头孢克洛与中药单用及混配对大肠杆菌的抑菌效果

1、福建农林大学本科毕业论文论文题目：头孢克洛与中药单用及混配对大肠杆菌 的抑菌效果 学 院： 植物保护学院 专业年级： 制药工程2012级 学 号： 3125102083 姓名： 梁小强 指导教师、职称： 林美珍 讲师 2016年 4月26日Undergraduate Dissertation Thesis Title: Antibacterial effect of Cefaclor solely and combined with Chinese medicine on Escherichia coli College: College of Plant Protection Special

2、ty and Grade: Phyarmacy Engineering, 2012 Student Number: 3125102083 Name: Liang Xiaoqiang Supervisor: LIN Meizhen Submitted time: April, 2016 目录Abstract11.引言11.1 大肠杆菌11.2头孢菌素类抗生素21.3 抗生素与中药联合应用21.4 课题背景32.材料与方法32.1实验材料32.1.1试剂32.1.2供试菌32.1.3主要仪器32.2实验方法42.2.1大肠杆菌培养和培养液配制42.2.2抑菌圈法52.2.3 液体培养法及吸光度测定

3、52.2.4 头孢克洛抑菌浓度范围初筛及抑菌性中药种类筛选52.2.4.1 头孢克洛抑菌浓度范围初筛52.2.4.2 抑菌性中药种类筛选及抑菌浓度范围初筛62.2.5 头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂的抑菌活性62.2.6 头孢克洛和板蓝根及复方金银花混配的抑菌活性测定73.实验结果与分析83.1 头孢克洛抑菌浓度范围初筛83.2抑菌性中药种类筛选及抑菌浓度范围初筛83.3 头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂的抑菌活性93.4 头孢克洛和板蓝根及复方金银花混配的抑菌活性测定114.讨论12参考文献12致谢13摘要：本论文同时用抑菌圈法和液体培养法比较头孢克洛与中药单用及混配对大肠杆菌的抑菌效果。

4、采用抑菌圈法比较复方金银花颗粒、甘草口服液、双黄连口服液和板蓝根颗粒四种中药试剂对大肠杆菌的抑菌效果，结果发现仅复方金银花颗粒和板蓝根颗粒两种药物有抑制效果；头孢克洛对大肠杆菌的最小抑菌浓度MIC为13.7mg/L，板蓝根的最小抑菌浓度MIC为5.8×104mg/L，复方金银花的最小抑菌浓度MIC为5.7×104mg/L。将头孢克洛与板蓝根和复方金银花混用，最佳的混配组合是头孢克洛浓度为20mg/L与板蓝根和复方金银花最高浓度的两个组合，抑菌圈直径从6.2mm增加到18.6mm和18.8mm，具有明显的加成作用。关键词：头孢克洛，大肠杆菌，板蓝根颗粒、复方金银花颗粒、联合用

5、药，抑菌作用Abstract:In this paper, while using the inhibition zone method and liquid culture method and cefaclor medicine alone and mixed with E. coli antibacterial effect. Inhibition zone method comparison compound honeysuckle granules, oral licorice, SHL oral Banlangen four traditional Chinese medicine

6、s and reagents inhibitory effect of E. coli, found that only compound honeysuckle granules and Banlangen two drugs inhibit the effect; cephalosporins Crowe minimum inhibitory concentration MIC of E. coli 13.7mg / L, Radix minimum inhibitory concentration MIC of 5.8 × 104mg / L, the minimum inhi

7、bitory concentration of compound honeysuckle MIC of 5.7 × 104mg / L. The cefaclor and Radix honeysuckle mix and compound, the best combination is mixed cefaclor concentration of 20mg / L in combination with two Radix and the highest concentration of compound honeysuckle, inhibition zone diamete

8、rs from 6.2mm to 18.6mm and 18.8mm, has a significant additive effect.Key words: cefaclor, escherichia coli, Radix isatidis particle,tCompound honeysuckle particles,raditional Chinese medicine, combination, bacteriostatic action1. 引言1.1 大肠杆菌 大肠杆菌学名大肠埃希氏菌（Escherichia coli），是Escherich在1885年发现，由于当时科技水平

