生物芯片技术及其进展

1、侯治富侯治富吉林大学白求恩医学部吉林大学白求恩医学部中日联谊医院中日联谊医院生物芯片技术的主要内容生物芯片技术的主要内容 生物芯片的概念生物芯片的概念 生物芯片的基本原理生物芯片的基本原理 生物芯片的分类生物芯片的分类 生物芯片的发展历程生物芯片的发展历程 生物芯片的技术方法生物芯片的技术方法 生物芯片的应用生物芯片的应用生物芯片的定义生物芯片的定义 生物芯片（生物芯片（BiochipBiochip或或BioarrayBioarray）是指包是指包被在固相载体上的高密度被在固相载体上的高密度DNADNA、抗原、抗抗原、抗体、细胞或组织的体、细胞或组织的微点阵微点阵( (microarraymi

2、croarray）。）。 生物芯片的种类：包括生物芯片的种类：包括DNADNA芯片、抗原芯芯片、抗原芯片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。片、抗体芯片、细胞芯片、组织芯片等。 19981998年世界十大科技突破之一。年世界十大科技突破之一。 未来十年最具发展潜力的技术。未来十年最具发展潜力的技术。生物芯片的定义生物芯片的定义 BioBio：词素生.，生物.; ChipChip：屑晶片, 薄片; 电子集成电路片; 英汉计算机名词芯片 ArrayArray：阵,列,排列,配置,系,组,级数,芯片生物芯片的概念生物芯片的概念集成集成1234567891011121314151617181920212

3、2XYPDGFBEGFR1PDGFRAMETFGFR2WNT1MYBHER2YES1HRAS1CND1RAF1GLIMYCMDM220q13RELMYCL1FGRFESABLINT2PIK3CANMYCAKT2FGFR1JUNBAKT1KRAS2CDK4AR生物芯片基本原理生物芯片基本原理生物芯片的特点生物芯片的特点 高度并行性：提高实验进程、利于显示图高度并行性：提高实验进程、利于显示图谱的快速对照和阅读。谱的快速对照和阅读。 多样性：可进行样品的多方面分析，提高多样性：可进行样品的多方面分析，提高精确性，减少误差。精确性，减少误差。 微型化微型化：减少试剂用量和反应液体积，提：减少试剂用量

4、和反应液体积，提高样品浓度和反应速率。高样品浓度和反应速率。 自动化自动化：降低成本，保证质量。：降低成本，保证质量。 高通量高通量生物芯片的分类生物芯片的分类 尚未统一。尚未统一。 广义上：矩阵型芯片、处理型芯片广义上：矩阵型芯片、处理型芯片 固化材料：基因芯片、蛋白质芯片、固化材料：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片细胞芯片、组织芯片 用途分类用途分类生物芯片研究的历史生物芯片研究的历史 1991 1991 AffymatrixAffymatrix公司公司S Stephen Fodor:tephen Fodor:光刻与光化光刻与光化学技术、学技术、 多肽和寡聚核苷酸微阵列。多肽和寡聚

5、核苷酸微阵列。DNA ChipDNA Chip概念概念 StanfordStanford大学大学BrownBrown实验室：预先合成实验室：预先合成，机械手阵列机械手阵列 1995 1995 SchenaSchena等等：基因表达谱：基因表达谱 1996 1996 Chee et alChee et al：DNADNA测序测序 1996 1996 Cronin et alCronin et al：突变检测突变检测 1996 1996 Sapolsley & LipshutzSapolsley & Lipshutz：基因图克隆基因图克隆 1996 1996 Shalon et a

6、lShalon et al：复杂复杂DNADNA样本分析样本分析 1996 1996 Shoemaker et alShoemaker et al：缺省突变定量表型分析缺省突变定量表型分析分类（根据应用）分类（根据应用） 基因变异检测芯片基因变异检测芯片疾病检测疾病检测( (如如HIVHIV、P53P53基因、结核杆菌基因、结核杆菌) )法医鉴定法医鉴定( (如如DNADNA指纹图谱指纹图谱) ) 表达谱芯片表达谱芯片肿瘤相关基因肿瘤相关基因( (正常与肿瘤组织表达差异正常与肿瘤组织表达差异) )药物筛选药物筛选( (培养细胞药物刺激前后表达差异培养细胞药物刺激前后表达差异) )发育发育( (

