧窒息患者缺氧窒息 正常细胞正常细胞 镰刀形细胞镰刀形细胞w流行于非洲流行于非洲w死亡率极高死亡率极高w大部分患者童大部分患者童年时夭折，最年时夭折，最长活到长活到30岁。岁。HbA -Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-链链HbS -Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys-链链w显著降低脱氧显著降低脱氧HbS溶解度溶解度纤维状沉淀纤维状沉淀脱氧脱氧红细胞由球状变为镰刀形红细胞由球状变为镰刀形易破裂易破裂限制血流限制血流O2供应不足供应不足患者窒息甚至死亡患者窒息甚至死亡极性极性 非极性非极性二、

31、二、空间结构与功能空间结构与功能的关系的关系例如：例如：RNA酶酶 1、蛋白质执行其生物功、蛋白质执行其生物功能需要相应的空间结构能需要相应的空间结构w空间结构相似空间结构相似功能相似功能相似空间结构决空间结构决定生物学功能定生物学功能2、变构效应（别构效应）、变构效应（别构效应）w外因外因通过改变蛋白质构象引起蛋白质功通过改变蛋白质构象引起蛋白质功能变化。能变化。w例如：例如：血红蛋白的载氧过程血红蛋白的载氧过程定义定义：蛋白质在表达功能的过程中构象发：蛋白质在表达功能的过程中构象发生改变的现象。生改变的现象。 (R)relaxed state(T) tense state 血液血液中中氧分

32、子氧分子的的运送运送LungO2HemoglobinMyoglobinMuscle静脉静脉动脉动脉环境环境O2高时高时Hb快速吸收快速吸收O2环境环境O2低时低时Hb迅速迅速释放释放O2释放释放O2后后Hb变回变回T state任何一任何一个亚基个亚基接受接受氧氧后后，会增进会增进其它其它亚基亚基吸附吸附氧氧的能力的能力第六节第六节 蛋白质的性质及应用蛋白质的性质及应用一、蛋白质的两性性质及应用一、蛋白质的两性性质及应用1、蛋白质带电的原因：、蛋白质带电的原因：w末端末端AA游离游离-NH3+，-COO-w侧链可解离基团侧链可解离基团2、pI的特征：的特征：溶解度、粘度、渗透压、导溶解度、粘度

33、、渗透压、导电能力最小。电能力最小。3、pI的应用：的应用：w溶解度最小溶解度最小 分离混和蛋白分离混和蛋白w净电荷为零净电荷为零 等电聚焦等电聚焦w分子量大，形成分子量大，形成胶体胶体溶液溶液w特点特点：不能通过半透膜不能通过半透膜w改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质解性质二、蛋白质的胶体性质二、蛋白质的胶体性质1、蛋白质胶体性质的利用、蛋白质胶体性质的利用透析透析（dialysis）：w小分子化合物小分子化合物 + 蛋白蛋白质溶液置于透析袋中质溶液置于透析袋中w透析袋置于水中透析袋置于水中w小分子化合物进入水中，小分子化合物进入水中，同时水进入袋中同时水

34、进入袋中w用途用途：纯化蛋白质：纯化蛋白质w密封容器密封容器w施加压力施加压力w一定分子量的物一定分子量的物质透过超滤膜质透过超滤膜超滤超滤 2、胶凝和胶溶、胶凝和胶溶 达到一定浓度的蛋白质溶液冷却时，蛋达到一定浓度的蛋白质溶液冷却时，蛋白质分子靠拢变成一种白质分子靠拢变成一种含水却近似固体含水却近似固体的的状态（即凝胶状态）的过程，称状态（即凝胶状态）的过程，称胶凝胶凝。其。其逆过程为逆过程为胶溶胶溶。w蛋白质溶液的蛋白质溶液的稳定性稳定性：电荷、水化膜：电荷、水化膜w破坏蛋白质表面水膜破坏蛋白质表面水膜w消除蛋白质所带电荷消除蛋白质所带电荷三、蛋白质沉淀三、蛋白质沉淀 蛋白质蛋白质沉淀沉淀

35、w条件温和条件温和，结构和性质没有发生变化，结构和性质没有发生变化w是分离和纯化蛋白质的基本方法是分离和纯化蛋白质的基本方法1、可逆沉淀（、可逆沉淀（非变性非变性沉淀沉淀）等电点沉淀法等电点沉淀法：改变改变pHpI盐析法盐析法：大量的中性盐：大量的中性盐有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法：极性有机溶剂：极性有机溶剂（低温）（低温）w条件强烈，条件强烈，沉淀时发生了蛋白质的结沉淀时发生了蛋白质的结构和性质的变化构和性质的变化2、不可逆沉淀（不可逆沉淀（变性变性沉淀沉淀）四、蛋白质的变性四、蛋白质的变性（denaturation）1、概念概念：外界因素：外界因素蛋白质天然构象被蛋白质天然构象被破坏破坏生

36、物活性改变或丧失生物活性改变或丧失2、变性因素变性因素：w加热、剧烈振荡、加热、剧烈振荡、UV、超声波；、超声波；w强酸、强碱；重金属盐（强酸、强碱；重金属盐（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）；尿素、胍、生物碱；乙醇；尿素、胍、生物碱；乙醇；表面活性剂表面活性剂3、本质、本质w维持蛋白质高级结构的维持蛋白质高级结构的次级键次级键被破坏被破坏w有序结构有序结构无序松散结构无序松散结构w一级结构没有变化一级结构没有变化4、变性蛋白的特征：、变性蛋白的特征：w生物活性丧失生物活性丧失w理化性质改变理化性质改变：溶解度下降、结晶能力：溶解度下降、结晶能力丧失、粘度增加、扩散速度下降、旋光丧失、粘

