复方骨肽原溶液高分子量物质检查方法研究 20140604

1、复方骨肽原溶液高分子量物质检查方法研究常州方圆制药有限公司 芳园QC小组一、 概况（一）产品介绍复方骨肽原溶液为淡黄褐色至黄褐色澄明液体。主要为健康的猪或牛四肢骨与全蝎经提取制成的灭菌水溶液，主要活性成分为多肽。目前，以复方骨肽原溶液为原料制成的制剂临床上主要用于骨折的治疗，以及风湿、类风湿性关节炎等疾病的辅助治疗。（二）QC小组简介1、小组概况芳园QC小组成立于2015年8月，由检测中心人员本着自愿参加的原则组成，自成立以来一直以“提高产品质量控制水平，完善质量管理体系”为宗旨，不断进行有目的、有计划的QC创新活动。表1 小组概况表小组名称芳园QC小组成立时间2015.08课题名称复方骨肽原

2、溶液高分子量物质检查方法研究课题类型创新型注册号小组长王亮小组成员4人活动日期2015.092016.03出勤率100%2、小组成员表表2 小组成员一览表序号姓名文化程度职务职称组内分工1王亮本科仪器组班长助理工程师组长数据整理2郦莎莎大专检验员助理工程师具体实施数据分析3宋晓霞本科检验员助理工程师具体实施数据分析4王薇本科检验员助理工程师具体实施成果发表人3、小组活动计划表3 活动计划表活动内容和阶段9月10月11月12月1月2月选题、培训P提出方案并制定最佳方案制订对策对策实施D效果确认C巩固措施A总结和展望二、选题理由复方骨肽原溶液中的高分子量物质是引起过敏的主要物质，复方骨肽原溶液的生

3、产工艺中，有对其高分子量物质过滤截留装置，为了提高产品的安全性，控制产品中高分子量物质，增加高分子量物质检查项，并根据实际样品的测定情况，暂定供试品中分子量大于10000的组分不得过5.0%。 三、目标设定及可行性分析（一）目标设定建立复方骨肽原溶液高分子量物质检验方法，以达到进一步控制产品质量的目的。（二）可行性分析公司支持：公司多次派检验员参加各类检验知识和仪器操作等方面的培训，多次举办相关会议。技术保障：小组成员具有多年的仪器分析经验，且具有较强的开拓创新意识。小组成员4人中3人本科学历，1人大专学历，专业均为药物分析等相关专业，理论基础扎实。小组成员具有严谨细致的工作态度，优良的团队合

4、作精神，对于疑难问题能集体共谋对策。仪器保障：目标可以实现！具备研究和检测所需的液相色谱仪、超纯水制备仪等。且这些设备均为知名品牌的厂家。四、提出方案并确定最佳方案（一）提出方案1、检测方法的初步确定检验方法确定采用分子排阻色谱法对复方骨肽原溶液中分子按照大小进行分离检测。分子排阻色谱法一般选用亲水硅胶或凝胶为填充剂，这些凝胶表面分布着不同孔径尺寸的孔，样品分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔内，大于所有孔径的分子将不能进去，在色谱柱中保留比较差，最早被流动相洗脱出去，表现为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂，滞留时间较长，表现为保留时间较长，其余的分子按大

5、小依次被洗脱。2、色谱柱选择选择供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂，粒径相对小，pH耐受力符合要求。3、流动相的选择多肽液相色谱通常使用的流动相为含酸性或中性介质的甲醇-水或乙腈-水，或用甲醇与缓冲盐溶液做流动相。在测定多肽时如果出峰效果不理想的话，可以再流动相中加入少量的三氟乙酸可改善出峰效果。4、系统适用性包括理论塔板数、分离度、灵敏度、重复性、拖尾因子等。5、结果计算经色谱分离的多肽分子通常以线性形式分离，以标准物质分子量（M）的对数对应的保留时间（t）制得标准曲线回归方程lgM=a+bt，供试品中大于10000分子量的分布时间即可以计算，以峰面积归一化法对多肽分布情况进行积分，保留时间

6、前段为大于10000分子量多肽分布段，保留时间后段为小于10000分子量多肽分布段，计算出复方骨肽原溶液大于10000分子量组分含量。（二）制订方案小组成员根据本部门目前现有HPLC级试剂的实际情况以及日常检验经验，对小组成员意见整理后制定了下列方案：方案内容综合分析评估结论可行性 (25分)合理性(25分)实施周期 (25分)分)预期效果(25分)分)总分 (100分)仪器选择安捷伦高效液相色谱仪目前有两台，配置齐全，但使用频繁，几乎为其他产品专用。251010550不选岛津高效液相色谱仪目前有一台，配置齐全，但偶尔使用，频次为2月/次。25 25 20 20 90 选择色谱柱选择TSK g