7、同一组织不同发育时期基因表达差异同一组织不同发育时期基因表达差异) )组织发生组织发生( (不同组织或器官的基因表达差异不同组织或器官的基因表达差异) )分类（根据工艺和载体）分类（根据工艺和载体） 原位合成法：原位合成法：密集程度高，可合成任意序密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷列的寡聚核苷酸，但特异性较差，寡聚核苷酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误酸合成长度有限，且随长度增加，合成错误率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。率增高。成本较高，设计和制造较烦琐费时。 DNADNA微矩阵法微矩阵法：成本低，易操作，点样密度成本低，易操作，点样密度通常能满足需要。

8、芯片的载体需表面紧质、通常能满足需要。芯片的载体需表面紧质、光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，光滑的固体，如硅，陶，玻璃等，DNADNA微矩阵微矩阵芯片常用玻片为载体。芯片常用玻片为载体。D N A C h ip s P r o te in C h ip s L a b C h ip sB io c h ip s分类（根据分类（根据DNADNA成分）成分） 寡聚核苷酸或寡聚核苷酸或DNADNA片段：约片段：约2020 2525个核个核苷酸碱基，常用于基因类型的分析，苷酸碱基，常用于基因类型的分析，如突变、正常变异（多态性）。如突变、正常变异（多态性）。 全部或部分全部或部分cDNAcDNA：约约5

9、00500 50005000个核苷个核苷酸碱基，通常用于两种或以上样本的酸碱基，通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析。相关基因表达分析。Comparison of DNA Chip Technologies Sensitivity of DNA chip based assays is a function of: Probe and target DNA/RNA (Complexity) Chip surface (autofluorescence & non-spec. bkg) Attachment chemistry/methodology (hyb. efficiency

10、 & crosshyb.) Hybridization efficiency (lots of factors) Detection technology (signal type, efficiency, noise)基因芯片的种类基因芯片的种类 Science ChipScience Chip：生物分析和诊断。生物分析和诊断。 Nutri ChipNutri Chip：食物分析、转基因、污染检测。食物分析、转基因、污染检测。 Leuko ChipLeuko Chip：血液分析、病毒分析、血液分析、病毒分析、HLAHLA分析。分析。 Aqua ChipAqua Chip：水质分析。水

11、质分析。 Secure ChipSecure Chip：含含DNADNA的物质鉴定。的物质鉴定。 Chromo ChipChromo Chip：基因分析和染色体序列。基因分析和染色体序列。 Prokaryo ChipProkaryo Chip：原核生物、兽医、环保等。原核生物、兽医、环保等。 芯片制备：微点阵芯片制备：微点阵 样本制备：样本制备：DNADNA提纯、扩增、标记提纯、扩增、标记 杂交：样本与互补模板形成双链杂交：样本与互补模板形成双链 检测：共聚焦扫描，双色激光检测：共聚焦扫描，双色激光 数据处理：定量软件，数据库检索，数据处理：定量软件，数据库检索，RNARNA印迹等。印迹等。

12、结果分析结果分析 细胞细胞对对mRNA进行标记进行标记杂交杂交基因表达资料基因表达资料生物芯片的制作步骤生物芯片的制作步骤 生物芯片分析生物芯片分析 1 1、测定过程应包括五个、测定过程应包括五个基本步骤：基本步骤：需解决的生物学问题需解决的生物学问题样本制备样本制备生物化学反应生物化学反应检测检测数据分析数据分析2 2、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。、生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配。3 3、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。、生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配。4 4、所有基因分析必须平行处理。、所有基因分析必须平行处理。5 5、基因分析技术必须适合微型化和自

13、动化。、基因分析技术必须适合微型化和自动化。6 6、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。、平行格式必须精确的依据生物学样本的次序。7 7、检测系统必须能精确地获得数据。、检测系统必须能精确地获得数据。8 8、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。、检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复。9 9、两种或以上平行数据组比较应受到单、两种或以上平行数据组比较应受到单 个实验所固有特性的限制。个实验所固有特性的限制。1010、绝对比例关系只存在于组合实验的平、绝对比例关系只存在于组合实验的平 行数据组内。行数据组内。1111、平行格式包括内在和外部的整个系统、平行格式包括内在和外部的整个