37、度增加、扩散速度下降、旋光性和紫外吸收性质改变等。性和紫外吸收性质改变等。w生化性质改变生化性质改变：抗原性改变；易被蛋白：抗原性改变；易被蛋白酶水解酶水解5、变性的预防和利用：、变性的预防和利用：w消毒：消毒：75%乙醇、乙醇、UVw饮食：豆腐制作、吃柿子的注意饮食：豆腐制作、吃柿子的注意w急救重金属中毒急救重金属中毒w酶制剂的制备酶制剂的制备6、变性蛋白的复性：、变性蛋白的复性：w定义定义：当变性因素除去后，变性蛋白质：当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（白质的复性（renaturation）。）。w蛋白质结构越复杂，

38、变性越剧烈，复性蛋白质结构越复杂，变性越剧烈，复性越困难。越困难。五、蛋白质的紫外吸收性质五、蛋白质的紫外吸收性质w大部分蛋白质均含有大部分蛋白质均含有Phe、Tyr、Trp（共轭体系）。（共轭体系）。wmax = 280nm w应用：蛋白质鉴定。应用：蛋白质鉴定。六、蛋白质的免疫化学性质六、蛋白质的免疫化学性质1、相关概念、相关概念 免疫反应免疫反应：脊椎动物在：脊椎动物在外来物质外来物质（抗抗原原antigen）入侵时产生）入侵时产生抵抗物质抵抗物质（抗体抗体antibody或或免疫球蛋白免疫球蛋白immunoglobulin）的过程。的过程。抗原特点：抗原特点：w抗原性抗原性：异物，大分

39、子；：异物，大分子；w特异性特异性；w具有具有抗原决定簇抗原决定簇（决定抗原特异性，诱（决定抗原特异性，诱发抗体产生，并能与对应抗体结合的结发抗体产生，并能与对应抗体结合的结构）构）抗体特点：特异性、多样性、不均一性抗体特点：特异性、多样性、不均一性2、免疫球蛋白的类别：、免疫球蛋白的类别： w2条轻链（条轻链（220aa）和和2条重链（条重链（440aa）w二硫键二硫键wY形形w二价二价w可变区和稳定区可变区和稳定区wFab和和Fc3、IgG的结构的结构4、抗原与抗体反应、抗原与抗体反应 w抗原抗原+ +抗体抗体= = =抗原抗原- -抗体复合物抗体复合物w最适比例、最大沉淀最适比例、最大沉

40、淀w沉淀反应是免疫化学分析的基础沉淀反应是免疫化学分析的基础酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（ELISA）第七节第七节 蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化w 组织破碎（研磨、超声波、冻融、酶解）组织破碎（研磨、超声波、冻融、酶解）w w 粗提（离心、沉淀、超滤、萃取等）粗提（离心、沉淀、超滤、萃取等）w w 精制精制（层析层析、电泳电泳）w w 纯品（结晶、冻干）纯品（结晶、冻干）w w 性质研究性质研究w电泳电泳：在外电场的作用下，带电颗粒将：在外电场的作用下，带电颗粒将向与其电性相反的电极移动。向与其电性相反的电极移动。w带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度

41、（v）与电场强度（与电场强度（E），净电荷（），净电荷（q），），分子量（分子量（MW），分子形状等因素有关。），分子形状等因素有关。一、电泳一、电泳1、不连续、不连续SDS-PAGE w原料原料：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺；w催化剂：催化剂：TEMED、过硫酸铵；、过硫酸铵；w不连续不连续-浓缩胶浓缩胶+分离胶；分离胶；wSDS（十二烷基硫酸钠）十二烷基硫酸钠） 消除蛋白质电消除蛋白质电荷、形状的影响；荷、形状的影响；w本质：本质：分子筛分子筛；w电泳迁移率电泳迁移率 分子量分子量w凝胶中加入凝胶中加入两性电解两性电解质质（pH3-9，pH5-7）w两性电解质两性电

42、解质解离使自解离使自身身pI达到该区域的达到该区域的pHw蛋白质移动到与自身蛋白质移动到与自身pI一致的位置时，停一致的位置时，停止移动止移动2、等电聚焦（等电聚焦（IEF）3、双向电泳、双向电泳 w第一向：第一向：IEFw第二向：第二向：SDS-PAGE二、柱层析二、柱层析w离子交换层析：带电性质；离子交换层析：带电性质；w凝胶过滤层析：颗粒大小；凝胶过滤层析：颗粒大小；w亲和层析：特异性亲和力。亲和层析：特异性亲和力。1）阳离子交换树脂阳离子交换树脂 w解离出解离出H+与环境中其他阳离子交换与环境中其他阳离子交换w-SO3H（强酸型）或强酸型）或-COOH（弱酸型）弱酸型）2）阴离子交换树脂阴离子交换树脂w解离出解离出OH-与环境中其他阴离子交换与环境中其他阴离子交换w-N(CH3)3OH（强碱型）或强碱型）或-NH3OH（弱碱型）弱碱型）1、离子交换柱层析、离子交换柱层析 2、凝胶过滤层析（分子筛层析）、凝胶过滤层析（分子筛层析） w根据生物大分子的根据生物大分子的分子大小分子大小进行分离。进行分离。w原理原理：凝胶颗粒内部具有：凝胶颗粒内部具有多孔网状多孔网状结构。待结构。待分离的混合物流经层析柱时，比凝胶孔径分离的混合物流经层析柱时，比凝胶孔径大大的分子不能进入凝胶孔内，沿颗粒之间的空的分子不能进入凝胶孔内，沿颗粒之间的空隙