7、el G 2000SW刚性的球型硅胶为基质,在其表面通过共价键合亲水基团而成，孔径125Å，粒径5m，7.8×300mm，耐受流速 0.5-1.0ml/min，分子量 5,000-150,000 ；pH 2.5-7.52020 20 1575不选Zenix SEC-100表面键合亲水薄膜的硅胶，孔径100Å，粒径3m，7.8×300mm，耐受流速 0.5-1.0ml/min，分子量 100-100,000 ；pH 2-8.525252020 90选择 通过总结，决定采用岛津高效液相色谱仪，选用Zenix SEC-100色谱柱进行复方骨肽原溶液高分子量物质

8、检查方法的研究。五、制定对策方案分解对策目标措施地点人员完成日期色谱条件的确定选择酸性或中性介质的甲醇-水或乙腈-水为流动相，考虑添加三氟乙酸适量各标准物质能较好分离，核糖核酸酶A理论塔板数应大于5000查阅资料选取最佳色谱条件液相室王亮2015.10.15系统适用性试验设计适用性试验溶液进行测试各标准物质均完全分离，分离度应大于1.5配制适用性试验溶液进行测试液相室王亮2015.10.20线性确定选择对照溶液进样以标准物质分子量（M）的对数对应的保留时间（t）制得标准曲线回归方程，相关系数大于0.99配制1份对照溶液，进样，以峰面积和浓度作标准曲线，计算相关系数液相室王亮2013.11.30

9、重复性试验选择对照溶液进样各标准物质保留时间RSD2.0%配制含四种不同高分子量的标准物质混合液进样，计算各标准物质保留时间RSD液相室王亮郦莎莎2013.12.20中间精密度试验不同时间、不同人员测试RSD10%2名检验员、2台气相色谱仪对同一批样品进行乙醇、乙酸乙酯残留量的检测液相室王亮郦莎莎2014.01.10六、对策措施对策一、确定色谱条件1、色谱条件色谱柱：DB-5， 30m×0.32mm×0.5m气体流速：氮气1.0ml/min（恒流模式）；氢气30ml/min；空气300ml/min；尾吹气为氮气30ml/min柱温：50（保持3min）10/min8015/

10、min250（5min）进样口温度：150检测器温度：260分流比：1:1顶空条件： 顶空瓶温度80；定量环温度95；传输线温度110；进样瓶平衡时间25min；振摇off；增压0.4min；定量环填充时间0.20min；定量环平衡时间0.10min；进样时间1.00min；GC总循环时间35min。2、仪器梅特勒-托利多 AG285 分析天平、Agilent7890A系统，7694E顶空进样器3、溶液配制(1) 稀释液：甲苯:二甲亚砜 = 2:1(2) 对照贮备液： 精密称取乙醇、乙酸乙酯各0.1g，加入100ml容量瓶（瓶内预先加入约30ml稀释液）中，用稀释液定容至刻度，摇匀。 精密移取

11、溶液 10ml，置50ml容量瓶中，用稀释液定容至刻度，摇匀即得对照贮备液。(3)供试品溶液：精密称取地氯雷他定供试品0.12g，置20ml顶空瓶中，精密加入3ml稀释液，密封，溶解并摇匀。平行配制两份。(4) 系统适用性溶液：精密移取对照贮备液3ml，置20ml顶空进样瓶中密封，平行配制5份。按照上述色谱条件，取系统适用性溶液进样，结果如下表：进样次数12345峰面积RSD乙醇峰面积83.1484.7881.3979.4985.283.0%乙酸乙酯126.57128.48126.28123.75129.081.7%从上表看出，乙醇、乙酸乙酯峰面积的RSD均小于10%，达到了预期目标。对策二：

12、专属性试验定位溶液：用毛细管取乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲亚砜各适量，分别置20ml顶空瓶中，密封备用。专属性试验溶液：精密移取稀释液、对照液各3ml，置20ml顶空瓶中密封。按照测定条件分别用各定位溶液、稀释液、对照液进样，得到如下图谱： 从上面各图看出，各峰峰型对称，乙醇、乙酸乙酯的分离度达到了22.91，远远大于1.5，并与甲苯、二甲亚砜完全分离，达到了预期目标。对策三：线性及范围的确定精密称取乙醇0.1050g、乙酸乙酯0.1009g，加入同一100ml容量瓶（瓶内预先加入约30ml稀释液）中，用稀释液定容至刻度，摇匀，得线性试验贮备液。按照下表的顺序精密移取相应量的线性试验贮备液于相应

13、的容量瓶中，用稀释液定容至刻度，再精密移取这些溶液3ml于20ml顶空瓶中，密闭，摇匀，得线性试验系列溶液。浓度水平(%)浓度(g/ml)线性试验贮备液(ml)容量瓶(ml)份数乙醇乙酸乙酯140294.00282.527253120252.00242.166253100210.00201.801050380168.00161.44850360126.00121.0865034084.0080.7245032042.0040.3625031021.0020.181503510.5010.090.5503用上述溶液进样，每个浓度进样三针，结果见下表：表4 乙醇检验结果记录浓度水平乙醇浓度峰面积平