14、系统 误差的分析因素。误差的分析因素。1212、在每个系统模块中采集到该系统所有、在每个系统模块中采集到该系统所有 变量的四维数据时，才能称为完成生变量的四维数据时，才能称为完成生 物系统平行基因分析。物系统平行基因分析。生物芯片技术的生物芯片技术的1212条原则只是一个基本条原则只是一个基本框架。其术语的详细定义和有关理论可框架。其术语的详细定义和有关理论可参见参见/schena//schena/http:/ 原位合成法（原位合成法（in situ synthesis):in situ synthes

15、is):又又可分为可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用原位光控合成法和原位标准试剂合成法。适用于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。于寡核苷酸，使用光引导化学原位合成技术。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法。 合成后交联（合成后交联（post-synthetic attachment):post-synthetic attachment):利用利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或苷酸或cDNAcDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上。主要用于诊断、检测病原体

16、及其他他材料上。主要用于诊断、检测病原体及其他特殊要求的中、低密度芯片的制备。特殊要求的中、低密度芯片的制备。两种制备方法比较 原位合成：原位合成：测序、查明点突变测序、查明点突变高密度、根据已知的高密度、根据已知的DNADNA编制程序编制程序制作复杂、价格昂贵、不能测定未知制作复杂、价格昂贵、不能测定未知DNADNA序列序列 合成后交联：合成后交联：比较分析比较分析制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化，制备方式直接和简单，点样的样品可事先纯化，交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯片。交联方式多样，可设计和制备符合自己需要的芯片。中、低密度，样品浪费较多且制备前需储存大量样品。中、低

17、密度，样品浪费较多且制备前需储存大量样品。杂交杂交 是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步液相中探针与液相中探针与DNADNA片段按碱基配对规则形成片段按碱基配对规则形成双链反应。双链反应。选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏选择杂交条件时，必须满足检测时的灵敏度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能度和特异性。使能检测到低丰度基因，且能保证每条探针都能与互补模板杂交。保证每条探针都能与互补模板杂交。合适长度的合适长度的DNADNA有利于与探针杂交。有利于与探针杂交。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。温度、非特异性本底等均会影响杂交结果。最好在封闭循环条件下

18、杂交，杂交炉。最好在封闭循环条件下杂交，杂交炉。样本制备样本制备 制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备高质量样本是困难的但又是极其重要的。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。制备细胞、组织或整个器官样本应特别小心。温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分温度、激素和营养环境、遗传背景、组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化。化。 用于基因类型分析的样本是用于基因类型分析的样本是DNADNA，用于表达研用于表达研究的样本是究的样本是cDNAcDNA。 样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光样本制备后应进行标记，通常为酶标记、荧光标

19、记和核素标记。标记和核素标记。结果分析结果分析 芯片与标记的靶芯片与标记的靶DNADNA或或RNARNA杂交后，或与标记的杂交后，或与标记的靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处靶抗原或抗体结合后，可采用下列方法分析处理数据：理数据： 共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度共聚焦扫描仪：应用最广，重复性好但灵敏度较低。较低。 质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基质谱法：快速、精确，可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针因突变和精确判断突变基因的序列位置。探针合成较复杂。合成较复杂。 化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接化学发光、光导纤维、二极管方阵检测、直接电

20、荷变化检测等。电荷变化检测等。芯片扫读装置芯片扫读装置 根据采用的光电偶合器件，分为光电倍根据采用的光电偶合器件，分为光电倍增管型和增管型和CCDCCD型。型。 根据激光光源，可分为激光型和非激光根据激光光源，可分为激光型和非激光型。型。 应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好描装置，分辨率、灵敏度极高，有良好的定位功能，可定量，应用广泛。的定位功能，可定量，应用广泛。图象分析 复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成。来完成。 分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大分析软件的功能：鉴定每个点阵、最大

21、限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜限度消除本底荧光的干扰、解析多种颜色图象、可标记或排除假阳性、识别和色图象、可标记或排除假阳性、识别和分析对照实验是否成功、可将信号标准分析对照实验是否成功、可将信号标准化等。化等。 图象处理软件必须具备提取基因库和数图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力。据库的能力。质量控制 实验对照：实验对照： 体外转录从体外转录从cDNAcDNA合成合成mRNAmRNA，参入标本中作为对照。参入标本中作为对照。此此mRNAmRNA不与点阵的核酸杂交。不与点阵的核酸杂交。 将不同浓度的不同基因参入标本中，可作为标本将不同浓度的不同基因参入标本中，可作为标本间标准化的