9、比较低，大肠杆菌被认为是在肠道菌群正常组成部分。直到20世纪中期，众多生物学家才认识到大肠杆菌对动物和人可能会有病原性。经过验证，大肠杆菌会导致严重腹泻或者败血症。大肠杆菌是动物和人肠道需要的细菌落。正常情况，大肠杆菌并不会造成疾病，但却实致病病菌。大肠杆菌是原核生物，只有核糖体，而作为病菌，大肠杆菌生长速度极快1。培养大肠杆菌适合温度是33，12h后长势良好，正因为如此，大肠杆菌变得应用广泛，论是遗传学，还是生物学以及医学上常被作为试验用的代表性细菌。1.2头孢菌素类抗生素 头孢菌素类抗生素是细菌性病害的主要治疗药物，具有抗菌范围广、作用强等优点。随着医药科学不断创新，头孢已经发展到了第四代

10、，本次实验采用的头孢洛克属于二代头孢类抗生素，是主治敏感菌所导致的呼吸系统和泌尿系统以及耳鼻喉科、皮肤还有软骨组织感染等的良药。本实验所用的是头孢洛克颗粒（商品名，希刻劳，儿童用抗生素），粉红色颗粒，气味芳甜。头孢洛克是通过抑制细胞壁生长从而达到杀死细菌的目的，可以抑制化脓链球菌、肺炎链球菌；对流感嗜血杆菌(仅针对非产-内酰胺酶的菌株)、卡他莫拉菌(包括产-内酰胺酶的菌株)也有一定抑制效果2。1.3 抗生素与中药联合应用 近年来滥用抗生素使很多细菌不能正常生长与繁殖，使细菌生理状态发生变化，导致基因突变，从而产生抗药性。按西药药敏试验要求，抗生素药敏抑菌环在 6 mm 以下时 , 即不被再选用

11、3。针对这一现象，中国学者研究发现，将抗生素与中药联合应用，其抑菌与杀菌作用可明显增强。主要原因是细菌对中药较难形成抗药性，认为中药成分复杂，大部分成分都有抗菌活性的物质， 而不同成分抗菌的作用靶点各不相同，因此如将抗生素与中药配伍联用，则细菌对中西药联用药物难以形成抗药性的突变4。目前这方面已有许多报道。李慧萍等用先锋V与中药合剂进行联合应用，中药种类选择黄连、苦参及虎杖等七味中药配伍，复方中药合剂加水文火煎煮，将煎煮的 3 次药液合并浓缩为后使用，先锋V的抑菌环是 8mm，仅进行中药试验抑菌环是 12mm，中西药联合应用后抑菌环增加到19mm5。龚志术采用头孢唑啉和七种中药联合应用，所得抑

12、菌环比头孢唑啉和中药单用的抑菌圈要显著增大。罗音久 （2006）研究表明，环丙沙星与紫花地丁提取物联用应用对耐药大肠杆菌的抑菌效果呈相加作用5。 朱金凤和司红彬通过研究中草药牛至油与部分抗菌药联合用药对大肠杆菌的抑菌效果，发现牛至油与阿莫西林、粘菌素、林可霉素联用呈相加作用6。郑艳青等研究表明，鬼针草水煮液与头孢类抗生素、阿莫西林等联合作用呈相加作用，且以与头孢曲松钠的相加作用最明显，是单独用药的16倍7。刘增援等最小抑菌浓度 （ MIC）研究透骨草水提物与抗菌药联用对产ESBLs大肠杆菌的抑制效果，判定透骨草水提物可以降低抗菌药对耐药菌株的最小抑菌浓度8。文英采用棋盘法进行了多种抗生素与柴胡

13、及黄芪多糖对大肠埃希菌的体外联合抑菌试验，结果发现硫酸庆大霉素注射液与黄芪多糖注射液、 青霉素钾与柴胡注射液、 青霉素钾与黄芪多糖注射液呈相加作用9。另一方面，并不是所有的中药都适合与抗生素类配伍联用。近年来也发现一些常见中西药不合理联用现象。徐永超等报道中药牛黄解毒片（丸）与四环素同服，因这两者都有消炎作用，当两者同时使用时，发现两者的消炎作用出现相互抵消；硼砂与头孢菌素、青霉素同用，亦会影响吸收，降低疗效10。蒙莫珂等报道某些酸碱度类似的药物也不能共同使用，比如山楂、五味子、乌梅等有酸化中和作用，能使碱性的抗生素如四环素、红霉素等排泄加快，药效降低11。1.4 课题背景本论文的试验出发点探

