丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备

1、任务一、SHMT的电泳制备方案的制定樊贝贝第二组生药111120114231051、概念 中文简称：“丝氨酸羟甲基转移酶” 英文名称： Serine hydroxymethyltransferase 简介：它是酶促制备L-丝氨酸的关键酶，在四氢叶酸(THFA)、甲醛及磷酸吡哆醛(PLP)存在下催化甘氨酸生成L-丝氨酸。它的生理学功能是催化丝氨酸和甘氨酸之间可逆的互换。一、知识链接一、知识链接2、电泳方法根据支持物的不同，可以分为纸电泳，薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。3、酶工程领域中采用较多的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）4、影响电泳的因素： 电泳介质的PH值

2、， 缓冲液的离子强度， 电场强度， 电渗现象。5、SHMT在光合组织中的生理作用 （1） 光合作用组织中线粒体GDCSHMT系统在Gly和Ser分解中起着重要作用（2） SHMT在非光合组织中的生理作用（3)SHMT在根瘤碳流动中的作用（4）光呼吸SHMT影响植物对生物和非生物胁迫的抵抗能力6、SHMT的分离制备的方法电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳)定义：定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子，在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离目的的分析方法7、电泳作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 作用原理： 聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。 8、电泳形式：

3、 （1）非变性聚丙烯酰胺凝胶 （2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。 垂直板电泳槽示意图垂直板电泳槽示意图加样加样l聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺Acr和交联剂N，N甲叉双丙烯聚酰胺Bis聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。lAcr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。二、实训原理二、实训原理l化学法的

4、引发剂是过硫酸胺Ap催化剂是四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。1、试剂l 分离胶缓冲液（TrisTris-HCL-HCL缓冲液 PH8.9）:取1mol/L盐酸48mL，Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100mL。l浓缩胶缓冲液（Tris-HCl缓冲液 PH6.7）:取1mol/L盐酸48mL, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100mL。l电泳缓冲液（Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3）

5、:称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L。用时稀释10倍。l 30AcrBis贮存液：30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100mL,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。 lTEM10%过硫酸铵（新鲜配制）；25%蔗糖溶液；0.05%溴酚蓝溶液；7%冰乙酸溶液。l染色液：称取考马斯亮蓝R250 2.5g，冰乙酸92ml，甲醇454ml，加去离子水454 ml使其完全溶解，过滤ED；后置棕色瓶保存。l脱色液：取甲醇50ml，冰乙酸75ml，加蒸馏水至1000ml。 2、材料 SHMT标准蛋白质3、器材： 垂直板型电泳槽、天平、 直流稳压电源、 5

6、0或100l微量注射器、 玻璃板、水浴锅、 染色槽、 烧杯、吸量管 胶头滴管1 1、 安装垂直板电泳槽安装垂直板电泳槽 （1） 将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠； （2） 用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板； （3) 用蒸馏水试验封口处是否漏水。 2 2、制备凝胶板、制备凝胶板 （1） 分离胶制备： 取Acr-Bis储备液 5.0mL, Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5mL, 去离子水12.39mL, TEMED 0.02mL置于小烧杯中混匀，再加入10% 0.1mL过硫酸胺，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸

7、管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约 1cm。 用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约34cm），用于隔绝空气，使胶面平整。 分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。 （2） 浓缩胶制备： 取Acr-Bis储备液1.0mL， Tris-HCl 缓冲液（PH6.7）1.25mL，TEMED 0.01mL, 去离子水7.64mL，10% 过硫酸胺0.1mL，用磁力搅拌器充分混匀。 混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，

8、轻轻取出样品模槽板。 用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。 插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。 3、加样、加样 （1) 各标准蛋白及待测蛋白都用样品溶解液溶解，使浓度为0.51mg/mL，沸水浴加热3分钟，冷却至室温备用。 (2) 一般加样体积为1015L（即210g蛋白质）。如样品较稀，可增加加样体积。 (3)用微量注射器小心将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳4、电泳、电泳 （1）将直流稳压电泳仪

9、开关打开，开始时将电流调至10mA。待样品进入分离较时，将电流调至2030mA。 （2）当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 5、染色、染色 将凝胶放入考马斯亮蓝R250染色液中，使染色液没过胶板，染色30min左右。6、脱色、脱色 弃去染色液，将凝胶置于脱色液中，并经常更换脱色液，直至背景蓝色褪去。如用50水浴或脱色摇床，则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后，可反复使用。(1) Acr和Bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴手套和口罩，纯化应在通风橱内进行。(2) 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会造成凝胶板与玻璃板之间产生气泡。(3) 样品槽模板梳齿应平整光滑。(4) 用琼脂封底及