22、参照。间标准化的参照。 用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本，用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本，如果两种荧光强度一致，可排除标本间变异因素。如果两种荧光强度一致，可排除标本间变异因素。 用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂交。交。 结果有效性的证实 在表达矩阵上，有时难于区分极其相似的序列，如在表达矩阵上，有时难于区分极其相似的序列，如基因族成员，亚类或异类的存在。基因族成员，亚类或异类的存在。 比较两种不同比较两种不同DNADNA序列表达水平时，有些参数如核序列表达水平时，有些参数如核苷酸的成分、二级结构的存在和矩阵上苷酸的成分

23、、二级结构的存在和矩阵上DNADNA的长度的长度都会影响杂交。都会影响杂交。 证实矩阵分析的结果可用证实矩阵分析的结果可用RT-PCR(RT-PCR(区别基因族成员区别基因族成员, ,比较不同比较不同DNADNA种系表达种系表达, ,证实基因变异或突变和精确证实基因变异或突变和精确测定测定DNADNA表达水平表达水平) )、Northern Blot(Northern Blot(证实某一基因证实某一基因的相对表达水平的相对表达水平) )、Western Blot(RNAWestern Blot(RNA表达是否达表达是否达到细胞中的蛋白水平到细胞中的蛋白水平) )、质谱仪、质谱仪( (证实矩阵结

24、果是否证实矩阵结果是否在蛋白水平在蛋白水平) )等。等。 基因表达分析：肿瘤基因表达分析：肿瘤 基因突变检测：遗传性疾病基因突变检测：遗传性疾病 测序、基因图绘制和多态性分析：测序测序、基因图绘制和多态性分析：测序 微生物菌种鉴定：毒力基因、抗药基因微生物菌种鉴定：毒力基因、抗药基因 药物研究：新药筛选、指导合理用药药物研究：新药筛选、指导合理用药 克隆选择及文库筛选克隆选择及文库筛选生物芯片技术的发展 发展趋势发展趋势微型化：微型化：DNADNA矩阵越来越小。矩阵越来越小。集成化：矩阵上的基因组越来越大集成化：矩阵上的基因组越来越大。多样化：测定范围越来越广。多样化：测定范围越来越广。微量化

25、：测定所需样本越来越少。微量化：测定所需样本越来越少。全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。全自动化：样品制备到结果显示全部分析过程。定量化：定量化：如激光捕获技术，显微解剖技术等可如激光捕获技术，显微解剖技术等可精确测定一个细胞内的一个基因的表达。精确测定一个细胞内的一个基因的表达。DNADNA矩阵数据信息库的完善。矩阵数据信息库的完善。生物芯片技术的发展生物芯片技术的发展 技术技术毛细管电泳芯片技术毛细管电泳芯片技术PCRPCR芯片技术芯片技术( (PCR-Chip)PCR-Chip)缩微芯片实验室缩微芯片实验室( (lab-on-a-chip)lab-on-a-chip)微珠芯片技术

26、微珠芯片技术( (beadArray)beadArray)抗体和蛋白质阵列技术抗体和蛋白质阵列技术( (Antibody and Antibody and protein-array technology)protein-array technology)自我定制芯片技术（自我定制芯片技术（make your own chip)make your own chip)血气分析芯片血气分析芯片毛细管电泳芯片技术 MathiesMathies最早报道毛细管电泳芯片测序结果，最早报道毛细管电泳芯片测序结果，在在1010分钟内完成了对分钟内完成了对433433个碱基序列的测定。个碱基序列的测定。 宾夕法

27、尼亚大学宾夕法尼亚大学WildingWilding等成功地利用毛细管等成功地利用毛细管电泳芯片分离了用于诊断杜鑫电泳芯片分离了用于诊断杜鑫- -贝克肌萎缩的贝克肌萎缩的多条多条DNADNA片段。片段。 瑞士瑞士Ciba-GeigyCiba-Geigy公司和加拿大公司和加拿大AlbertaAlberta大学合大学合作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸作利用玻璃毛细管电泳芯片完成了对寡核苷酸的分离。的分离。缩微芯片实验室 在一张芯片上完成样品(如血液、组织等)制备、化学反应、检测和数据分析。 1998年程京博士首次应用LOC实现了从样品制备到反应结果显示的全部过程，成果地从混有大肠杆菌的血清中

