酵母细胞的收集

1、酵母细胞的收集酵母细胞的收集目标：从酿酒酵母培养液中收集酵母细胞。原理：酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。本法先采用离心法收集新鲜酵母细胞，再采用菌体自溶方法来破碎细胞壁，使细胞内的蔗糖酶释放出来。操作方法：酵母细胞的收集在50ml塑料离心管中装入45ml新鲜酿酒酵母发酵液，3000转/分钟离心10分钟，小心移除上清液。再往离心管中加30ml无菌生理盐水，震荡离心管。使酵母细胞沉淀重新悬浮与液体中，3000转/分钟离心10分钟，小心移除上清液，得到新鲜的酿酒酵母细胞沉淀。实验结果：酵母细胞沉淀结果为：0.94g注意点：使用离心机时注意平衡问题，使用离心管前应先

2、称量空离心管质量。结果分析：酵母菌达不到25g，没达到要求。酵母细胞的自溶酵母细胞的自溶目标：从酿酒酵母液中收集酵母细胞，并使之自溶。原理：酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。本法先采用离心法收集新鲜酵母细胞，再采用菌体自溶方法来破碎细胞壁，使细胞内的蔗糖酶释放出来。操作方法：酵母自溶在收集有25g酵母细胞沉淀的500ml三角瓶中加入醋酸钠1.6g，搅拌1520分钟，使团块的鲜酵母液化，加1.5甲苯，用保鲜膜密封瓶口，摇动10分钟使甲苯和酵母液充分混匀，加入37培养箱中保温60小时，使酵母自溶。实验结果：细胞自溶：破碎细胞壁细胞自溶结果为：35.9g酵母蔗糖酶粗

3、液的制备酵母蔗糖酶粗液的制备目标从酿酒酵母细胞破碎液中制得蔗糖酶被提液A原理酿酒酵母细胞破碎后，经过细胞碎片分离提取蔗糖酶液，再经热提取和乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯操作方法在培养物中取出装有已自溶酵母的三角瓶，加30ml蒸馏水，摇匀，倒入50ml塑料离心管，10000转/分钟20min,经离心后，离心管中的悬浮液分3层，上层为浆状的固体，下层为固体，中间层为液体，小心仔细取出中间层液体，重新倒入离心管中10000转/分钟离心20min,仔细取出上清液并用量筒测出体积记为VA，取出3ml保存（做好标记），用等以后的活力和蛋白质含量的测定，所提取的液体为初提取液A实验结果：蔗糖酶初体液A

4、为11.2ml 注意事项：要注意离心管的重要配平蔗糖酶的提取及初提纯蔗糖酶的提取及初提纯目标从酿酒酵母细胞破碎液中制得蔗糖酶初提液A、热提取液B和乙醇沉淀提取液C。原理酿酒酵母细胞破碎后，经过细胞碎片分离提取蔗糖酶液，再经热提取和乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。操作方法操作方法热提取液热提取液B 将初提液将初提液A倒入倒入50ml三角瓶中，加三角瓶中，加3.2ml 4N醋酸，使溶液的醋酸，使溶液的pH值约为值约为4.5左右，摇匀，迅速在水浴中加热至左右，摇匀，迅速在水浴中加热至50，保温，保温30分钟分钟（注意温度绝对不能超过（注意温度绝对不能超过50），在保温的过程中不断摇动三角瓶，）

5、，在保温的过程中不断摇动三角瓶，取出后迅速在冰浴中冷却，冷却液在离心机中取出后迅速在冰浴中冷却，冷却液在离心机中10000 rpm离心离心15分分钟，仔细地取出上清液并用量筒测出体积记为钟，仔细地取出上清液并用量筒测出体积记为VB，此提取液为热，此提取液为热提取液提取液B，取出，取出3毫升保存（做好标记），用于以后的活力和蛋白毫升保存（做好标记），用于以后的活力和蛋白质含量的测定。质含量的测定。乙醇沉淀提取液乙醇沉淀提取液C 将热提取液将热提取液B倒入倒入100毫升烧杯中，把烧杯放入冰浴中毫升烧杯中，把烧杯放入冰浴中，轻轻轻轻搅拌并慢慢加入（搅拌并慢慢加入（-20）95%乙醇溶液，体积与热提取