14、究头孢类药物与中药混合后对大肠杆菌的抑菌效果十分有加成作用，试验选择目前市场上广泛应用的头孢克洛，同时选了四种市民感冒时常用的中药甘草、板蓝根、双黄连和复方金银花进行抗菌活性筛选。甘草是对人体有益的中草药，常见剂型是甘草口服溶液，颜色黑中带黄，味苦。板蓝根是最为广泛应用的中药感冒颗粒，易溶于水，无论是感冒、头疼、中暑、喉咙疼都有疗效，据报道板蓝根里面含有的菘蓝根茎（板蓝根）能够有效地抑制诸如大肠杆菌、伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等细菌。双黄连口服溶液主要是清热解毒，用于外感风热所致的感冒。复方金银花颗粒剂也用于风热感冒，咽炎，扁桃体炎。试验采用滤纸片抑菌圈法和液体培养法对这些中西药单用及

15、混用的抑菌效果进行评价。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1试剂头孢克洛：商品名希刻劳，礼来苏州制药有限公司复方金银花颗粒：广州诺金制药有限公司甘草口服溶液：福州海王金象中药制药有限公司双黄连口服溶液：河南太龙药业股份有限公司板蓝根颗粒：云南白药集团股份有限公司其他试剂：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂粉等。2.1.2供试菌 大肠杆菌（福建农林大学实验室提供）。2.1.3主要仪器表1 试验所用仪器清单仪 器厂 家UPWS超纯水器杭州永洁达净化科技有限公司BCD-256KFA冰箱青岛海尔股份有限公司DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏试验设备有限公司LS-B50L立式压力蒸汽灭菌器上

16、海华线医用核子仪器有限公司DK-8D恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司UVmimi-1240紫外可见分光光度计岛津公司THZ-C-1台式冷冻恒温振荡器（摇床）太仓市实验设备厂YP202N电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司2.2实验方法2.2.1大肠杆菌培养和培养液配制 大肠杆菌采用NA培养基及NA液体培养基进行培养。表2 NA培养基配方试剂量/值试剂量/值牛肉膏3 g琼脂粉18g蛋白胨5gNaCl5g水1000mLpH7.2先称氯化钠5g，将其倒入1000mL烧杯中。然后称取牛肉膏，因为牛肉膏是粘性很高的黑色膏状物，称取后用事先准

17、备好的5g的热水溶解后倒入盛有氯化钠的大烧杯中。蛋白胨是泛有淡黄色的肉粉，它极易吸潮，要快速称量5g，然后将其倒入上述的大烧杯中。称量琼脂18g，将其放在小烧杯中以待用。烧杯里面倒入一些水，在电磁炉上用小火加热，并用玻璃棒搅拌，待药品完全溶解后，再将所以准备好的材料都放入1000mL的大烧杯中，再继续加热融化，玻璃棒要搅拌不停以便琼脂糊底或者溢出，最后补足缺失的水分，并且配好培养液后用氢氧化钠调至ph7.27.4，装在三角烧瓶中，用橡胶盖子塞住，放入立式高压灭菌器里进行灭菌处理。液体培养基配比同固体培养基，只是不需要添加琼脂粉。 接菌操作：从试管中用酒精灯灭过菌的接种环取出大肠杆菌，在固体培养

18、基上划线，同时放一些到液体培养基中培养，增强活性。做好后，固体培养基放在培养箱33培养2448H，液体培养基在摇床33培养到2448H。2.2.2抑菌圈法 主要通过抑菌圈的大小来判断药液的抑制作用，通常抑菌圈面积或直径的平方与浓度对数成线性关系估算最小抑菌浓度（MIC）。具体操作如下：（1）无菌操作下用消毒接种环轻轻地把斜面上的孢子刮下，把无菌水约5mL注入纯培养菌种斜面试管中，振荡配成菌悬液。（2）把灭过菌的琼脂培养基在水浴中加热融化,待冷却至50左右。以无菌操作吸取500mL菌悬液倒入培养皿中，然后迅速倒入约10mL培养基，立即摇匀，使菌悬浮液充分与培养基混合，静置凝固。（3）取消毒小烧杯

19、，作好药剂浓度标记，然后分别盛取各种试验药液，并于其中放入直径6mm的圆形滤纸片。用镊子取出这些经药剂浸渍过的滤纸片，按试验的混合组合顺序放入已凝固的琼脂培养基平面上，每皿3片，滤纸片均匀放置。同时用蘸无菌水的纸片作对照。（4） 将处理的培养皿倒扣置于33恒温培养箱中，培养24小时后测量抑菌圈直径，取平均值，根据浓度对数和抑菌圈直径平方作抑菌活性回归方程，估算MIC。2.2.3 液体培养法及吸光度测定 取干净灭菌的试管(规格为18mm×180mm)，每个试管添加5mL液体培养基，添加定量药液后，同时加入50uL用液体培养基培养48h后的大肠杆菌菌液，塞好灭过菌的硅胶塞，5根一捆用皮筋