14、均峰面积信噪比5%10.501.910%21.009.329.323.720%42.0019.2919.4418.9719.239.240%84.0038.1436.8037.6337.5260%126.0057.3957.2055.8556.8180%168.0079.4074.4972.6175.50100%210.0091.4091.1291.0588.61120%252.00108.63104.34109.84107.60140%294.00118.22127.64129.78125.21表5 乙酸乙酯检验结果记录浓度水平乙酸乙酯浓度峰面积平均峰面积信噪比5%10.092.110%20

15、.1811.8211.824.220%40.3624.1224.4323.9824.1810.240%80.7248.2547.3348.1647.9160%121.0873.2172.8371.9872.6780%161.4499.4996.7495.1597.13100%201.80119.64119.40119.92117.77120%242.16144.44140.65144.66143.25140%282.52166.82172.89173.76171.16以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到回归方程和线性图如下：从上述图谱看出，乙醇在42.00g/ml294.00g/ml范围内，相

16、关系数为0.9992，乙酸乙酯在40.36g/ml282.52g/ml范围内，相关系数为0.9995，均大于0.99，达到了预期目标。对策四、检测限的确定对线性试验项下的图表进行结果分析，将S/N =2时对应的浓度确定为检测限，结果如下表：名称S/N峰面积浓度乙醇1.94.5977110.50g/ml乙酸乙酯2.15.6050510.09g/ml从上表看出，乙醇的检测限为10.50g/ml，乙酸乙酯的检测限为10.09g/ml。对策五、回收率试验配制80%、100%、120% 3个浓度水平的乙醇、乙酸乙酯对照溶液，加入已知乙醇、乙酸乙酯浓度的地氯雷他定样品（20130801）中，每个浓度3份，

17、进样测定，计算回收率，结果见下表：浓度水平样品乙醇残留(%)检出乙醇含量(%)扣除样品乙醇后的含量(%)理论含量(%)回收率(%)80%00.38160.38160.389497.990.42030.42030.3923107.150.39960.39960.3859103.54100%0.50850.50850.4903103.700.49010.49010.4891100.200.52910.52910.5001105.79120%0.57110.57110.587697.190.59610.59610.5874101.480.61540.61540.5942 103.56浓度水平样品乙酸

18、乙酯残留(%)检出乙酸乙酯含量(%)扣除样品乙酸乙酯后的含量(%)理论含量(%)回收率(%)80%0.12460.50790.38340.392997.570.53380.40920.3958103.390.52070.39610.3894101.71100%0.62340.49880.4947100.820.61860.49410.4936100.110.64590.52140.5047103.31120%0.70780.58330.592398.480.72280.59820.5927100.930.73900.61500.5996102.57从上表看出，乙醇、乙酸乙酯的回收率均在80%1

19、20%间，达到了预期目标。对策六、重复性试验平行配制100%浓度水平的对照液6份，进样，计算峰面积的RSD。结果见下表：序号乙醇峰面积乙酸乙酯乙醇RSD乙酸乙酯RSD191.40119.645.6%4.1%291.12119.40391.05119.92488.97118.73578.81108.16690.33120.75 从上表看出，乙醇峰面积的RSD为5.6%，乙酸乙酯峰面积的RSD为4.1%，均小于10%，达到了预期目标。对策七、中间精密度试验在不同时间由2名检验员，分别在2台气相色谱仪(7890A、6890N)上，对同一批地氯雷他定（20130801）进行检验，每次试验均配制6份供试

20、品溶液，计算乙醇、乙酸乙酯的含量，结果见下表：表6 同一检验员、不同仪器的检验结果样品名称色谱仪型号乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同仪器RSD(%)乙醇7890A00000006890N0000000乙酸乙酯7890A0.12990.12380.12900.12490.11800.13080.12610.56890N0.12650.12710.13220.12350.12000.12260.1253表7 同一检验员、同一仪器、不同时间的检验结果样品名称时间乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同时间RSD(%)乙醇2014.1.500000002014.1.90000000乙酸乙酯

21、2014.1.50.12900.12450.12550.12650.11950.13010.12650.42014.1.90.12550.12800.13200.12600.12050.12300.1258表8 同一仪器、不同检验员的检验结果样品名称检验员乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同人员RSD(%)乙醇王亮0000000郦莎莎0000000乙酸乙酯王亮0.12850.12550.12650.12400.12000.13000.12580.7郦莎莎0.12580.12600.12600.12800.12900.12650.1269从上表看出，乙醇均未检出；乙酸乙酯的检验结果，同一检验员、不同仪器的RSD为0.5%，同一检验员、同一仪器、不同时间的RSD为0.4%，同一仪器、不同检验员的RSD为0.7% ，均远小于10%，达到了预期目标。对策八、耐用性试验通过改变流速、进样口温度、检测器温度，用对照液进样，观察出峰情况，结果如下：流速(ml/min)进样口温度()检测器温度()乙醇、乙酸乙酯分离度乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲亚砜分离情况11.015026021.16完全分离21.215026022.81完全分离30.81