6、液乙醇溶液，体积与热提取液B相同。相同。整个过程不少于整个过程不少于30min，再继续搅拌，再继续搅拌10min，将烧杯内的液体全部，将烧杯内的液体全部移入离心管中（白色固体保留待用），移入离心管中（白色固体保留待用），15000 rpm离心离心10min。离。离心后，仔细地倒掉上层清液，用心后，仔细地倒掉上层清液，用5ml 0.05M Tris-HCl（pH7.3）缓）缓冲液把烧杯中的白色粘状固体溶解，倒入离心管搅拌使离心管内的冲液把烧杯中的白色粘状固体溶解，倒入离心管搅拌使离心管内的白色固体溶解，白色固体溶解，15000rpm离心离心10min，取上层清液即为乙醇沉淀，取上层清液即为乙醇沉

7、淀提取液提取液C，测量其体积记为，测量其体积记为VC，取出，取出3ml保存（做好标记），用于保存（做好标记），用于以后的活力和蛋白质含量的测定。以后的活力和蛋白质含量的测定。实验结果蔗糖酶纯化的热提取B为9ml，乙醇提取液C为5.4ml，第二次离心为16.4ml蔗糖酶的纯化蔗糖酶的纯化Q Sepharose-柱柱层析法层析法目标采用离子交换层析法，从乙醇沉淀提取液C中进一步纯化得到蔗糖酶的柱层析分离组分。原理本法所用的Q Sepharose凝胶是以琼脂糖作为不溶性母体引入季铵型集团，为强阴离子交换剂。Q Sepharose凝胶交换介质载量高，分辨率高，能承受较高的流速，化学稳定性好。在pH7左

8、右时，Q Sepharose凝胶带正电，而一般蛋白质在此pH值范围带负电，两者可结合，降低pH或提高离子强度均可使之洗脱下来，当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，达到分离的目的。操作方法1、离子交换柱的填充 取1支内径1cm、高30cm的层析柱垂直固定，下端的橡皮管用夹子夹紧，先在柱子内加入5mL蒸馏水。将已经处理好的Q Sepharose凝胶调成悬浮状，一次性完全加入层析柱内，使Q Sepharose凝胶缓慢均匀地下降至柱的下部，得交换柱高约为10cm，用小玻棒轻轻搅动交换剂的最上端使之有一个平的表面。注意在整个柱操作过程中防止液面低于交换剂的表面，当液面低于交换剂表面时空气将进入交换剂内，在

9、交换剂内形成气泡，影响分离效果。放松柱下端的夹子，使流动相流动，至与交换剂表面相距23cm处，夹紧夹子，防止流动相继续流出，此时完成交换柱的填充任务。2、柱的平衡 将柱子与恒流泵相连，放松夹子，打开恒流泵，用大于5个柱体积（CV）的0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗。3、加样 将缓冲液放至刚好与交换剂表面相切，夹紧柱下端的夹子，取0.5 mL乙醇提取液C缓慢地加到交换柱上（加样不可太快，以免搅浑交换剂表面），放松柱下端的夹子，使样品刚好全部进入交换剂内部，夹紧夹子，再加3 mL缓冲液。加样以后的流出液都要进行收集，每管收集3 mL。4、洗脱 将柱子与恒流泵相连，放松

10、夹子，用恒流泵控制流速为3 mL/min，每管收集3 mL，先用0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液25 mL洗穿透峰，接着连接梯度发生器，进行线性梯度洗脱，直到梯度发生器内的缓冲液全部用完为止，再用0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液配制的1 mol/L NaCl溶液25 mL洗脱。5、离子交换柱的再生 用0.5 mol/L NaOH洗3CV，再用水洗5CV。6、测吸光度 在紫外分光光度计上测出每管在280 nm处的紫外吸光度OD值，画出管数与吸光度OD值的关系曲线。实验结果蔗糖酶的活力的测定蔗糖酶的活力的测定目标测定初提取液A、热提取液B、乙醇沉淀提取液