20、绑好后，成捆放入恒温振荡培养箱内33培养24h。取出后用紫外分光光计测定波长为600nm时的吸光度值。用灭过菌的液体培养基作为空白对照，同时用不加药液但添加菌液，同样培养24h后测定其吸光度，作为最高浓度对比。2.2.4 头孢克洛抑菌浓度范围初筛及抑菌性中药种类筛选2.2.4.1 头孢克洛抑菌浓度范围初筛配制药剂在超净工作台上操作。头孢洛克每包125mg溶于10mL无菌水中，配制成浓度为1.25×104mg/L，按照等比稀释法共配制5个梯度浓度：1.25×104mg/L，6.25×103mg/L，3.13×103mg/L，1.57×103mg/

21、L，7.85×102mg/L。采用滤纸片抑菌圈法对抑菌浓度范围进行初筛。2.2.4.2 抑菌性中药种类筛选及抑菌浓度范围初筛 板蓝根颗粒每包10g，溶于10mL无菌水，配制成浓度为1×106mg/L悬浮液，复方金银花颗粒也是取10g溶于10mL无菌水，配制成浓度为1×106mg/L悬浮液。甘草口服液和双黄连口服液直接取原药液。5种中药配好后的药液，进行滤纸片抑菌圈法操作，将滤纸片沾满药液控干后放入固体培养基上，每个培养皿放3片，同时用无菌水作为空白对照。2.2.5 头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂的抑菌活性 预实验结果表明，只有板蓝根颗粒和复方金银花颗粒两种中药有

22、抑菌效果，因此将预实验筛选出来的头孢克洛抑菌范围内设定5个浓度，而板蓝根颗粒和复方金银花颗粒则按照等比稀释法设定5个浓度，用滤纸片抑菌圈法分别测定头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂的抑菌活性，用浓度对数和抑菌直径平方估算各药物对大肠杆菌的MIC，具体浓度设定见表3。表3 抑菌圈法3种药物设定的浓度及代码药剂浓度代码浓度（mg/L）头孢克洛TB12.5×103TB2500TB3100TB420TB510板蓝根BLG11×106BLG25×105BLG32.5×105BLG41×105BLG55×104复方金银花JYH11×106

23、JYH25×105JYH32.5×105JYH41×105JYH55×104同时头孢克洛，板蓝根和复方金银花根据液体培养基的预实验分别设定5个浓度，具体浓度设定见表4，培养24h后测定液体培养基的吸光度值，与不加药的培养菌液进行浓度对比，比较抑菌活性。表3 液体培养法3种药物设定的浓度及代码药剂浓度代码浓度（mg/L）头孢克洛TB16.4TB21.6TB30.4TB40.1TB50.025板蓝根BLG12×104BLG21×104BLG35×103BLG42×103BLG51×103复方金银花JYH12&

24、#215;104JYH21×104JYH35×103JYH42×103JYH51×1032.2.6 头孢克洛和板蓝根及复方金银花混配的抑菌活性测定 共设6个混配处理：首先将头孢克洛的最低浓度组（即步骤2.2.5中头孢克洛的第5个浓度，代码TB 5）分别和板蓝根最高的2个浓度（即步骤2.2.5中板蓝根的第1个和第2个浓度，代码BLG1和BLG2）按体积比11进行混配，同时将头孢克洛的第四个浓度（即步骤2.2.5中头孢克洛的第4个浓度，代码TB 4）和板蓝根最高浓度（代码BLG1）按体积比11进行混配；其次将头孢克洛的最低浓度组（即步骤2.2.5中头孢克洛的

25、第5个浓度，代码TB 5）分别和复方金银花最高的2个浓度（即步骤2.2.5中复方金银花的第1个和第2个浓度，代码JYH1和JYH2）按体积比11进行混配，同时将头孢克洛的第四个浓度（即步骤2.2.5中头孢克洛的第4个浓度，代码TB 4）和复方金银花最高浓度（代码JYH1）按体积比11进行混配，随后分别用抑菌圈法和液体培养法对混配后的抑菌活性进行测定。同时用无菌水作为空白处理。3.实验结果与分析3.1 头孢克洛抑菌浓度范围初筛 从表5的结果可以看出，头孢克洛对大肠杆菌的抑菌活性很强，6个浓度处理所得的抑菌圈直径都大于20mm，且从3.13×103mg/L开始抑菌圈变化较小，因此后面设定