28、分离出了细菌。 含有加热器、微泵微阀、微流量控制器、电子化学和电子发光探测器的芯片已经问世。也已出现样品制备、化学反应和分析检测部分结合的芯片。 LOC与卫星传输和网络生物信息学结合，将实现高通量、一体化和移动性的“未来型掌上实验室”的构想。抗体和蛋白质阵列技术 蛋白质组学蛋白质组学( (protiomics)protiomics)的兴起，促的兴起，促进了抗体和蛋白质阵列技术的发展。进了抗体和蛋白质阵列技术的发展。Pareick BrownPareick Brown使用特异性抗体微矩阵，使用特异性抗体微矩阵，测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋白质。白质。L

29、eukingLeuking等采用蛋白质微阵列技术，测定等采用蛋白质微阵列技术，测定了了1010pgpg的微量蛋白质，并证实假阳性极低。的微量蛋白质，并证实假阳性极低。乳腺癌基因芯片Stanford 乳腺癌微矩阵(Perou et al.1999) 每种基因的数据以行表示，每个实验用每种基因的数据以行表示，每个实验用列表示。列表示。 颜色强度表示对照和实验颜色强度表示对照和实验cDNAcDNA的比率。的比率。比率相同时为比率相同时为1 1。 结果为红色表示结果为红色表示mRNAmRNA增加，绿色表示减增加，绿色表示减少，灰白色表示缺乏。少，灰白色表示缺乏。 两种基因的相似性用两种基因的相似性用P

30、earsonPearson相关公式或相关公式或EuclidianEuclidian测距公式计算。测距公式计算。DNA微矩阵分析软组织肉瘤表达Kavine Maillard et al(1999) cDNAscDNAs进行进行DNADNA表达矩阵，表达矩阵，PCRPCR产物包产物包被在经赖氨酸处理的玻片上，用被在经赖氨酸处理的玻片上，用Cys3-Cys3-和和Cys5-Cys5-标记的标记的cDNAcDNA进行杂交，进行杂交，洗涤后用洗涤后用Scanarray3000Scanarray3000扫描仪测定扫描仪测定矩阵，表达数据储存在矩阵，表达数据储存在ACeDBACeDB数据库数据库中，根据数据

31、表达类型区分不同的中，根据数据表达类型区分不同的基因。基因。微矩阵分析微矩阵分析DNADNA和蛋白表达和蛋白表达Holger Eickhoff et al.(1999)Holger Eickhoff et al.(1999) 根据已有的序列数据，组合根据已有的序列数据，组合800000800000人类人类ESTEST序序列，已重矩阵了列，已重矩阵了3800038000克隆用于克隆用于RNARNA表达分析，表达分析，克隆经克隆经PCRPCR扩增后共价结合于玻片上，每张玻扩增后共价结合于玻片上，每张玻片固定片固定1920019200个基因片段，标记人组织个基因片段，标记人组织RNAsRNAs与与被

32、选的被选的3800038000人基因片段的矩阵进行杂交，比人基因片段的矩阵进行杂交，比较健康与疾病组织的图象，用软件分析点识别较健康与疾病组织的图象，用软件分析点识别和点定量。和点定量。 使用寡聚核苷酸鉴定新的使用寡聚核苷酸鉴定新的cDNAcDNA克隆，和进入表克隆，和进入表达载体，使相应蛋白能直接表达，矩阵后可分达载体，使相应蛋白能直接表达，矩阵后可分析蛋白析蛋白- -蛋白和蛋白蛋白和蛋白- -DNADNA的关系。的关系。生物芯片相关仪器 点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和点阵仪：制备芯片。点样针分为实心和空心两种，点样方式有非接触喷点和接空心两种，点样方式有非接触喷点和接触点样两种。触点样

33、两种。 杂交仪：全自动完成调节、加探针、漂杂交仪：全自动完成调节、加探针、漂洗和热循环的杂交过程。洗和热循环的杂交过程。 扫描仪：激光共聚焦或扫描仪：激光共聚焦或CCDCCD直接成像分析直接成像分析结果。结果。Q Bot 超高解析基因筛选暨排列分析仪。超高解析基因筛选暨排列分析仪。基因菌落筛选基因菌落筛选( (Colony Picking)Colony Picking)：3500/h3500/h基因排列打点基因排列打点( (Gridding)Gridding)：100000/h100000/h基因复制基因复制( (Replication)Replication)：969696,9696,9638438