11、C和柱分离液D中的蔗糖酶活力，了解各阶段的纯化情况。原理酶的活力大小通常是以该酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解，经一定时间后，以反应物中底物的减少或产物形成的量来表示的。其原理为，在过量的碱性溶液中，DNS与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物,该化合物在540nm波长处有最大吸收，在一定的波长范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中还原糖的量操作方法1.葡萄糖标准曲线的制作取6支试管，分别按表1加入各种试剂。将各试管内的液体混合均匀，在沸水中加热5分钟。取出后立即用冷水冷却至室温，于540nm波长处测OD值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准

12、曲线。01234500.751.001.251.501.75蒸馏水3.002.252.001.751.501.253,5-二硝基水杨酸1.501.501.501.501.501.50总体积4.504.504.504.50试管号4.50葡萄糖标准液2.酶活力的测定（1）将以往实验得到的四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：200）;热提取液B（1：200）；乙醇沉淀提取液C（1:200）；柱分离液D（1:20）。（2）取8支试管，按表2加入各种试剂。3、从每管中取出0.5毫升反应液（V测）进行还原糖的测定，方法和1所述相同，如果测得的OD值不在标准曲线范围内，则可增加或减少取样量，直

13、到OD值在标准曲线范围内为止。计算4.5毫升溶液中所含还原糖的量（以葡萄糖计算）用表格记录下来。4、计算出酶的活力单位数蔗糖酶的活力单位定义为：在一定条件下（PH为4.6、温度为35）在3分钟内能水解蔗糖成还原糖1毫克所需的酶量，成为1个活力单位。总活力单位数=式中，mg为V测体积测出的葡萄糖的毫克数；n为酶液稀释倍数；V总为各种提取液在提取过程中得到的总体积。酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提液A的总酶活）100%实验结果经计算mg=5.999总活力单位数=5.999/2*4.5/2*3*20 =404.9325蛋白质含量测定及比活力计算蛋白质含量测定及比活力计算目标测定初提液A、热提取液

14、B、乙醇沉淀提取液C和柱分离液D中的总蛋白含量，计算比活力，了解各阶段蔗糖酶的纯化倍数 。原理本法（Folin-Loury）中所用的Folin-酚试剂中的主要成分磷钼酸、磷钨酸，可被蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸还原生成蓝色化合物磷钼蓝和磷钨蓝，蛋白质浓度增高，产物颜色加深，这一蓝色溶液在750nm和660nm有较强的光吸收能力，故可用比色法测定已知浓度的标准蛋白质溶液的OD值，然后据此测出未知样品的蛋白浓度。 本法极为灵敏，样品中蛋白含量少至5微克即可迅速方便的测知。缺点是蛋白浓度和光密度线性关系不够严格，而且不同的蛋白质因酪氨酸和色氨酸含量不同，显色程度也有差异，然而，这方法对蛋白质含量的一

15、系列变化，如蛋白质提纯过程的分析颇为有用。操作方法1、标准曲线的绘制 取6支试管，从05编号，按表1分别加入各试剂。试剂A加毕混匀后，静置10min，再向各管加试剂B 0.3mL后放置10min，再加第二次试剂B 0.2mL，每加一次均应立即迅速充分混合（加一管摇一管）。全部加毕后，放置55恒温器内保温5min或室温放置30min。 试剂量试剂量/mL所加试剂所加试剂管号管号012345标准牛血清白蛋白液标准牛血清白蛋白液/mL00.20.40.60.81.0H2O/mL4.54.34.13.93.73.5试剂试剂A/mL1.01.01.01.01.01.0试剂试剂B/mL第一次第一次0.30.30.30.30.30.3第二次第二次0.20.20.20.20.20.2总体积总体积/mL6.06.06.06.06.06.0取出试管至冷水中冷却1min。以空白0号为对照，在660nm处测得各管OD值，以牛血清白蛋白微克数为横坐标，OD660为纵坐标，画出标准曲线。2、未知蛋白浓度的测定 将以往实验得到