26、的最高浓度应低于3.13×103 mg/L。表5 抑菌圈法初步测定头孢克洛对大肠杆菌的抑菌圈直径序号浓度（mg/L）抑菌直径（mm）11.25×10429.3±0.526.25×10325.2±0.333.13×10323.1±0.741.57×10322.7±0.257.85×10221.6±0.3图1 抑菌圈法初步筛选头孢克洛对大肠杆菌的抑菌活性浓度范围(24h)3.2抑菌性中药种类筛选及抑菌浓度范围初筛从图2可以看出，四种中药中，板蓝根和复方金银花对大肠杆菌有抑菌圈，而双黄连和甘

27、草用原药液浓度都无法产生抑菌圈。从图片可以看出，相同浓度的板蓝根和复方金银花对比，复方金银花的抑菌圈要大于板蓝根。3.3 头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂的抑菌活性图2 抑菌圈法初步筛选对大肠杆菌有抑菌活性的中药种类3.3 头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂的抑菌活性使用滤纸片抑菌圈法测定三种药物对大肠杆菌的抑菌活性，根据表6的数据结果，求得头孢克洛对大肠杆菌的抑菌活性回归方程为y=213.68x-243.49，将y=0带入方程中，x= 1.14，故最小抑菌浓度MIC为13.7mg/L。同理，求得板蓝根的最小抑菌浓度MIC为5.8×104mg/L，复方金银花的最小抑菌浓度MIC为5.7

28、×104mg/L。表6 抑菌圈法测定头孢克洛、板蓝根和复方金银花单剂对大肠杆菌的抑菌活性药剂浓度代码浓度（mg/L）浓度对数抑菌直径（mm）抑菌直径平方头孢克洛TB12.5×1033.39823.3542.89TB25002.69916.1259.21TB31002.00012.8163.84TB4201.3016.238.44TB5101.00000板蓝根BLG11×1066.00021.2449.44BLG25×1055.69920.0400.00BLG32.5×1055.39916.3265.69BLG41×10556.137.

29、21BLG55×1044.69900复方金银花JYH11×1066.00021.6466.56JYH25×1055.69919.6384.16JYH32.5×1055.39916.9285.61JYH41×10556.440.96JYH55×1044.69900图3 头孢克洛对大肠杆菌的抑菌活性回归线图4 板蓝根对大肠杆菌的抑菌活性回归线图5 复方金银花对大肠杆菌的抑菌活性回归线使用液体培养法测定三种中药对大肠杆菌的抑菌活性，获得结果如表7所示。由表7可知，大肠杆菌抑制率显著高于板蓝根和复方金银花。表7 液体培养法测定三种药物单剂对大

30、肠杆菌的抑菌活性（24h）药剂浓度代码浓度（mg/L）OD600浓度抑制率（%）不加药菌液-1.734/头孢克洛TB16.40.0050.997TB21.60.0070.996TB30.41.1970.310TB40.11.2150.299TB50.0251.2940.254板蓝根BLG12×1040.4170.760BLG21×1040.5760.668BLG35×1030.6340.634BLG42×1030.6860.604BLG51×1031.1020.364复方金银花JYH12×1040.0580.967JYH21×

31、;1040.0620.964JYH35×1030.1140.934JYH42×1031.2870.258JYH51×1031.4780.1483.4 头孢克洛和板蓝根及复方金银花混配的抑菌活性测定从表8结果可以看出，最佳的混配组合是头孢克洛浓度为20mg/L与板蓝根和复方金银花最高浓度的两个组合，差别不是很显著。而从3.3结果可以看出，头孢克洛浓度为20mg/L时，抑菌圈直径仅为6.2mm，而与中药混配后，抑菌直径可以增加到18.6mm和18.8mm，具有明显的加成作用。从液体培养法比较，混配药剂与头孢克洛浓度为20mg/L时的吸光度值1.215差别不大。表8 头孢克洛和板蓝根及复方金银花混配对大肠杆菌的抑菌活性重复TB4+JYH1TB5+JYH1TB5+JYH2TB4+BLG1TB5+BLG1TB5+BLG2抑菌圈直径mm11819.518.516.516.015.513.515.014.020.518.517.519.517.515.513.015.017.523平均直径mm18.61614.118.817.516.0吸光度值（OD600）1.2141.0241.0511.1971.0041.087图3头孢克洛和板蓝根及复方金银花混